全 文 ：物成分的不同设立 5 组，每一种药物分为 4 个浓度梯
度，每个浓度设以 10 倍的差值。通过 MTT 法检测淋
巴细胞增殖及酶联免疫吸附检测淋巴细胞培养液中
sIL － 2R的浓度，从而反映出受试药物对淋巴细胞增
殖的影响。体外实验的结果表明，苏木精组、成分 B、
成分 C、成分 D、成分 E随药物浓度的增加对刀豆 A诱
导的 T淋巴细胞增殖有明显的影响(P ＜ 0． 01) ，其对
T淋巴细胞增殖呈现抑制增强;其中成分 B、D、E 与刀
豆 A单纯刺激组(1． 89 ± 0． 09)比较，sIL － 2R 浓度呈
现不同程度的降低，苏木精 10mg 组及 100mg 组较刀
豆 A单纯刺激组 sIL － 2R浓度降低。
对于中药化学成分的研究，阐明其有效成分及作
用机理非常重要，以便更好地掌握药效，并能指导临床
合理用药，从而提高中药的疗效，为开发新药物，发现
新用途，开辟新的领域具有非常重要的意义。苏木对
机体免疫反应的抑制作用已被一些实验所证实，其发
挥免疫抑制作用的有效成分及药理学机制具有很大的
研究空间。目前苏木中的化学成分构效关系尚不明
了，对苏木的免疫抑制成分进一步研究需要不断提高
药物提取分离技术及进行大量的免疫药理学实验，为
确定苏木的有效活性成分打下科学的理论基础。对中
药苏木的活性成分进行分离纯化提取，但未进行进一
步的结构鉴定，这也是实验的进一步要求。由于苏木
的成分繁多，作用广泛，因此还需要大量的实验来证
实［9］。下一步将根据本次实验的经验及数据，从分子
水平进一步探讨所提取的苏木精各种有效成分对 T
淋巴细胞增殖的影响。
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31．
RAPD法构建板蓝根和大青叶基因组
DNA指纹图谱
杨欣，于英君
(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:采用 RAPD法研究和分析不同地区板蓝根和大青叶的遗传差异性。方法:利用随机扩增
多态性 DNA( RAPD) 技术，对 3 个不同地区人工栽培的板蓝根和大青叶的基因组 DNA进行了遗传差异
性分析。结果:获得的指纹图谱显示，供试材料之间有共同位点和特征位点，揭示了板蓝根和大青叶资
源丰富的遗传多样性。结论: RAPD技术为培植优质板蓝根和大青叶新品种提供了理论依据和现实意
义，该技术可用于板蓝根和大青叶种质资源的分类、真伪鉴定等。
关键词:板蓝根; 大青叶; RAPD;聚类分析;遗传差异性
中图分类号:R28 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2406(2013)02 － 0095 － 04
作者简介:杨欣(1987 －) ，女，黑龙江中医药大学 2010 级中西医结合基
础专业硕士研究生，主要从事分子生物学研究。
通讯作者:于英君(1953 －) ，男，教授，博士研究生导师，主要研究中药
有效成分抗肿瘤作用及延缓衰老作用。
收稿日期:2012 － 06 － 15
修回日期:2012 － 07 － 02
随着分子生物学的快速发展，植物基因组 DNA的
提取方法越来越多，DNA提取时可以根据不同实验材
料来选择合适的提取方法。板蓝根中含多糖、蛋白质、
多酚和其它不易去除的杂质，在众多的提取方法中，能
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找到最适合基因组 DNA提取方法是比较困难的，同时
也影响了 PCR反应等后续的工作，所以从板蓝根中提
取高质量的 DNA显得十分困难和重要。
RAPD技术(random amplified polymophicDNA) ，
是 20 世纪 90 年代发展起来的分子标记技术，RAPD
技术有许多优点，能准确的证明供试材料间 DNA的特
征性和差异性。具有操作简便、灵敏性高、省时省力、
不易受环境因素的影响等优点，目前该技术被广泛应
用到中药材中，也为中药现代化的快速发展提供理论
依据和现实意义。
1 实验材料与方法
1． 1 实验材料
供试材料为板蓝根和大青叶，均采自黑龙江哈尔
滨，黑龙江大庆和河北赵县，经黑龙江中医药大学王振
月教授鉴定，材料用硅胶干燥室温保存。详见表 1。
表 1 供试材料
药品名及编号 产地 来源 拉丁学名
1 板蓝根 黑龙江哈尔滨 栽培品种 isatis root
2 大青叶 黑龙江哈尔滨 栽培品种 dyers woad leaf
3 板蓝根 黑龙江大庆 栽培品种 isatis root
4 大青叶 黑龙江大庆 栽培品种 dyers woad leaf
5 板蓝根 河北省赵县 栽培品种 isatis root
6 大青叶 河北省赵县 栽培品种 dyers woad leaf
1． 2 方法
1． 2． 1 PlantGen DNA Kit《Cat． No． CW0553》操作步骤
详见康为世纪公司产品说明书。
1． 2． 2 DNA的浓度及纯度检测
紫外分光光度仪开机预热 20min。取出试剂盒法
提取的 DNA，进行解冻。用蒸馏水洗涤石英比色皿，
然后用吸水纸吸干，加入 TAE 缓冲液 3mL 后，放入样
品室的池架上，按下 ZERO 键调零，进行紫外空白对
照。取待测样品 300μL，用蒸馏水稀释 10 倍，加入到
石英比色皿中，放入待测室的池架上，测定 260nm、
280nm 波长时的 OD 值，并计算出 DNA 的浓度及
OD260 /OD280 的比值。
1． 2． 3 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性
0． 8%琼脂糖凝胶:取 0． 8g 琼脂糖溶于 100mL 1
× TAE缓冲液，加热至完全溶解，将胶槽洗净，垂直插
好梳子，水平放在操作台上，等待琼脂糖凝胶液冷却到
50℃ ～60℃时加入 5μL 溴化乙锭，摇匀后慢慢倒入电
泳槽，防止出现气泡。将电泳槽放置 20 ～ 30min，待胶
液完全凝固后轻轻的拔下梳子，将其放入电泳槽中，向
电泳槽中加入 1 × TAE，刚好高于胶面 1 ～ 2mm，插上
电源，打开 DYY － 11 型电泳仪，预热 20min，让缓冲液
充分混合。琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液:取 DNA5μL
和 1μL Gel － Dye Super Buffer Mix混合，混合均匀后直
接上样电泳，直接取 1kb DNA marker 5μL 上样电泳，
估计片段大小，将电压调到 100V，电泳 40 ～ 50min，当
Gel － Dye Super Buffer 移到距凝胶前沿约 2cm 处，停
止电泳。观察拍照，检测 DNA的完整性。
1． 2． 4 随机扩增引物的筛选
从 40 个 RAPD随机引物中，用比较多的样品进行
初步的筛选，从中选取电泳条带比较清晰、反应相对比
较稳定的随机引物，用于 PCR扩增和群体遗传变异的
分析。
1． 2． 5 RAPD 随机扩增反应 RAPD 反应体系见
表 2。
表 2 RAPD反应体系
成分 25μL反应体系 50μL反应体系
RAPD引物 1μL 2μL
DNTPs 0． 5μL 1μL
Taq酶 0． 5μL 1μL
10 × PCR buffer 2． 5μL 5μL
模板 1μL 2μL
ddH2O 19． 5μL 39μL
扩增条件:第一步:94℃预变性 3min;第二步:
94℃变性 30s，36℃退火 30s，72℃延伸 80s;第三步:由
第二步循环 42 个;第四步:72℃延伸 10min;最后 4℃
保存以备电泳。
1． 2． 6 扩增产物的凝胶电泳分析
扩增产物进行电泳检测，取 2 ～ 5μL 反应液，于
1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照。
1． 2． 7 统计学处理
遗传距离的计算，选择重现性好且稳定的扩增谱
带，根据计算机分析的要求，将 RAPD分析结果转换为
数字形式，每条 DNA 谱带作为一个单位，无带的赋值
为 0，有带的赋值为 1，以 1、0 矩阵输入计算机，计算出
供试材料之间的遗传距离 D。样品间 D 值越小，表示
其亲缘关系越近;D值越大，表示其亲缘关系越远。
1． 2． 8 聚类分析
利用 NTSYS 软件进行各品种间 UPGMA 聚类分
析，通过各样本间的遗传相似系数 F，计算出遗传距离
D =1 － F，构建聚类树型图。
2 实验结果与分析
2． 1 基因组 DNA提取的纯度和浓度
试剂盒法提取板蓝根和大青叶基因组 DNA，用
UV －1700 紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，一般
来说，所提取的理想的 DNA 的 OD260 /OD280 比值在
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1． 8 ～ 2． 0 之间。因而，该实验提取的 DNA 纯度高，完
全能满足 RAPD分析的要求。见表 3。
表 3 试剂盒法提取基因组 DNA浓度和纯度
样本 OD260 OD280 OD260 /OD280 Conc(μg /mL)
板蓝根(哈) 0． 310 0． 170 1． 824 151． 750
大青叶(哈) 0． 297 0． 164 1． 812 145． 250
板蓝根(大) 0． 301 0． 166 1． 813 147． 250
大青叶(大) 0． 303 0． 167 1． 816 148． 083
板蓝根(河) 0． 261 0． 141 1． 851 127． 250
大青叶(河) 0． 242 0． 133 1． 820 117． 750
2． 2 DNA的完整性
试剂盒法提取的 DNA条带相对比较清晰，都没有
拖尾现象，DNA 没有降解，质量很高，DL 1500 DNA
Marker购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司检
测。(参 照 片 段:15 000bp，10 000bp，7 500bp，
5 000bp，2 500bp，1 000bp，250bp)。根据标准 DNA
marker，知道板蓝根 DNA片段大约为 15 000bp。结果
见图 1。
图 1 板蓝根基因组 DNA琼脂糖电泳
注:M为标准 DNA marker;1．板蓝根(哈) ;2．大青叶(哈) ;3．板蓝根(大) ;4．大青叶(大) ;5．板蓝根(河) ;6．大青叶(河)。
2． 3 引物序列 经过两次引物筛选，选出扩增稳定、
条带清晰、能体现遗传差异的有效引物，见表 4。
表 4 实验筛选出来的引物序列
编号 引物序列 编号 引物序列
18 caacgcgacc 19 ccaggtcagg
20 caaatcgtcg 21 aggacgcaag
22 gtggtctcag
2． 4 供试材料基因组 DNA指纹图谱
采用 1． 5%琼脂糖凝胶电泳，DL 2000 DNA Marker
购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(参照片
段:2 000bp，10 000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
结果如图 2 ～ 6。
图 2 引物 18 扩增的 DNA指纹图谱
采用 5 种引物 18，19，20，21，22 对 6 种供试材料
基因组 DNA 进行 RAPD 随机引物扩增，获得清晰的
图 3 引物 19 扩增的 DNA指纹图谱
图 4 引物 20 扩增的 DNA指纹图谱
DNA指纹图谱显示供实验材料之间有共同位点和特
征位点。
2． 5 供试材料的遗传相似性系数、遗传距离 结果见
表 6、表 7。
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图 5 引物 21 扩增的 DNA指纹图谱
图 6 引物 22 扩增的 DNA指纹图谱
注:图 2 ～ 6 中，M:DNA marker;1．板蓝根(黑) ;2．大青叶(黑) ;
3．板蓝根(大) ;4．大青叶(大) ;5．板蓝根(河) ;6．大青叶(河)。
表 6 任意两个供试材料的遗传相似性系数 F
编号 1 2 3 4 5 6
1 1． 0000000
2 0． 8717949 1． 0000000
3 0． 8461538 0． 8205128 1． 0000000
4 0． 7692308 0． 7948718 0． 7692308 1． 0000000
5 0． 6923077 0． 7692308 0． 6410256 0． 6153846 1． 0000000
6 0． 6666667 0． 6410256 0． 6153846 0． 6410256 0． 7692308 1． 0000000
注:1．板蓝根(哈) ;2．大青叶(哈) ;3．板蓝根(大) ;4．大青叶(大) ;
5．板蓝根(河) ;6．大青叶(河)。
表 7 任意两个供试材料的遗传距离 D =1 － F
编号 1 2 3 4 5 6
1 0
2 0． 1282051 0
3 0． 1538462 0． 1794872 0
4 0． 2307692 0． 2051282 0． 2307692 0
5 0． 3076923 0． 2307692 0． 3589704 0． 3846154 0
6 0． 3333333 0． 3589704 0． 3846154 0． 3589704 0． 2307692 0
注:1．板蓝根(黑) ;2．大青叶(黑) ;3．板蓝根(大) ;4．大青叶(大) ;
5．板蓝根(河) ;6．大青叶(河)。
2． 6 供试材料的聚类分析 结果见图 7。
图 7 供试材料遗传距离聚类分析
注:C1．板蓝根(黑) ;C2．大青叶(黑) ;C3．板蓝根(大) ;C4．大青
叶(大) ;V5．板蓝根(河) ;V6．大青叶(河)。
3 讨论
3． 1 采用 RAPD技术对三个不同地区的药用植物进
行分子水平的鉴定，获得清晰可靠的 DNA 指纹图谱。
指纹图谱显示，供试材料之间有共同的位点，又有特征
性位点，实验结果证明了 RAPD 标记技术能构建板蓝
根基因组 DNA指纹图谱，能够准确将 6 种药用植物完
全区分。
3． 2 实验通过 RAPD技术对板蓝根基因组 DNA进行
研究和分析，进一步说明了 RAPD方法操作简便、实验
结果可靠、准确。充分证明了 RAPD 技术的优点。
RAPD技术对品种鉴定，尤其是目前鉴于中药材品种
混乱，品种真伪等方面具有优势。在本次研究基础上，
RAPD技术应用到其它中药材是非常可靠地，为中药
现代化快速发展提供理论依据和现实意义［6］。
3． 3 样品采于哈尔滨，大庆，河北三个不同地区，由于
不同地域土壤酸碱度对植物种植和生长及土壤肥力都
有一定的影响，中国北方较多地方土壤 pH 值较大，南
方大部分土壤 pH 值较小，因此不同地区的板蓝根和
大青叶具有一定的差异性，为今后种植和土壤酸碱度
相适应的作物和植物提供理论依据。
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