全 文 ：钝顶螺旋藻藻蓝蛋白诱导 HeLa细胞凋亡的分子机制研究
李　冰 1 ,褚现明2 , 高美华 1 ,张学成 3
(1.青岛大学医学院生物学教研室 , 山东 青岛　266012;
2.青岛大学医学院附属医院心内科 ,山东 青岛　266000;3.中国海洋大学海洋生命学院 ,山东 青岛　266003)
收稿日期:2009 -03-23,修回日期:2009-04-13
基金项目:山东省中青年科学家科研奖励基金资助项目(No
2007BS03016)
作者简介:李　冰(1980 -),女 , 博士生 , 副教授 , 研究方向:藻蓝蛋
白抗肿瘤机制 , E-mail:libing 516@yahoo.com.cn;
高美华(1953-),女 , 教授 ,博士生导师 , 研究方向:分子
免疫学 , E-mail:meihuagao@yahoo.com.cn
中国图书分类号:R284.1;R329.24;R329.25;R737.330.22;
R977.6
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009)08-1045-06
摘要:目的　探讨钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)藻蓝蛋白
(C-phycocyanin, CPC)对体外人宫颈癌细胞(HeLa细胞)凋
亡的影响及分子机制。方法 首先通过 MTT法检测藻蓝蛋
白对 HeLa细胞增殖的影响 , 然后通过电镜观察藻蓝蛋白处
理后的细胞的凋亡形态 , 琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的
DNA结构变化 , 流式细胞仪显示不同浓度藻蓝蛋白对 HeLa
细胞的细胞周期变化的影响 , 免疫组化法检测藻蓝蛋白对细
胞表面凋亡相关基因表达的影响 , 检测凋亡相关的 caspase
的活性及细胞色素 C的释放 ,以揭示藻蓝蛋白诱导 HeLa细
胞凋亡的作用机制。 结果　与未用藻蓝蛋白作用的对照组
相比 , 藻蓝蛋白组的 HeLa细胞存活率明显降低 , 并存在浓度
剂量效应。藻蓝蛋白处理后的细胞呈现典型的凋亡形态 , 如
细胞皱缩 、细胞膜微绒毛消失 、起泡 , 染色体密集 , 形成凋亡
小体。凋亡细胞的 DNA出现断裂 , 呈梯状的电泳带(DNA
ladder),分子量为 180 ～ 200 bp及其倍体。并且发现藻蓝蛋
白处理后的处于亚二倍体峰 HeLa细胞数蛋白浓度随藻蓝
蛋白浓度的增高而明显增多。另外藻蓝蛋白能促进HeLa细
胞内促凋亡基因(Fas、ICAM-1)的表达并抑制抗凋亡基因
(Bcl-2)的表达 , 从而促进细胞内凋亡信号的传导。藻蓝蛋
白可以激活 caspase酶并可促进凋亡蛋白———细胞色素 C从
线粒体到细胞质释放。结论　钝顶螺旋藻藻蓝蛋白具有诱
导体外 HeLa细胞凋亡的作用 , 通过促进凋亡信号在 HeLa
细胞内的传导从而达到抗肿瘤的效果。
关键词:钝顶螺旋藻;藻蓝蛋白;HeLa细胞;细胞凋亡;抗肿
瘤;信号传导
　　钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis, 又称钝顶节旋
藻 Arthrospiraplatensis)是一种原核丝状蓝藻 ,含有
藻蓝蛋白 、多糖 、β-胡萝卜素 、γ-亚麻酸等多种生物
活性物质 ,而藻蓝蛋白以其特有的营养和保健价值
受到广泛的重视 。藻蓝蛋白(C-phycocyanin, CPC)
是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获
光能 。其分子量在 40 ku左右 ,由 α、β两个亚基组
成。肽链上共价结合 1个开链的四吡咯环辅基。分
离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫
色荧光 ,在波长 620 nm具有特异吸收峰 ,可以 A620 /
A280表示其纯度 [ 1] 。因其水溶性 、无毒 、清亮且着色
力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化
妆品的添加剂 [ 2] 。藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光
标记物[ 3] 。另外 ,研究表明藻蓝蛋白具有一定的医
疗价值 ,美国哈佛医院 Schwartz等发现 [ 4]螺旋藻藻
蓝蛋白对癌细胞有抑制作用 , Li等[ 5]报道了螺旋藻
藻蓝蛋白对 CD59基因表达具有调控作用 ,蔡心涵
等[ 6]研究了藻蓝蛋白对激光疗法的增敏作用 ,李冰
等[ 7]研究还发现藻蓝蛋白在抗肿瘤和提高机体免
疫力方面有明显疗效。
Fig1　ThestructureofC-phycocyaninandphycocyanobilin
　　A:C-Phycocyaninmoleculecomposedoftwokindsofsubmits(α
andβ submits)toformα
3
β
3
andninephycocyanobilinmoietiesasa
chromophore(○).B:Chemicalstructureofphycocynobilin.Phycocya-
nobilinwasconvalentlyboundedtopolypeptidechainofC-phycocyaninby
waysofthioetherlinkagetocysteinylresidues, oneonα-chainandtwoon
β-chain
　　细胞凋亡(apoptosis)是机体的正常细胞在受到
生理性或病理性刺激后启发的自发的死亡过程 ,是
一种主动的 、信号依赖的 、基因控制的 、一系列酶参
与的过程 ,亦可称作 “自杀 ”。其典型的特征是一种
内源性核酸内切酶的激活和由此导致的细胞染色体
DNA的降解 。肿瘤的发生更多是细胞凋亡受到抑
制的直接结果 [ 8] 。已报道 [ 9] 有大量基因可促进或
抑制细胞凋亡的发生。一类为促进凋亡基因 ,如 IL-
·1045·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8):1045 ～ 50
1β转换酶 、p53抑癌基因 、Fas和 c-myc癌基因等基
因 。另一类为抑制凋亡基因 ,如 bcl-2基因家族。
　　大多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞凋亡 ,某些
抗肿瘤药物作用的强弱与他们诱导肿瘤细胞凋亡的
活性成正比 。因此诱导肿瘤细胞凋亡已成为寻找抗
肿瘤药物的新靶点。本研究旨在探讨钝顶螺旋藻藻
蓝蛋白对 HeLa细胞凋亡的影响并揭示其作用的分
子机制 。
1　材料与方法
1.1　材料　HeLa细胞由本实验室保种;中国仓鼠
卵巢细胞(Chinesehamsterovary, CHO)由青岛大学
医学院免疫学教研室提供 ,本实验室继代培养;藻蓝
蛋白为本课题组提取纯化获得;DAB试剂盒 、Fas免
疫组化试剂盒 、兔抗人 Fas/Bcl-2/ICAM-1单克隆抗
体均购自博士德生物工程有限公司;RPMI1640培
养液 、胎牛血清为美国 Gibco公司产品;胰酶为美国
Amersco公司产品;MTT、蛋白酶 K、RNA酶购自美
国 Sigma公司 。
1.2　方法
1.2.1 　HeLa细胞增殖活性检测 　采用 MTT
法 [ 10] 。将 HeLa细胞及对照用 CHO细胞制成细胞
悬液 ,用 RPMI1640营养液洗 3次 ,将细胞配成 5 ×
10
8·L-1 ,取 100 μl加入 96孔培养板中 。培养 24 h
后更换新鲜培养液 ,每孔加入 CPC100 μl(终浓度
为 10、20、40、80 mg· L-1),另一组为空白对照组 ,
加 100 μlPBS, 37℃ 5% CO2培养箱中培养 72 h,收
获前 5 h加入 20 μl/孔 MTT(5 g· L-1),培养结束
时 ,低温离心 1 000 r· min-1 ,弃上清 ,加入二甲亚砜
100 μl/孔 ,轻微振荡 10 min使甲瓒结晶充分溶解 ,
用酶标仪测定 490 nm处的光吸收值(A490)。
1.2.2　DNA凝胶电泳　HeLa细胞(3 ×106)在 160
mg·L-1 CPC作用 24 h后 ,用预冷的 pH7.4 PBS洗
一次 ,收集到 EP管中 ,离心沉淀 2 ×106个细胞 ,去
上清;加入 50 μl细胞裂解液 ,混匀 ,于 37℃水浴保
温至混悬液变成清亮;于室温 12 000 r· min-1离心
5 min;将上清在等体积的苯酚 /氯仿 ,苯酚 /氯仿 /异
丙醇和氯仿中各抽提一次;在上清中加入 1 /10体积
3 mol· L-1醋酸钠和 2倍体积的冷无水乙醇 ,于
-20℃沉淀;次日于 4℃、12 000 r· min-1离心 10
min,收集沉淀加入 4 μlTE缓冲液 ,混匀 ,加入 1 g
· L-1 RNaseA37℃消化 2 h。经含 EB的 1%琼脂
糖凝胶电泳 1 ～ 2 h,紫外灯下观察 、照相。
1.2.3　电镜形态学观察　HeLa细胞接种于 24孔
板(1 ×106个 /孔),共设 4组。其中 3组为实验组 ,
每组分别加入浓度为 40、 80、160 mg· L-1的 CPC
液 ,另一组为空白对照组 ,加入 pH7.4 10 mmol·
L-1 PBS,于 37℃培养 3 d。去上清 , PBS洗涤 。刮取
不同组的 HeLa细胞分别收集于 EP管中 , PBS洗涤
两次 。 1 500 r·min-1 4℃离心 10 min,细胞沉淀用
PBS洗两次 ,将细胞悬浮于 2.5%戊二醛中固定 30
min,再用 PBS洗两次 、将细胞悬浮于 1%锇酸中固
定 1 h、以丙酮梯度脱水 、在将细胞置于丙酮 ∶包埋
剂(1 ∶1)中置换 30 min、用单包埋剂浸泡 2 h,离心
收集细胞 ,按常规将细胞包埋 、切片 、双重染色 ,用透
射电子显微镜观察细胞形态 。
1.2.4　流式细胞仪 (FCM)检测藻蓝蛋白对 HeLa
细胞凋亡的影响　将 HeLa细胞接种于 96孔板 (1
×105个 /孔),共设 5组 ,每组 8孔 ,每孔 100 μl。培
养 24 h后更换新鲜培养液。其中 4组为实验组 ,每
组每孔分别加入 100 μlCPC液 ,使 CPC最终浓度分
别为 10、20、40、80 mg· L-1 ,另一组为空白对照组 ,
每组加入 100 μlPBS,于 37℃培养 72 h。去上清 ,
PBS洗涤 。刮取不同组的 HeLa细胞分别收集于 EP
管中 , PBS洗涤 2次 。然后上机进行检测。
1.2.5　藻蓝蛋白对 HeLa细胞表面 Fas, Bcl-2,
ICAM-1蛋白表达的影响　细胞处理方法同 1.2.4。
用免疫组化染色试剂盒进行检测。一抗为兔抗人
Fas/Bcl-2/ICAM蛋白单克隆抗体 。用 PBS代替一
抗作阴性对照 。阳性细胞膜和质着色呈棕黄色。光
镜下高倍视野(×400)计数 5个视野 ,计算阳性细
胞所占百分比代表阳性细胞表达率(%);每块玻片
上细胞的平均光密度可用仪器测出。阳性细胞百分
率 ×细胞平均光密度 ×100所得数值即阳性指数作
为 Fas蛋白表达量的指标 。
1.2.6　Caspase活性测定　Caspase-2、-3、-4、-6、-8、
-9、-10活性的检测采用比色法。收集经 80 mg·
L-1 CPC处理 3 d的 HeLa细胞 ,用细胞裂解液将细
胞打散 ,在冰上裂解 10 min, 4℃ 12 000 r· min-1离
心 1 min,取 5 μl上清进行蛋白定量 ,于紫外分光光
度计内测样本在 595 nm波长下的吸光度值(A595);
另 45 μl加 50 μl反应缓冲液及 5 μlCaspase反应底
物 ,混匀 , 37℃孵育 1 h后 , 测定样本 A405 ,再计算
Caspase相对活性:活性 =A405 /A595。
1.2.7　细胞色素 C释放试验　细胞用预冷的 PBS
洗 1次后用 80 μl预冷的细胞裂解液处理 30 s,
12 000 r· min-1 4℃离心 5 min收集上清。经 15%
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,然后通过 Westernblot法检测
上清中的细胞色素 C。
1.2.8　结果分析　结果以 x±s表示 ,以 SPSS软件
分析 , t检验确定差异显著性 。取 3次实验的平均
·1046· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8)
值 。
2　结果
2.1　藻蓝蛋白对 HeLa细胞生长的抑制作用　结
果显示 ,随着 CPC浓度的增高 , HeLa细胞数目呈上
升趋势 ,而正常 CHO细胞数则无变化 。结果表明藻
蓝蛋白具有抑制 HeLa细胞生长的特性 ,但对正常
CHO细胞没有影响 ,因此证实 CPC具有抗肿瘤的活
性 。见 Fig2。
Fig2　TheeffectofCPConthegrowth
andproliferationofHeLacelsandCHOcels
2.2　电镜检测 CPC诱导 HeLa细胞的凋亡　为了
探讨藻蓝蛋白对 HeLa细胞增殖的抑制作用是否与
其诱导细胞凋亡相关 ,进一步用电镜观测不同浓度
CPC对 HeLa细胞超微结构变化的影响。研究发现
细胞形态发生了一系列的改变 ,首先细胞变圆 ,随即
与邻近细胞脱离 ,失去微绒毛 ,胞质浓缩 ,核染色质
密度增高 ,核仁裂解(Fig3B、3C),进而核膜内陷将
细胞自行分割成多个外有膜包裹 、内涵物不外溢的
细胞小体———凋亡小体(Fig3D)。该结果说明藻蓝
蛋白可能通过诱导体外 HeLa细胞的凋亡来发挥其
抗肿瘤效用 。
2.3　CPC对 HeLa细胞 DNA结构的影响　提取
160 mg· L-1藻蓝蛋白作用下的 HeLa细胞的总
DNA,经电泳检测发现 , DNA片段的大小均为(180
～ 200 bp)n, 这是细胞凋亡的典型特征 。而未经
CPC作用的 HeLa细胞则没有这种现象 ,这表明藻
蓝蛋白引起 HeLa细胞内 DNA的裂解从而导致细胞
死亡。见 Fig4。
2.4　流式细胞仪检测藻蓝蛋白对 HeLa细胞凋亡
的影响　分析显示 , HeLa细胞经 CPC作用 72 h,流
式细胞仪直方图出现明显的亚二倍体峰 (亚 G1
峰),表明细胞发生凋亡 。CPC处理组凋亡细胞百
分率明显高于对照组 ,且存在剂量效应 ,即 40、80、
160 mg· L-1 CPC组凋亡细胞百分率逐渐升高 ,这
表明藻蓝蛋白的确具有促使 HeLa细胞凋亡的功
效。见 Fig5。
Fig3　ElectronmicrographsofHeLacellstreatedwithCPC
　　A:PBS-treatedcontrolcels(×6 000);B:HeLacelstreatedwith
40 mg· L-1 CPC(×6 000);C:HeLacelsdisposedwith80 mg· L-1
CPC(×6 000);D:HeLacelsdisposedwith160 mg· L-1 CPC(×
4 000)
Fig4　TheefectofCPConDNAstructureof
HeLacelsdeterminedbyagarosegelelectrophoresis
　　Lane1:0.1 ～ 1.5 kbmolecularsizemarkersofDNAladder;Lane
2:DNAfromcontrolHeLacels;Lanes3 ～ 5:DNAladderpaternsof
HeLacelsinfectedwithCPCfor72 hatfinalconcentrationof160 mg·
L-1
2.5　藻蓝蛋白对 HeLa细胞中 Fas、ICAM-1, Bcl-
2基因表达的影响　由 Tab1可见 ,与正常细胞相
比 , Fas和 ICAM-1基因在 HeLa细胞内的表达明显
低于正常对照组 ,而 Bcl-2基因表达明显高于正常
对照组 ,差异有显著性 , P<0.05。另外 ,藻蓝蛋白
处理组的 HeLa细胞中 Fas和 ICAM-1表达量明显
高于未加组 ,并且随着藻蓝蛋白浓度的增高 ,其表达
量也随之增加 。而 HeLa细胞加藻蓝蛋白组的 Bcl-2
蛋白的表达量明显低于未加组 ,并且随藻蓝蛋白浓
度的增高表达量降低。这表明藻蓝蛋白有促进 He-
La细胞内促凋亡基因 Fas和 ICAM-1表达的作用 ,
而抑制抗凋亡基因 Bcl-2的表达 ,但对正常细胞作
·1047·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8)
用不明显。
Fig5　FCM analysisofCPCinducedHeLacelsapoptosis
　　A:ControlHeLacels;B:HeLacelstreatedwith20 mg· L-1 CPC;
C:HeLacelstreatedwith40 mg· L-1 CPC;D:HeLacelstreatedwith
80 mg· L-1 CPC
Tab1　EffectofCPConFas, ICAM-1,
Bcl-2 geneexpressionofHeLacels( x±s, n=10)
CPCconcentration
/mg· L-1 Fas ICAM-1 Bcl-2
NormalCHOcels 50±1.1 42.131±0.8　　 2.136±0.041　
0 15.515±0.310＊＊ 12.235±0.601＊＊ 46.856±0.310＊＊
10 17.160±0.362＊＊ 12.584±0.912＊＊ 32.420±0.362＊＊
20 20.128±0.401＊＊ 15.096±0.231＊＊ 22.338±0.401＊＊
40 25.128±0.511＊＊ 19.544±0.471＊＊ 17.657±0.511＊＊
80 35.112±0.657＊ 28.728±0.329＊ 15.472±0.657＊
160 48.978±0.983 41.722±1.102 13.750±0.983
　　＊P<0.05, ＊＊P<0.01vscontrolgroup
2.6　Caspase活性测定　Fig6显示 ,藻蓝蛋白处理
的 HeLa细胞中 caspases-2、-3、-4、-6、-8、-9和-10被
活化 ,这表明藻蓝蛋白诱导的凋亡是依赖于半胱天
冬蛋白酶(caspase)的 ,即 caspase是凋亡作用的关
键酶。
2.7　藻蓝蛋白对细胞色素 C释放的影响 　通过
Westernblot方法检测藻蓝蛋白处理后的 HeLa细胞
细胞色素 C从线粒体到细胞质的释放情况 ,以探讨
细胞凋亡的分子机制 。如 Fig7所示 ,未用藻蓝蛋白
处理的正常 HeLa细胞的细胞质中检测不到细胞色
素 C的表达 ,而藻蓝蛋白处理组的 HeLa细胞中的
细胞色素 C含量明显增多 ,且与藻蓝蛋白的浓度的
增高呈正相关性 。
3　讨论
　　海洋生物是药物的宝库 ,从海洋生物中寻找高
效 、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究
的新领域 。近年来发现 [ 11] ,许多海洋生物尤其许多
藻类 ,其体内含有各种特有药物功能如抗菌 、抗病
毒 、抗肿瘤 、抗艾滋病以及对心脑血管系统有保健的
生物活性成分 。其中螺旋藻以其特有的营养和保健
价值倍受人们的青睐 ,其藻蓝蛋白含量高达 60% ～
70%,美国食品药品管理局认为螺旋藻是最佳蛋白
质来源。研究表明 [ 12]藻蓝蛋白离体实验具有刺激
红细胞集落生成 ,类似红细胞生成素(EPO)的作用。
国外 Iijima等曾研究小鼠口服藻蓝蛋白提高注射肝
肿瘤细胞小鼠的成活率 ,且实验组小鼠淋巴细胞活
性明显比对照高 ,他们认为该蛋白有抗疾病功能。
Morcos等[ 13]发现它具有光动力学特性并可应用于
肿瘤的治疗。研究揭示[ 14, 15]藻蓝蛋白可诱导 LPS
刺激的小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)和鼠组织细胞
瘤细胞系(AK5)的凋亡 。有实验研究表明 [ 16] ,凋亡
过程的阻断与癌症的发生密切相关 ,多数癌细胞缺
乏自我清除的机制 。
Fig6　CaspaseactivationassayofCPCtreatedHeLacels
　　A:caspase-1;B:caspase-2;C:caspase-3;D:caspase-4;E:caspase-
5;F:caspase-6;G:caspase-8;H:caspase-9;I:caspase-10
Fig7　EfectofCPConcytochromecreleasebyWesternblot
　　Lane1:CPCuntreatedHeLacels;Lane2:160 mg· L-1 CPC;
Lane3:80 mg· L-1 CPC;Lane4:40 mg· L-1 CPC
　　本研究的主要目的是探讨钝顶螺旋藻藻蓝蛋白
对体外 HeLa细胞凋亡的影响及其深层作用机制。
首先通过 MTT法检测发现藻蓝蛋白能抑制 HeLa细
胞的增殖并存在浓度剂量效应。为了更深入了解该
抑制作用是否与诱导凋亡相关 ,对细胞的质征进行
了进一步研究 。电镜观察发现藻蓝蛋白处理后的
·1048· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8)
HeLa细胞呈现明显的超微结构变化 。琼脂糖凝胶
电泳结构显示藻蓝蛋白可诱发 HeLa细胞中 DNA发
生断裂并呈梯状电泳带 ,这是细胞出现凋亡的典型
特征。随后采用流式细胞仪检测藻蓝蛋白对 HeLa
细胞的细胞周期变化及细胞凋亡的影响 ,免疫组化
法进一步检测藻蓝蛋白对 HeLa细胞中凋亡相关基
因表达的影响 ,结果表明藻蓝蛋白能促进促凋亡基
因 Fas和 ICAM-1的表达并抑制抗凋亡基因 Bcl-2
的表达 。因为 caspase在凋亡信号传导过程中发挥
着重要的作用[ 17] ,因此进一步检测了藻蓝蛋白处理
后的 HeLa细胞中 caspase的活性 , 结果发现
caspase-2、-3、-4、-6、-8、-9、-10均被激活 ,这表明藻蓝
蛋白诱导的 HeLa细胞凋亡是 caspase依赖型的 。
细胞色素 C是一种重要的呼吸链蛋白 ,它由线粒体
向细胞质的释放是细胞正处于凋亡的特征[ 18] ,它可
作为凋亡早期的判定标准 。实验结果显示藻蓝蛋白
能细胞色素 C的释放 ,由此也证实了藻蓝蛋白是通
过诱导 HeLa细胞凋亡而实现其杀伤肿瘤细胞的目
的的。
　　有关藻蓝蛋白诱导体外 HeLa细胞凋亡的分子
机制 ,可能是藻蓝蛋白作为一种有丝分裂抑制剂 ,可
与 HeLa细胞表面的受体结合 ,通过受体的交联和
蛋白激酶活化 ,促凋亡 Fas和 ICAM-1基因的表达增
强 ,而抗凋亡 Bcl-2基因的表达受到抑制。当 Fas
与 FasL结合后 , caspase-2、-3、-4、-6、-8、-9、-10会被
激活。引发线粒体的解偶联并导致外层膜的破裂 ,
细胞色素 C被释放到细胞质中 , 并与 caspase-9、
Apaf-1(apoptoticprotease-activatingfactor1, 凋亡蛋
白酶活化因子)、AIF(apoptosis-inducingfactor,凋亡
诱导因子)结合形成凋亡复合体 ,它反过来又可作
用于 caspase-9、-3、-7并使其活化 [ 19] 。在正常状态
下均以无活性的酶原形式存在的 caspase可被凋亡
信号刺激在其特异性剪切位点天冬氨酸 -半胱氨酸
残基处剪切后激活 ,同时释放 N-端结构域 ,一些上
游的 caspase就能依序的激活其下游的 caspase,引
发一组 caspase的级联反应 ,将凋亡信号一级级传至
凋亡底物 , 使细胞出现一系列特征性变化 , 包括
DNA片段化 、染色质浓缩 、胞膜泡化 、细胞皱缩 、凋
亡小体形成 ,最终导致细胞裂解 。
参考文献:
[ 1] 　张成武 ,曾昭琪 ,张嫒贞.钝顶螺旋藻藻胆蛋白的分离 、纯化及
其理化特性 [ J] .天然产物研究与开发 , 1996, 8(2):29 -33.
[ 1] 　ZhangCW, ZengSQ, ZhangYZ.Purificationandphysiochemi-
calpropertiesofphycobiliproteinofspirulinaplatensis[ J] .Nat
ProdResDev, 1996, 8(2):29 -33.
[ 2] 　张学成.螺旋藻———最完美的功能食品 [ M] .青岛:青岛海洋
大学出版社 , 1999:86 -118.
[ 2] 　ZhangXC.Spirulina——— Mostperfectfunctionalfood[ M] .Qingd-
ao:PublishingHouseofOceanUniversityofQingdao, 1999:86-
118.
[ 3] 　Rito-PalomaresM, NunezL, AmadorD.Practicalapplicationof
aqueoustwo-phasesystemsforthedevelopmentofaprototype
processforc-PhycocyaninrecoveryformSpirulinamaxima[ J] .J
ChemTechnolBiotechnol, 2001, 76(12):1273 -80.
[ 4] 　SchwartzJL, SklarG.Growthinhibitionanddestructionoforal
cancercelsbyextractsofSpirulina[ J] .ProcAmerOralPathol,
1986, 40:23-7.
[ 5] 　LiB, ZhangX, GaoM, ChuX.EfectsofCD59 onantitumoralac-
tivitiesofphycocyaninfromSpirulinaplatensis[ J] .BiomedPhar-
macother, 2005, 59(10):551-60.
[ 6] 　蔡心涵 ,何立明 ,蒋家伦 ,等.螺旋藻藻蓝蛋白对激光疗法增敏
作用的研究 [ J].中国海洋药物 , 1995, 14(1):15 -8.
[ 6] 　CaiXH, HeLM, JiangJL, etal.Theexperimentalstudyofappli-
cationofphycocyaninincancerlasertherapy[ J] .ChinJMarine
Drugs, 1995, 14(1):15-8.
[ 7] 　李　冰 ,张学成 ,高美华 ,等.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的抗
肿瘤免疫活性研究 [ J] .中国海洋大学学报 , 2004, 34(3):396
-402.
[ 7] 　LiB, ZhangXC, GaoMH, etal.Studyontheantitumorimmune
activitiesofphycocyaninandpolysaccharidefromSpirulinaplaten-
sis[ J] .JOceanUnivQingdao, 2004, 34(3):396 -402.
[ 8] 　KerJF, WinterfordCM, HarmonBV.Apoptosis.Itssignigicance
incancerandcancertherapy[ J] .Cancer, 1994, 73(8):2013 -
26.
[ 9] 　StelerH.Mechanismsandgenesofcelularsuicide[ J] .Science,
1995, 267(5203):1445-9.
[ 10] 曹　波 ,雷志勇 ,陈虹新 ,等.新的微管抑制剂 YB-13诱导 HeLa
细胞凋亡及其机制 [ J] .中国药理学通报 , 2008, 24(1):123-
7.
[ 10] CaoB, LeiZY, ChenHX, etal.YB-13, anovelsyntheticmicro-
tubuleinhibitor, inducesapoptosisofHeLacelsanditsmechanism
[ J] .ChinPharmacolBull, 2008, 24(1):123 -7.
[ 11] RiouD, Coliec-JouaultsS, pinczonduSelD, etal.Antitumor
andantiproliferativeeffectsofafucanextractedfromascophyllum
nodosumagainstanon-smal-celbronchopulmonarycarcinomaline
[ J] .AnticancerRes, 1996, 16(3A):1213-8.
[ 12] RichmondA.Spirulina.In:BorowitzkaMA, BorowitzkaLJ(ed).
Microalgalbiotechnology.Cambridge:CambridgeUniversityPress,
1988:85-121.
[ 13] MorcosNC, BernsM, HenryW L.Phycocyanin:laseractivation,
cytotoxicefects, anduptakeinhumanatheroscleroticplaque[ J].
LasersSurgMed, 1988, 8(1):10 -7.
[ 14] ReddyMC, SubhashiniJ, MahipalSV, etal.C-Phycocyanin, a
selectivecyclooxygenase-2 inhibitor, inducesapoptosisinlipopo-
lysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages[ J] .Biochem
BiophysResCommun, 2003, 304(2):385 -92.
[ 15] PardhasaradhiBV, AliA, KumariA, etal.Phycocyaninmediated
apoptosisinAK-5 tumorcelsinvolvesdownregulationofBcl-2 and
·1049·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8)
generationofROS[ J] .MolCancerTher, 2003, 2(11):1165 -
70.
[ 16] 乔爱敏 ,池岛乔 ,张为革 ,等.激活 AKT和 ERK可拮抗 N-去甲
基克拉霉素对 HeLa细胞的凋亡诱导作用 [ J] .中国药理学通
报 , 2007, 23(3):379 -83.
[ 16] QiaoAM, Ikejimatakashi, ZhangW G, etal.N-demethyl-clar-
ithromycininducedHeLaapoptosisthroughregulatingAktand
ERKactivity[J].ChinPharmacolBul, 2007, 23(3):379-83.
[ 17] 吴　振 ,吴立军 , 田代真一 , 等.紫草素诱导 HeLa细胞凋亡经
过caspase激活的机制 [ J] .中国药理学通报 , 2004, 20(5):540
-4.
[ 17] WuZ, WuLJ, TashiroSI, etal.ShikonininduceHeLacelap-
optosisviaacaspase-dependentmechanism[ J] .ChinPharmacol
Bul, 2004, 20(5):540-4.
[ 18] MartinouJC, DesagherS, AntonssonB.Cytochromecreleasefrom
mitochondria:alornothing[J].NatCelBiol, 2000, 2(3):41 -
3.
[ 19] 黄益玲 ,胡火军 , 黄利鸣 , 等.天花粉蛋白诱导人宫颈癌 HeLa
细胞凋亡的分子机制研究[ J] .中国药理学通报 , 2007, 23(1):
99 -101.
[ 19] HuangYL, HuHJ, HuangLM, etal.Molecularmechanism
studyofTrichosanthininducedapoptosisinhumancervicalcarci-
nomaHeLacels[ J] .ChinPharmacolBul, 2007, 23(1):99 -
101.
StudyonthemolecularmechanismofC-phycocyanin
fromSpirulinaplatensisinducedapoptosisinHeLacels
LIBing1 , CHUXian-ming2 , GAOMei-hua1 , ZHANGXue-cheng3
(1.SchoolofBiology, MedicalColegeofQingdaoUniversity, QingdaoShandong　266021, China;
2.DeptofCardiology, AfiliatedHospitalofMedicalCollegeofQingdaoUniversity, ShangdongQingdao　266000, China;
3.ColegeofMarineLifeSciences, OceanUniversityofChina, QingdaoShangdong　266003, China)
Abstract:Aim　Toinvestigatetheinfluenceandmo-
lecularmechanismofC-phycocyanin(CPC)fromSpir-
ulinaplatensisonapoptosisofHeLacelsinvitro.
Methods　Firstly, theefectofpurifiedCPConprolif-
erationofHeLacelsinvitrowasdeterminedbyMTT
assay, andthenelectronmicroscopewasexploitedto
observethecharacteristicapoptoticfeaturesofcels
treatedwithCPC.Subsequently, genomicDNAchan-
gesofHeLacelswereobservedbyagaroseelectropho-
resis.Flowcytometricanalysisrevealedtheinfluence
ofdiferentconcentrationsofCPConcelcycleofHeLa
cels.Theexpressionsofapoptosisrelatedgenesof
CPCtreatedHeLacelsweredeterminedbyimmuno-
histochemistryanalysis.Inaddition, theactivitiesof
caspasesandthereleaseofcytochromecfrommito-
chondriaintothecytosolweredetected.Results　Com-
paredwithcontrolcelsuntreatedwithCPC, asignifi-
cantdecreasedinthenumbersofHeLacelsinsurvival
treatedwithCPCandconcentrationdoseefectsexis-
ted.CPCcouldinducecharacteristicapoptoticfeatures
includingcelshrinkage, membraneblebbing, mi-
crovililoss, chromatinmarginationandcondensation
intodensegranulesorblocks.DNAofHeLacelstrea-
tedwithCPCshowedfragmentationpatern(DNAlad-
derofoligomersof180 ～ 200 bp)typicalforapoptotic
cels.HeLacelstreatedwithdiferentconcentrations
ofCPCdemonstratedanincreasingpercentageofcels
insub-G0 /G1 phase.Inaddition, CPCcouldpromote
theexpressionofpro-apoptoticgene(FasandICAM-
1);meanwhile, heldbacktheanti-apoptoticgene
(Bcl-2)expression, andthenfacilitatedthetransduc-
tionoftumoralapoptosissignalsthatresultedintheap-
optosisofHeLacelsinvitro.InCPCtreatedHeLa
cels, CPCtreatmentofHeLacelsalsoresultedinac-
tivationofcaspasesandreleaseofcytochromeCfrom
mitochondriaintothecytosol.Conclusion　C-phyco-
cyaninfromSpirulinaplatensiscaninducetheapopto-
sisofHeLacelsinvitro.Byvirtueofthepromotionof
theapoptosissignalstransductioninHeLa, CPCreali-
zesitsantitumoractivities.
Keywords:Spirulinaplatensis;C-phycocyanin;HeLa
cels;celapoptosis;antitumor;signaltransduction
·1050· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2009 Aug;25(8)