全 文 ：·专题报道·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 03-0204-03
不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用
刘　盛 2 ,　陈万生1 ,　乔传卓 1 ,　郑水庆 1 ,　曾　明 1 ,　张汉明 1 ,　宋赵军 1
【摘要】　目的:研究板蓝根和大青叶抗甲型流感病毒作用。方法: 选用鸡胚法分别考察各 15个种质的板蓝根和大青叶对甲
型流感病毒 ( A1京防 86-1)的抑制作用。结果: 血凝滴度实验表明 ,在对甲型流感病毒的直接作用、治疗作用和预防作用 3方
面大多数板蓝根和大青叶有效 ,但各种质药材样品抗病毒活性的有无及强度有明显差异。 结论:在保证药材来源可靠的前提
下 ,证明了板蓝根和大青叶确具抗病毒作用 ,并为药材种质的优选提供了一定的依据。
【关键词】　板蓝根 ;大青叶 ;甲型流感病毒 ;种质
【中图分类号】　 R 282. 710. 5　　　　【文献标识码】　 A
Antiviral action of Rad ix Isatidis andFolium Isatidis from different germplasm
against influenza A virus
LIU Sheng2 , CHEN Wan-Sh eng1 , Q IAO Chuan-Zhuo1 , ZHENG Shui-Qing1 , ZENG Ming1 , ZHANG Han-Ming1 , SONG
Zhao-Jun1 ( 1. Depar tment o f Pha rmacognosy , College o f Pha rmacy , Second M ilitar y M edical Univ er sity , Shanghai 200433,
China; 2. Depar tment of Pharmacy , General Hospital of Lanzhou Milita ry Command, Lanzhou 730050)
【ABSTRACT】　 Object ive: To investiga te the antiv iral action of traditional Chinese medicine Radix Isatidis and Folium
Isatidis. Methods: Influenza A virus wa s used to infect chicken embryo in v itro , the antiviral action o f the drug samples from
15 differ ent g ermplasm were studied. Results: According to hemagg lutination titer , it was proved tha t most o f Rad ix Isatid is
and Folium Isatidis we re effectiv e to influenza A virus in 3 aspects: direct, th erapeutic and preventiv e action. Mo reover , the
antivir al activity o f crude drug s from differ ent g ermpla sm va ried obv iously. Conclusion: On the base of the high qua lity of
crude drug s, we clarify the fact tha t Radix I satidis and Folium Isatidis sur ely have the antiviral ac tion, and prelimina rily o ffer
a scientific foundation for the cho ice o f fir st-ra te germplasm.
【KEY WORDS】　Radix I satidis; Folium Isatidis; influenza A v irus; g ermpla sm
[ Acad J Sec M il M ed Univ , 2000, 21( 3): 204-206 ]
⒇
　 板蓝根 ( Radix Isat idis )和大青叶 ( Folium
Isat idis )主要来源于十字花 科的菘蓝 ( Isatis
indigotica Fo rt. ) ,均为清热解毒的常用中药。目前在
临床上它们主要用于防治流行性感冒、流行性乙型脑
炎、流行性腮腺炎等病毒性感染引起的疾病。 但是 ,近
年来时有文献报道说其质量不稳定 ,疗效不确切 [1～ 4 ]。
为了较全面地揭示个中原因 ,我们对板蓝根和大青叶
的道地性进行了系统的研究。在抗病毒作用考察方面 ,
选择了较为常见的甲型流感病毒 ,采用鸡胚法 ,用血凝
实验来进行检测。其目的 ,一是在保证药材来源正确可
靠的前提下 ,澄清板蓝根和大青叶对流感病毒是否有
效 ;二是观察不同种质的药材样品间可能存在的活性
上的差异 ,从而优选出质量可靠的药材。
1　材料和方法
1. 1　药材样品　从全国采集不同种质的板蓝根种
子共 15份 ,同时栽种于上海崇明岛同一田地 ,同时
收获板蓝根和大青叶药材样品各 15份 [5 ] (考虑到本
研究课题优选出种质后可能具有的后期开发效应 ,
在此特将抗病毒实验样品种质来源以数码符号表
示 )。药材样品经第二军医大学药学院生药学教研室
乔传卓教授鉴定为菘蓝 Isat is indigotica Fort.。
1. 2　病毒毒株　甲型流感病毒 ( A1京防 86-1 EC
4 /2 /70) ,江苏省防疫站提供。
1. 3　方法
1. 3. 1　板蓝根和大青叶注射液的配制　依次取
750 m l蒸馏水 ,加热至沸 ,投入 50 g板蓝根饮片 (大
·204· 第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2000 Mar; 21( 3)
⒇ 【基金项目】　国家自然科学基金资助项目 ( 39670878)
【作者单位】　 1.第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海
200433; 2. 兰州军区总医院药剂科 ,兰州 730050
【作者简介】　刘　盛 ( 1971～ ) ,男 (汉族 ) ,硕士 ,药师
青叶 100 g ) ,煎煮 20 min,用纱布过滤。滤渣加 500
m l蒸馏水 ,煎煮 1 h,过滤。合并滤液 ,水浴上浓缩至
约 100 ml ,加乙醇 ,使乙醇浓度为 80% ,冷藏 24 h
后用滤纸过滤。滤液蒸除乙醇至无醇味 ,加蒸馏水溶
解 ,调节 pH至 7. 0～ 7. 5,加入表面活性剂 Tw een-
80 1 ml ,定容至 100 ml。压滤除菌 ,用 2 m l安瓿分
装 ,封口 ,高压煮沸消毒 ,备用。
1. 3. 2　抗病毒实验 [6 ]　将鸡胚在实验室 39℃下孵
育至 12 d胚龄 ,备用。 共进行以下 3项实验: ( 1)药
物的直接灭活作用: 将药材样品与病毒等量混合 ,
37℃作用 2 h,接种量为 0. 2 m l /胚。 ( 2)药物的治疗
作用: 先将病毒以 0. 1 m l /胚接种至鸡胚内 , 4 h后
再以 0. 1 ml /胚接种样品注射液。 ( 3)药物的预防作
用:每个鸡胚先接种 0. 1 m l样品注射液 , 1 d后再接
种 0. 1 ml的病毒。每组实验均接种 3个鸡胚 , 35℃
孵育 3 d, 4℃过夜后收获尿囊液 ,进行血凝实验。在
大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按 1∶ 10稀
释 ,再进行倍比稀释 1∶ 20, 1∶ 40, 1∶ 80, 1∶ 160,
1∶ 320, 1∶ 640,共得 7个浓度梯度。 每孔加入 1%
的鸡红细胞悬液 ,摇匀 ,静置 45 min后观察。根据血
细胞凝集程度的不同来进行判断 ,以“+ + ”为终点 ,
即观察到红细胞在孔底形成一个环状 ,四周有小凝
集块 ,以此为标准测定血凝滴度 [6 ]。以上实验均设生
理盐水对照 (排除血细胞自身的非特异性凝集 )和病
毒对照。判断结果时如果药物实验组血凝滴度为病
毒对照组的 1 /4以下 ,即说明药物对病毒增殖有抑
制作用。
2　结　果
实验中测得病毒对照组的血凝滴度为 1∶ 320,
生理盐水对照组为“ 0” ,所以 ,若实验组血凝滴度低
于 1∶ 80,则说明有效。由表 1可见 ,在 15个种质的
板蓝根中 ,在对流感病毒的直接作用、治疗作用和预
防作用上的有效率分别为 100% ( 15 /15) , 60%
( 9 /15) , 67% ( 10 /15) ;其中 3, 7, 8, 13和 15号 5个
种质的板蓝根在 3种作用上对流感病毒均有效。由
表 2可见 ,大青叶对流感病毒直接作用、治疗作用和
预 防作用的有效率分别为 87% ( 13 /15 ) , 87%
( 13 /15) , 40% ( 6 /15) ,其中 3, 4, 5, 8, 10和 11号 6
个种质的大青叶在 3种作用上对流感病毒均有效。
3　讨　论
常用的中药抗病毒作用研究方法大致分为组织
培养法、鸡胚法和整体动物保护实验三类。鸡胚法比
动物实验更不易受外界因素的影响 , 比组织培养更
表 1　不同种质的板蓝根药材抗流感病毒作用
Tab 1　 The antiviral action against inf luenza A virus of
Radix Isatidis from diff erent germplasm
(n= 3)
Sample
No.
Mean hemagglu tination ti ter of allan toic liquid
Direct
action
Therap eut ic
action
Prev en tive
act ion
Con trol of virus 1∶ 320 1∶ 320 1∶ 320
Con t rol of N S 0 0 0
1 1∶ 20 1∶ 20 1∶ 320
2 1∶ 60 1∶ 50 1∶ 150
3 1∶ 40 1∶ 50 1∶ 40
4 1∶ 20 1∶ 90 1∶ 80
5 1∶ 80 1∶ 80 1∶ 90
6 1∶ 40 1∶ 90 1∶ 40
7 1∶ 50 1∶ 80 1∶ 50
8 1∶ 50 1∶ 80 1∶ 50
9 1∶ 30 1∶ 130 1∶ 50
10 1∶ 50 1∶ 240 1∶ 90
11 1∶ 20 1∶ 270 1∶ 50
12 1∶ 60 1∶ 180 1∶ 80
13 1∶ 45 1∶ 80 1∶ 80
14 1∶ 50 1∶ 80 1∶ 270
15 1∶ 50 1∶ 60 1∶ 50
表 2　不同种质的大青叶药材抗流感病毒作用
Tab 2　 The antiviral action to inf luenza A virus
of Folium Isat idis f rom diff erent germplasm
(n= 3)
Sample
No.
Mean hemagglu tination ti ter of allan toic liquid
Direct
action
Therap eut ic
action
Prev en tive
act ion
Con trol of virus 1∶ 320 1∶ 320 1∶ 320
Con t rol of N S 0 0 0
1 1∶ 20 1∶ 60 1∶ 110
2 1∶ 30 1∶ 90 1∶ 110
3 1∶ 20 1∶ 40 1∶ 50
4 1∶ 10 1∶ 40 1∶ 60
5 1∶ 15 1∶ 40 1∶ 40
6 1∶ 10 1∶ 30 1∶ 90
7 1∶ 20 1∶ 40 1∶ 90
8 1∶ 20 1∶ 40 1∶ 60
9 1∶ 15 1∶ 50 1∶ 90
10 1∶ 10 1∶ 50 1∶ 60
11 1∶ 25 1∶ 50 1∶ 60
12 1∶ 110 1∶ 90 1∶ 920
13 1∶ 35 1∶ 40 1∶ 210
14 1∶ 100 1∶ 30 1∶ 200
15 1∶ 50 1∶ 60 1∶ 400
接近机体 ,适宜于对能在鸡胚内增殖的病毒 (如甲型
流感病毒 )进行抗病毒药效测定。
大多数研究认为板蓝根和大青叶具有有效拮抗
流感病毒的作用 [7 ] ,但也有人经实验证实为无效 [8 ]。
究其原因 ,从生药学的观点来看 ,药材来源及质量的
·205·第 3期 . 刘　盛 ,等 . 不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用
可靠与否往往直接影响到药理实验的结果。本实验
中 ,我们将 15个不同种质板蓝根种子在相同的环境
中栽培 ,尽可能多地排除影响药材品质的因素 ,使得
结果较为可靠。本实验证实了以下两点:一是大多数
板蓝根和大青叶样品对甲型流感病毒 A1京防 86-1
株有明显的拮抗作用 ,无论是同病毒直接作用 ,还是
治疗和预防作用均为有效 ,仅程度有所不同而已 ,直
接作用普遍稍强于治疗和预防作用 ;二是不同种质
的药材抗病毒活性的有无及强度存在差异 ,而且差
异在几倍到十几倍之间 ,如此悬殊的差异无疑是造
成药材品质不稳定、疗效不确切的重要原因。
中药现代化的根本出路在于中药材生产的规范
化和标准化 ,而规范化生产的首要条件是中药材品
种的规范化 ,一个稳定、各项药理指标及活性成分指
标符合要求的品种是规范化生产的基础。 只有品种
的规范化 ,栽培措施、采收加工、贮藏、制剂等的规范
化才有意义。 本实验对不同种质菘蓝进行抗流感病
毒活性的药效筛选 ,发现它们在抗病毒活性上存在
明显差异 ,从中可以优化出抗病毒活性较强的种质 ,
这些种质对进一步品种选育提供了良好的素材。
【参 考 文 献】
[1 ]　朱煜根 ,朱晓燕 . 板蓝根冲剂的质量控制指标的商讨 [ J ]. 中成
药 , 1990, 12( 4): 10-11.
[2 ]　叶爱莲 ,郑海岚 ,李水福 . 板蓝根冲剂的质量及其标准亟待重
视 [ J] . 中国中药杂志 , 1995, 20( 9): 571-573.
[ 3 ]　许桢灿 ,林绍乐 . 中药板蓝根抑菌作用的评价 [ J] . 中成药研
究 , 1987, ( 12): 9-11.
[4 ]　刘云海 ,刘彦斌 . 不同地产板蓝根抗内毒素作用比较 [ J ]. 中国
中药杂志 , 1994, 19( 2): 88-89.
[5 ]　郑水庆 ,陈万生 ,曾　明 ,等 . 二倍体的不同品系与四倍体板蓝
根中多糖的含量测定 [ J] . 第二军医大学学报 , 1999, 20( 10):
755-757.
[ 6 ]　中华人民共和国国家标准 ( GB 15994-1995 ) [M ] . 北京:国家
技术监督局、中华人民共和国卫生部 , 1996.
[ 7 ]　吴葆杰 ,主编 . 中草药药理学 [M ] . 北京:人民卫生出版社 ,
1983. 253-256.
[8 ]　楼之岑 ,秦　波 ,主编 . 常用中药材品种整理和质量研究 (北方
编 第 1册 ) [M ] . 北京:北京医科大学· 协和医科大学联合出
版社 , 1995. 303-342.
【收稿日期】　 2000-02-23　　 【修回日期】　 2000-03-06
【本文编辑】　姚春芳
(上接第 203页 )
2　结　果
34例星形细胞瘤标本检测结果: ( 1) P53蛋白染色均位
于核内 ,呈散在黑色颗粒 ,类圆形 ,形状规则。 34例标本中 16
例 P53蛋白染色阳性 ,其中星形细胞瘤Ⅰ 级 4 /8,Ⅱ级 5 /12,
Ⅲ ～ Ⅳ级 7 /14。 ( 2) bcl-2 m RNA染色位于胞质 ,呈片状 ,蓝
褐色 ,形态不规则 , 34例标本中 18例染色阳性 , 其中星形细
胞瘤Ⅰ 级 5 /8,Ⅱ级 7 /12,Ⅲ ～ Ⅳ级 6 /14。 34例星形细胞瘤
组织中 , 7例 P53蛋白和 bcl-2 m RN A染色均为阳性 ,占
20. 59%。 正常脑组织 P53蛋白和 bcl-2 m RN A染色阳性细
胞数小于 10%。
3　讨　论
正常组织中常规免疫组织化学方法难以检测到 P53蛋
白。当 p53基因突变后 , P53蛋白半衰期延长 ,在细胞内产生
积聚 ,免疫组化检测阳性 ,据此推断 p53基因突变。我们采用
抗 P53多克隆抗体 CM-1可检测多种 p53基因突变产物 , 34
例星形细胞瘤组织中 , 16例 P53蛋白染色阳性 ,这与有关研
究报道一致 [1]。
正常神经元细胞轴突及胶质细胞不表达 bcl-2基因 ,我
们采用原位分子杂交观察到 18 /34人脑星形细胞瘤组织有
bcl-2 m RN A表达 ,该结果与文献报道相符 [2]。
我们发现人脑星形细胞瘤组织中存在 P53蛋白积聚和
bcl-2基因 mRN A表达 ,表明人脑星形细胞瘤中存在凋亡抑
制现象。凋亡抑制使得带有 DNA损伤或突变的细胞继续存
活 ,最终导致星形细胞瘤的发生。 另外有 7例星形细胞瘤组
织中 P53蛋白积聚和 bcl-2 m RNA表达同时存在 ,这与多癌
基因协同学说相符合 ,即靶细胞内多个抑癌基因发生突变
和 (或 )癌基因被激活 ,从而导致了肿瘤的发生发展 ,人脑星
形细胞瘤也不例外。
星形细胞瘤术后常需结合放疗和化疗。目前认为放疗和
化疗的抗癌机制之一是激发了凋亡过程 ,瘤细胞主动自杀死
亡。 瘤细胞凋亡受到抑制后 ,由放疗或化疗所诱发的瘤细胞
死亡减少 ,表现为肿瘤对放、化疗产生抵抗。我们观察到人脑
星形细胞瘤组织中存在 p53突变和 bcl-2激活现象 ,这一方
面为从凋亡抑制着手研究部分星形细胞瘤对放疗和化疗的
抵抗性提供了新的线索 ,另一方面提示我们 ,可能在星形细
胞瘤中出现 p53基因突变和 bcl-2激活是预后不良的信号。
在这种情况下必须寻求新的治疗策略 ,如将野生型 p53基因
导入瘤细胞或将反义 bcl-2转入瘤细胞以封闭 bcl-2基因的
表达 [3 ]。
【关键词】　基因 , p53;基因 , bcl-2;脑肿瘤
【中图分类号】　 R 730. 264　　　　【文献标识码】　 B
【参 考 文 献】
[ 1 ]　 David N L. The p53 gene and protein in human b rain tumo rs
[ J ]. J Neuropath ol Ex p Neurol, 1994, 53( 1): 11-21.
[ 2 ]　 Nakasu S, Nakasu Y, Nioka H, et al . bcl-2 p ro tein
expression in tumors of the cent ral nervous sys tem [ J] . Acta
Neuropath ol ( Berl ) , 1994, 88( 6): 520-526.
[ 3 ]　 Yabuno T, Konishi N, Nakamura M , et al . Drug resis tance
and apoptosis in EN U-induced rat brain tum ors t reated wi th
ant i-cancer drugs [ J ]. J Neurooncol , 1998, 36( 2): 105-112.
【收稿日期】　 1999-09-14　　 【修回日期】　 1999-12-05
【本文编辑】　汪立鑫
·206· 第二军医大学学报　 2000年 3月 ,第 21卷