全 文 ：书第 41 卷 第 3 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 3
2013 年 3 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Mar． 2013
1)哈尔滨市青年人才创新基金(2012RFQXN007)、大庆市科学
技术项目(SCX2010－08)、黑龙江省面上自然基金项目(C201110)。
第一作者简介:赵晓妮，女，1986 年 7 月生，东北林业大学生命
科学学院，硕士研究生。
通信作者:由香玲，女，东北林业大学生命科学学院，副教授，E－
mail:yxiangling@ yahoo． com。
收稿日期:2012 年 4 月 20 日。
责任编辑:任 俐。
高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中
抗氧化酶活性变化1)
赵晓妮 孙凤阳 尹 静 由香玲
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
摘 要 龙牙楤木成熟体胚经 37 ℃高温处理 0 ～ 3 d于不加任何植物生长调节剂的 WPM培养基中产生了次
生体胚。结果发现，经高温处理 1 d的外植体的次生体胚发生最好，诱导率为 58%，平均每外植体次生体胚约为 4
个;高温胁迫过程中及次生体胚发生过程中，3 种抗氧化酶活性具有明显变化，且处理 1 d外植体中，3 种抗氧化酶
活性始终相对较高;高温胁迫使过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性降低，超氧化物歧化酶(SOD)活性则升
高。胚性细胞分化期，即成熟体胚分化形成的球形体细胞胚时期(培养 10 ～ 15 d) ，POD、SOD 活性相对较高，CAT
活性较低;次生体胚发育过程中，即发育形成的鱼雷和子叶体细胞胚时期(培养 15 d以后) ，SOD、POD活性呈下降
趋势，CAT活性则变化不大。
关键词 高温胁迫;龙牙楤木;次生体胚;抗氧化酶活性
分类号 Q945． 78
Induction of Secondary Somatic Embryogenesis of Aralia elata (Miq．)Seem． and Anti-oxidative Enzymes Activi-
ties under High Temperature Stress /Zhao Xiaoni，Sun Fengyang，Yin Jing，You Xiangling(Northeast Forestry Univer-
sity，Harbin 150040，P． R． China)/ / Journal of Northeast Forestry University． －2013，41(3)． －99 ～ 102
Secondary somatic embryogenesis of Aralia elata (Miq．)Seem． was induced from the mature somatic embryo under
high temperature of 37 ℃ for 0－3 days and cultured on the WPM medium without any plant growth regulator． The results
showed that the treatment of high temperature on mature somatic embryo for 1 day was best for the induction of secondary
somatic embryogenesis． The induction frequency was 58%，and the number of somatic embryo per explant was about 4．
During the treatments of high temperature and secondary somatic embryogenesis，three anti-oxidative enzymes activities
changed obviously，and their activities in the explant treated for 1 day were higher than those in control． Under high tem-
perature stress，the anti-oxidative enzymes of POD and CAT reduced，while the SOD activity increased． At the early peri-
od of the embryogenic cell differentiation (cultured for 10－15 days) ，the enzymes activities of POD and SOD were higher
than those in control，and the enzymes activity of CAT was lower． During the development of secondary somatic embryo
(after 15 days) ，the enzymes activities of SOD and POD showed reducing trend，however，that of CAT did not change ob-
viously．
Keywords High temperature stress;Aralia elata;Secondary somatic embryo;Anti-oxidative enzyme activity
龙牙楤木(Aralia elata (Miq．)Seem．) ，又名辽
东楤木、刺老芽等，属五加科楤木属(Aralia L．)植
物［1］，为重要的食、药兼用的植物。其嫩芽含有人
体必需的多种氨基酸和微量元素［2］，根皮和树皮性
味辛苦，有小毒，具有补气安神、强精滋肾、祛风活
血、除湿止痛的功效［3］。近年来的研究显示龙牙楤
木皂苷在免疫调节、肿瘤防治方面有很显著的作
用［4］。但是，龙牙楤木的野生资源由于破坏性、掠
夺性地进行连年多茬采收，其资源量急剧下降，黑龙
江省已将其列为濒危珍稀植物，其高效繁殖也显得
尤为重要而迫切。
体胚发生方式是一种高效快繁方法。关于龙牙
楤木体胚发生的研究报道已有不少，例如:Amemiya
et al．［5］利用 10 年生龙牙楤木树上的冬芽在含有 2，
4－D的 MS培养基中诱导产生了体胚;Kang et al．［6］
在含 2，4－D的培养基中，从龙牙楤木毛状根中诱导
了体胚;Dai et al．［7］利用 IBA 诱导了体细胞胚发生
等。现报道的研究主要是外植体选择和利用植物生
长调节剂建立体胚快速繁殖体系。在本研究过程中
发现，高温胁迫能够诱导龙牙楤木次生体胚发生。
高温诱导体胚发生的实例有胡萝卜和油菜，其中，37
℃高温处理胡萝卜的顶芽后转入无任何植物生长调
节剂培养基中诱导了体胚发生［8］;油菜花芽内小孢
子经高温处理后，诱导了前期体胚［9］。但研究者们
未深入分析其中的原因，仅从体胚发生角度研究了
这种诱导体胚发生的方法。事实上，高温胁迫会使
外植体各种生理状态发生变化，其中一项重要的生
理变化是抗氧化酶的变化。因为胁迫产生了大量的
活性氧，可使细胞膜脂过氧化而伤害细胞［10］。文中
详细介绍了 37 ℃高温诱导次生体胚的过程，为高效
快速繁殖龙牙楤木提供更简便快捷的方法;同时考
察了高温处理过程中及次生体胚发生过程中 3 种抗
氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性的变化特征，从生
理活性角度揭示了高温胁迫处理对体胚诱导的作
用。
1 材料与方法
次生体胚诱导:本试验在先前的研究中，通过无
菌实生苗根诱导(在 1 /2SH+2． 0 mg·L－1 IBA+20 g·
L－1蔗糖的固体培养条件下)获得了大量龙牙楤木成
熟子叶体胚［7］。从中选取 1． 5 cm 长的成熟子叶体
胚，接种于不含有任何植物生长调节剂，添加 20 g·
L－1蔗糖的 WPM固体培养基中，置于培养箱中 37 ℃
培养 0 ～ 3 d，取出放置于培养室进行暗培养诱导次
生体胚。每个培养瓶中接种 8 个体细胞胚，每个处
理接种 10 瓶。每次取 0． 2 g，每隔 5 d 取样 1 次，共
取 5 次，迅速放入冰箱－40 ℃保存，留作抗氧化酶活
性分析。上述培养基均添加 3 g·L－1水晶洋菜(gel-
rite，Duchefa－Postubus Haarlem，Netherlands) ，pH 值
为 5． 8，经过高温高压灭菌(121 ℃、0． 152 MPa、15
min)后使用。材料在常规组织培养室中培养(温度
(23±1)℃，暗培养，湿度 60% ～70%)。
SOD、POD、CAT 活性测定:将龙牙楤木体胚材
料置于预冷的研钵中，加 1． 0 mL预冷的 0． 05 mol·
L－1磷酸缓冲液(pH值为 7． 8)在冰浴上研磨成浆后，
转入离心管中加 0． 05 mol·L－1磷酸缓冲液(pH值为
7． 8)使终体积为 5． 0 mL。然后在 4 ℃、10 000 r·
min－1离心 15 min，取上清液作为粗酶液于冰箱中 4
℃冷藏，用于测定超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过
氧化氢酶活性分析。
超氧化物歧化酶(SOD)活性采用 NBT 光还原
法测定［11］;过氧化物酶(POD)活性采用 0． 3%愈创
木酚法［11］测定;过氧化氢酶(CAT)活性采用 240 nm
比色法［11］测定。
数据分析:数据采用 Excel 2003 进行整理及作
图处理，应用 SPSS19． 0 软件进行 Tukey多重比较分
析和相关性分析，所得数据均为 3 次的平均值。
2 结果与分析
2． 1 高温胁迫诱导龙牙楤木次生体细胞胚发生
龙牙楤木成熟体细胞胚在恒温培养箱中 37 ℃
处理 0 ～ 3 d，接种于无任何植物生长调节剂的 WPM
培养基中培养 21 d，都有次生体细胞胚发生(图 1A、
B、C)。观察发现，在此过程中 10 ～ 15 d是次生体细
胞胚发生的时期，此后 20 ～ 25 d 基本是体细胞胚发
育成长的时期。与未进行高温处理的对照和处理 1
d的外植体相比，高温处理 3 d 的外植体材料变褐，
且平均每个体胚上产生次生体细胞胚的数量较少，
约 2 个(表 1)。统计次生体胚的诱导情况(表 1)显
示，高温处理外植体 1 d，次生体胚的诱导情况较好，
诱导率和体胚诱导数量分别为 58%和 4 个，显著高
于对照(P＜0． 05) ;但是随着高温处理时间的延长，体
胚的诱导率逐渐下降，均显著低于对照(P＜0． 05) ，而
且高温处理3d的体胚诱导率略低于处理2 d的，无显
著差异(P＞0． 05)。结果表明，合适的高温胁迫有利
于次生体胚发生。
A、B、C．分别为高温处理 0、1、3 d诱导的次生体胚;D． B 中诱导的次
生体细胞胚的放大图;A、B、C比例尺为 1． 0 cm，D比例尺为 0． 3 cm。
图 1 成熟体胚经高温处理后在无任何植物生长调节剂的
WPM培养基中诱导的次生体胚
表 1 高温处理 0 ～ 3 d 的体细胞胚在无任何植物生长调节
剂的培养基中诱导次生体细胞胚的情况
处理时
间 /d
次生体胚
发生率 /%
平均每个外植体诱
导体胚的个数 /个
0 (45． 08±0． 66)b (3． 60±0． 98)b
1 (58． 33±0． 73)a (4． 67±0． 44)a
2 (37． 50±0． 74)cd (2． 00±0． 20)cd
3 (33． 25±1． 68)d (2． 50±0． 34)d
注:表中数据为平均值±标准差;同列相同字母表示差异不显
著;不同字母表示差异显著(P＜0． 05)。
2． 2 高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中
抗氧化酶活性分析
2． 2． 1 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中 SOD
活性变化
经高温处理 1 ～ 3 d 的龙牙楤木体胚与未处理
的相比，SOD 活性都有所升高，但是升高幅度不大
(取材时间为 0 d) (表 2)。在体细胞胚发生过程中，
与对照相比，在第 5 d SOD活性都有所下降，到第 10
d时，SOD 活性达到最高峰，之后各处理的 SOD 活
性呈下降趋势。第 10 ～ 15 d 是胚性细胞形成时期。
在第 5 ～ 10 d，未处理材料中的 SOD 活性都高于处
001 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
理的;而在第 15 d处理材料的 SOD活性都高于未处
理的。且整个次生体胚发生过程中，处理 1 d 外植
体中 SOD的活性均较高。
2． 2． 2 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中 POD
活性变化
龙牙楤木体胚经高温处理后，与对照相比，各个
处理的 POD活性均下降(取材时间为 0 ～ 5 d) (表
2)。处理后在次生体胚发生过程中，胚性细胞的形
成时期，即第 10 d POD 活性迅速上升至最高，而且
高温处理 1 d的 POD活性最高，随后其活性下降，且
活性基本不变。表明 POD 活性升高可促进次生体
胚发生和胚性细胞的早期发育，而高温胁迫 1 d 更
利于体胚发生的形成。
表 2 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中 SOD、POD、CAT
活性变化
取材时
间 /d
SOD活性 /U·g－1
对照 1 d 2 d 3 d
0 (67． 01±12． 61)ac (71． 37±9． 22)ac (72． 03±13． 33)a (68． 85±5． 35)a
5 (98． 83±2． 88)b (60． 58±16． 91)abc (55． 31±6． 183)ab (49． 57±3． 12)ab
10 (86． 50±9． 51)bc (72． 93±11． 64)c (70． 07±1． 05)a (69． 70±12． 33)a
15 (32． 36±7． 65)d (67． 63±5． 07)ac (55． 35±3． 69)ab (50． 38±2． 84)b
20 (41． 18±5． 78)d (45． 17±3． 92)ab (30． 25±1． 28)bc (25． 12±0． 53)c
25 (51． 67±9． 54)ad (36． 12±10． 36)b (26． 29±4． 40)c (20． 37±2． 54)c
取材时
间 /d
POD活性 /U·g－1
对照 1 d 2 d 3 d
0 (357． 50±24． 75)a (267． 50±45． 96)a (243． 33±38． 84)a (108． 33±7． 63)a
5 (915． 00±147． 31)b (813． 33±89． 63)ab (807． 50±159． 09)b (805． 00±148． 49)b
10 (670． 00±7． 07)c (1 180． 00±217． 94)ab (943． 33±222． 72)b (925． 00±42． 42)b
15 (642． 50±10． 60)c (550． 00±162． 63)b (403． 33±143． 38)ac (198． 33±38． 83)ac
20 (671． 67±141． 45)c (571． 66±106． 81)b (393． 33±37． 52)ac (356． 67±72． 34)c
25 (745． 00±250． 59)d (625． 00±30． 00)c (520． 00±63． 63)c (525． 00±77． 78)d
取材时
间 /d
CAT活性 /U·g－1·min－1
对照 1 d 2 d 3 d
0 (63． 54±9． 65)a (58． 96±8． 03)a (53． 75±6． 02)a (45． 72±5． 26)a
5 (25． 00±0． 44)b (40． 78±1． 98)b (32． 50±2． 19)b (30． 44±1． 33)b
10 (48． 54±10． 41)a (58． 96±4． 96)a (45． 83±2． 90)ac (43． 81±4． 85)a
15 (56． 56±2． 19)a (59． 17±3． 78)a (50． 92±4． 31)a (50． 73±3． 78)a
20 (56． 46±1． 54)a (50． 42±8． 75)ab (50． 83±2． 53)a (49． 85±2． 01)a
25 (55． 10±3． 85)a (46． 56±10． 15)ab (41． 98±6． 33)c (43． 75±11． 65)a
注:表中数据根据鲜质量测得;数据为平均值±标准差;同列相
同字母表示同一种氧化酶活性的不同取材时间之间差异不显著;不
同字母表示差异显著(P＜0． 05)。
2． 2． 3 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中 CAT
活性变化
龙牙楤木体胚经高温处理后，与对照相比，各处
理的 CAT活性均呈下降趋势(取材时间为 0 d) (表
2)。在次生体胚发生过程中，CAT 活性逐渐升高，
在第 15 d CAT活性达到最高，而后其活性虽有小幅
下降，但维持在一个较高的水平。高温处理 1 d 外
植体的 CAT活性相对其他处理的较高，而且在次生
胚性细胞形成期第 15 d活性达到最高，其后维持在
较高水平。由此可知次生体胚的发生发育过程中，
CAT活性均升高。崔凯荣等［12］在研究枸杞的体胚
发生过程中发现，CAT 在继代愈伤组织中的活性很
高，随着胚性细胞的形成酶活性降低，到分化培养 3
d 时出现酶活性的低谷，随着胚性细胞的分裂、发
育，这种酶活性又开始逐渐升高，成熟胚期活性升到
和继代愈伤组织大致相同水平。而与本研究体胚发
生过程不太一致。可能由于本研究外植体材料预先
进行的高温胁迫改变了其变化趋势。
通过对高温胁迫处理后龙牙楤木体胚 SOD、
POD、CAT活性的变化进行 Pearson 相关性分析，得
出 POD与 CAT活性之间的相关系数 r = 0． 983，P =
0． 017＜0． 05，表明两者呈显著正相关，且龙牙楤木
体胚随着高温胁迫处理时间的延长，POD与 CAT活
性都显著低于对照组(P＜0． 05) ，龙牙楤木体胚的
POD与 CAT 完全失去保护作用;而 SOD 与 POD、
CAT活性呈一定的负相关，但不显著(P＞0． 05) ，龙
牙楤木体胚随着高温胁迫处理时间的延长，SOD 活
性略高于对照组，差异不显著(P＞0． 05) ，表明高温
胁迫处理后龙牙楤木体胚中 SOD 可能对其活性氧
的清除起到关键作用;在龙牙楤木次生体胚发生过
程中 3 种抗氧化酶活性之间相关性不显著。
3 结论与讨论
植物体在遭受高温胁迫后，细胞内将积累大量
的活性氧［13－15］，诱使细胞内合成表达抗氧化酶类以
消除或缓解活性氧对细胞的毒害作用。作为内源性
保护酶，SOD负责催化 O－2·转变为 H2O2，并在过氧
化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的作用下将其
分解为 H2O和 O2，消除高温胁迫产生的活性氧对细
胞的伤害［16］。本研究发现，高温胁迫龙牙楤木体胚
诱导次生体胚发生过程中，3 种抗氧化酶活性均有
明显变化。高温胁迫均使 POD 和 CAT 活性降低，
而 SOD活性则升高。在次生体胚发生过程中，3 种
过氧化物酶活性均有显著的变化。在胚性细胞分化
的早期(第 10、15 d) ，处理外植体的 POD、SOD 活性
相对较高，CAT 活性较低。在体胚发育过程中(第
15 d以后) ，SOD和 POD活性都呈显著下降趋势(P＜
0． 05) ，而 CAT 活性维持在较高的水平。由此可推
测，SOD 和 POD 对次生体胚诱导起主导作用，而
CAT对体胚的发育和成熟起关键作用。本试验结
果同时也表明，在次生体胚发生过程中，3 种抗氧化
物酶(SOD、POD、CAT)相互配合来调节胚性细胞的
发生与发育过程，与陈义挺等［17］对龙眼体胚发生早
101第 3 期 赵晓妮等:高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中抗氧化酶活性变化
期 POD活性研究结果一致。处理 1d 外植体为合适
的处理，其活性均高于其他处理，而其次生体胚诱导
率相对较高。3 种过氧化物酶活性的规律性变化，
可能是在不同的细胞器中进行，从而使体胚发生过
程氧化系统维持在一个适宜的水平，以消除高温对
体胚发生的影响。在花楸体胚发生过程中，研究者
发现，SOD、POD活性均在胚性细胞向球形胚转化时
下降，球形胚向心形胚发育时下降，心形胚向鱼雷形
胚和鱼雷形胚向子叶形胚发育时再升高;CAT 活性
变化规律与 SOD、POD 活性变化不同［18］，这可能是
不同材料的体胚发生过程中抗氧化系统的协调方式
不同所致。
许多资料显示，一定浓度的 H2O2 对体胚产生
有促进作用。枸杞体胚发生的研究发现，适量浓度
的 H2O2 对枸杞胚性细胞的形成和体细胞胚的发育
有促进作用;过高的 H2O2 则有抑制作用
［19］。本研
究的高温胁迫，同样也产生了大量活性氧。H2O2 作
为一种细胞信号传递物质，可以通过细胞的信号传
递系统影响基因的调控表达。胚性细胞的形成过
程，即细胞的分化过程，其核心是基因的差异表达，
H2O2 可能在分子水平上诱导胚胎的发生
［12］。
崔凯荣等［12］在枸杞的体胚发生过程中发现，在
胚性愈伤组织转入分化培养基后，随着胚性细胞的
形成，SOD活性逐渐升高，当胚性细胞进一步分裂
形成体细胞胚时，SOD 活性达到最高峰，表明 SOD
活性升高对胚性细胞的分化及胚胎发育具有促进作
用。原海云等［20］以连翘为试验材料，研究高温胁迫
对连翘细胞 SOD 活性的影响发现，在 12 ～ 24 h，高
温胁迫时间与连翘细胞 SOD活性呈正相关，这与本
试验结果相一致。根据本试验 3 种抗氧化物酶的相
关分析表明，POD 与 CAT 活性呈显著正相关(r =
0． 983) ，POD、CAT 活性能够准确地反映高温胁迫
龙牙楤木体胚发生随处理时间的变化趋势，这对研
究龙牙楤木次生体胚的发生具有一定的指导意义。
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