全 文 ：海洋科学/2007年/第 31卷/第 4期
钝顶螺旋藻多糖提取工艺的研究———三氯乙酸(TCA)法的正
交实验优化
孙远征 ,张学成 ,纪　雷
(中国海洋大学 海洋生命学院 , 山东 青岛 266003)
摘要:研究了用三氯乙酸(TCA)脱除蛋白质提取钝顶螺旋藻(S pirulina p latensis)多糖的工
艺 ,并以提取率 、样品糖含量与蛋白含量为指标 , 应用正交实验设计优化了提取液 pH 值 、提
取温度及提取时间 3 个因素。结果表明 ,在提取液 pH 值为 12、提取温度为 90℃及提取时间
为 8h 的最佳条件下 , 所得螺旋藻多糖为白色粉末 , 提取率为 3.10%,糖质量分数为81.79%,
蛋白质量分数为 0.57%。
关键词:钝顶螺旋藻多糖;三氯乙酸(TCA);正交实验设计
中图分类号:Q539　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3096(2007)04-0042-06
　　钝顶螺旋藻(S pirulina platensis)又名钝顶节旋
藻(Arthrospi ra p latensis), 属于蓝藻门(Cyanophy-
ta),蓝藻纲(Cyanophyceae),颤藻目(Oscillatoriales),
颤藻科(Oscillatoriaceae),是一种丝状原核藻类 , 富含
蛋白质 、脂肪 、维生素 、矿物质 、叶绿素 、β -胡萝卜素
及多糖[ 1] 。螺旋藻多糖是存在于螺旋藻中的生物大
分子 ,属酸性杂多糖 , 其分子由鼠李糖 、岩藻糖 、木糖 、
甘露糖 、半乳糖 、葡萄糖以及葡萄糖醛酸等分子组
成[ 2] 。研究表明 ,多糖是螺旋藻中重要的生物活性物
质之一[ 3] , 它具有显著的抗病毒抗辐射抗突变功
能[ 4 ～ 6] ,能提高机体的细胞免疫功能和体液免疫功
能[ 7 ～ 9] ,抑制癌细胞 DNA 的合成 、抵制癌细胞增
殖[ 10] , 减轻辐射所引起的遗传损伤等[ 11 ～ 14] 。 由于螺
旋藻中大部分是蛋白质 , 因此在螺旋藻多糖的提取
工艺中 ,脱除蛋白质是一个主要环节。目前制备螺旋
藻多糖常用的方法是热水提取 、Sevag 法除蛋白质 ,
但此方法有机试剂消耗量大 , 工艺流程长 , 产品中蛋
白质含量较高[ 15] 。作者对螺旋藻多糖的提取工艺进
行了改进 ,采用碱性溶液提取 、三氯乙酸沉淀蛋白质。
在螺旋藻多糖的提取工艺中选取合适的提取液 pH
值至关重要 ,直接影响提取结果。温度对提取结果也
有非常大的影响 , 螺旋藻多糖在水中的溶解度随温
度上升而升高 ,温度低于 50℃时多糖基本没有被提
取 , 高于 50℃时提取率随温度上升而明显升高并且
蛋白可变性易被沉淀 , 使提取物中蛋白含量降低[16] 。
提取时间也是影响提取结果的另一因素 ,由于螺旋藻
细胞结构紧密 ,干藻粉在水中溶解慢 , 随提取时间增
加其提取率也增加 , 一定时间后基本上达到平衡[17] 。
由此可见 , 提取液的 pH 值 、提取温度及提取时间是
能对提取结果产生重大影响的三个因素 ,合理选取此
三因素的实验值才能使提取效果达到最佳。因此 ,作
者采用正交设计方法优化了三个因素的实验条件。
1　材料与方法
1.1　实验材料
螺旋藻粉(由山东无棣生物工程公司提供), 95%
乙醇 、盐酸 、三氯乙酸(TCA)、丙酮 、浓硫酸 、苯酚 、葡
萄糖 、牛血清白蛋白 、考马斯亮蓝 G-250 , 试剂均为分
析纯。
收稿日期:2005-03-14;修回日期:2005-06-14
作者简介:孙远征(1981-),男 ,硕士研究生 ,研究方向:藻类
生物化学 , E-mail:sunyuanzheng81.s tudent@sina.com ;张
学成 , 通讯作者 , 电话:0532-82032789 , E-mail:x czhang @
ouc.edu.cn
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1.2　螺旋藻多糖的传统提取方法
称取 100 g 螺旋藻粉 , 加入 800 m L95%乙醇 ,浸
泡过夜;3 600 r/ min 离心 20 min , 37℃烘干藻粉;按
1∶12质量比例加双蒸水 , 用 NaOH 将溶液 pH 值调
至 10;80℃水浴 6 h;3 600 r/ min 离心 30 min , 取上
清 ,加 10%盐酸将上清液 pH 值调至 7.0 , 后逐滴加
入5%三氯乙酸沉淀蛋白 , 4℃过夜;3 600 r/ min 离心
20 min ,上清再加 5%三氯乙酸沉淀蛋白 , 静置 3 h;
3 600 r/min 离心 20 min ,上清加 5 倍体积 95%乙醇
沉淀多糖 , 4℃过夜;3 600 r/ min 离心 20 min , 取沉
淀 ,用丙酮洗涤沉淀两次 , 冷冻干燥。
1.3　正交实验设计
作者选取了实验中的提取液 pH 值 、提取温度及
提取时间 3 个因素 ,并相应地对每一因素各自选取了
3 个水平:提取液 pH 值的第 1 , 2 , 3 水平分别取 10 ,
11 , 12 , 提取温度分别取 70 , 80 , 90℃, 提取时间分别
取 4 , 6 , 8 h , 即 3 因素 3 水平实验。由于是 3 因素 3
水平实验且 3 个因素间无交互作用 , 而正交表 L9
(34)是 3 水平表并可安排 4 个因素 ,且只需做 9 次试
验 ,故选 L9(34)比较合适。正交表 L9(34)中 ABCD
分别代表 4 个无交互作用的不同因素 , ABCD4 列中
的数字分别代表该列所填因素的相应水平 , 每一行
就是一个实验方案 , 共 9 次实验[ 18] 。 现只需将提取
液 pH 值 、提取温度和提取时间 3 因素随机分布到
ABCD4个因素中的 3 个 , 另一列作为空列即可。本
文设计为:A 代表提取液 pH 值 , B 代表提取温度 , C
代表提取时间 , D 作为空列。则正交表设计见表 1。
表 1　实验设计的正交表
Tab.1　The orthogonal table designed in the experiment
实验
序号
提取液
pH 值
提取温
度(℃)
提取时
间(h)
空列
(水平)
1 10 70 4 1
2 10 80 6 2
3 10 90 8 3
4 11 70 6 3
5 11 80 8 1
6 11 90 4 2
7 12 70 8 2
8 12 80 4 3
9 12 90 6 1
1.4　提取生物指标的测定
1.4.1　提取率的测定
提取率=(所得样品质量∕螺旋藻粉质量 )×
100%
1.4.2　样品糖含量的测定(苯酚-硫酸法[ 19])
标准曲线的制作:吸取葡萄糖标准溶液(40 mg/ L)
0 , 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0 , 1.2 , 1.4 , 1.6 , 1.8 m L , 各加蒸
馏水补至 2.0 mL ,然后加入 6%苯酚 1.0 mL 及浓硫
酸 5.0 mL ,静置 10 min , 摇匀 ,室温放置 20 min 后于
490 nm 测吸光度(A)。以糖质量浓度(mg/ L)为横坐
标 , 吸光度(A)为纵坐标 , 作标准曲线。
样品糖含量的测定:用蒸馏水将样品配成一定浓
度的溶液(使糖质量浓度尽量接近葡萄糖标准溶液的
质量浓度 40 mg/ L 为宜 ,分别称取 1 ～ 9 号实验的糖
样品 , 称取的质量依次为 9.0 , 9.4 , 10.8 , 11.0 , 11.2 ,
9.0 , 8.8 , 9.1 , 9.1 mg。本实验中 1 , 2 , 6 , 7 , 8 , 9 号样
品均用蒸馏水在200 m L容量瓶中定容至 200 mL , 3 ,
4 , 5 号样品均用蒸馏水在 250 mL 容量瓶中定容至
250 mL),精密吸取样品溶液 1.6 m L ,置于 10 mL 比
色管中 , 加蒸馏水补足至 2.0 m L。空白同此。 样品
管和空白管中加入 6%苯酚溶液 1.0 m L , 摇匀 , 迅速
加入浓硫酸 5.0 mL ,静置 10 min , 摇匀 , 室温放置 20
min 后于 490 nm 测吸光度(A)。
多糖质量分数(%)=[ A490值查标准曲线所得糖
质量浓度(mg/ L)×样品稀释倍数(1.25)×样品的定
容体积(mL)] ∕[ 所测样品的用量(mg)×1 000] ×
100%
1.4.3 　样品蛋白含量的测定(考马斯亮蓝 G-250
法[ 20])
标准曲线的制作:吸取牛血清白蛋白标准溶液
(100 mg/ L)0 , 0.2 , 0.4 , 0.6 , 0.8 , 1.0 m L , 各加蒸馏
水补至 1.0 mL ,然后各加入考马斯亮蓝 G-250 溶液
5.0 mL , 摇匀 ,室温放置 5 min后于 595 nm 测吸光度
(A)。以蛋白质量浓度(mg/ L)为横坐标 , 吸光度(A)
为纵坐标 , 得标准曲线。
样品蛋白含量的测定:用蒸馏水将样品配成一定
浓度的溶液(应用苯酚-硫酸法中所配制的样品溶液
即可),精密吸取样品溶液 0.6 mL ,置于 10 mL 比色
管中 , 加蒸馏水补足至 1.0 mL 。空白同此。样品管
和空白管中各加入考马斯亮蓝 G-250 溶液 5.0 mL ,
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摇匀 ,室温放置 5 min 后于 595 nm 测吸光度(A)。
蛋白质量分数(%)=[ A595值查标准曲线所得蛋
白质量浓度(mg/ L)×样品稀释倍数(1.67)×样品的
定容体积(m L)] ∕[所测样品的用量(mg)×1 000] ×
100%
2　结果
苯酚-硫酸法标准曲线中糖质量浓度依次为:8 ,
12 , 16 , 20 , 24 , 28 , 32 , 36 mg/ L , 相对应的 A490依次
为:0.094 , 0.129 , 0.163 , 0.192 , 0.239 , 0.269 , 0.293 ,
0.331(空白为 0)。标准曲线见图 1。
图 1　苯酚-硫酸法的标准曲线
Fig.1　Standard cu rve of phenol-sulfuric acid method
　　考马斯亮蓝 G-250 法标准曲线中蛋白质量浓度
依次为:20 , 40 , 60 , 80 , 100 mg/ L , 相对应的 A595依次
为:0.216 , 0.338 , 0.466 , 0.611 , 0.762(空白为 0)。
标准曲线见图 2。
图 2　考马斯亮蓝 G-250法的标准曲线
Fig.2 　 Standard curve of coomassie brilli an t blue
G-250 meth od
依照表 1所设计的正交表实验序号 , 1 ～ 9 号 9
次实验每次均取 20 g 螺旋藻粉 , 所提取的螺旋藻多
糖样品质量依次为:0.46 , 0.66 , 0.90 , 0.30 , 0.52 ,
0.74 , 0.24 , 0.32 , 0.60 g 。
2.1　提取率 、样品糖含量和蛋白含量的测定
结果
　　依照前述提取率 、糖含量和蛋白含量的测定方
法 , 1～ 9 号样品各指标测定结果见表 2。
表 2　样品各生物指标的测定结果
Tab.2　The resul ts of A490 , A595 , extraction rate , total carbohydrate contents and protein contents of samples
生物指标 样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A490 0.170 0.192 0.182 0.203 0.219 0.222 0.256 0.258 0.265
A595 0.057 0.056 0.051 0.048 0.046 0.044 0.039 0.036 0.035
提取率(%) 2.300 3.300 4.500 1.500 2.600 3.700 1.200 1.600 3.000
糖质量分数(%) 47.870 52.335 53.401 59.375 63.275 63.920 73.579 74.206 76.343
蛋白质量分数(%) 12.227 11.221 9.566 7.835 6.676 5.632 3.165 1.556 1.055
2.2　提取率 、样品糖含量和蛋白含量的极差
分析结果
　　对提取率 、糖含量和蛋白含量进行极差分析 , 结
果见表 3。
由表 3 极差分析可知 , 对提取率而言 , 提取液
pH 值 、提取温度及提取时间的极差分别为 1.434 ,
2.066 , 0.234 , 温度对提取率影响最大 , pH 值次之 ,
时间对提取率影响最小。最佳提取条件为提取液
pH 为 10 , 提取温度为 90℃, 提取时间为 8h;对糖含
量而言 ,提取液 pH 值 、提取温度及提取时间的极差
分别为 23.400 , 4.387 , 1.527 , pH 值对糖含量影响最
大 , 温度次之 ,时间对糖含量影响最小。最佳提取条
件为提取液 pH 为 12 ,提取温度为 90℃,提取时间为 8 h;
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表 3　提取率 、样品糖含量和蛋白含量极差分析
Tab.3　The range analysis of extraction rate , total carbohydrate contents and protein content
实验 提取液 pH 温度(℃) 时间(h) 空列(水平) 提取率(%) 糖质量分数(%) 蛋白质量分数(%)
1 10 70 4 1 2.30 47.870 12.227
2 10 80 6 2 3.30 52.335 11.221
3 10 90 8 3 4.50 53.401 9.566
4 11 70 6 3 1.50 59.375 7.835
5 11 80 8 1 2.60 63.275 6.676
6 11 90 4 2 3.70 63.920 5.632
7 12 70 8 2 1.20 73.579 3.165
8 12 80 4 3 1.60 74.206 1.556
9 12 90 6 1 3.00 76.343 1.055
均值 1 a 3.367 1.667 2.533 2.633
均值 2 a 2.600 2.500 2.600 2.733
均值 3 a 1.933 3.733 2.767 2.533
极差 a 1.434 2.066 0.234 0.200
均值 1 b 51.309 60.275 61.999 62.496
均值 2 b 62.190 63.272 62.684 63.278
均值 3 b 74.709 64.662 63.526 62.435
极差 b 23.400 4.387 1.527 0.843
均值 1 c 11.005 7.742 6.472 6.653
均值 2 c 6.714 6.484 6.704 6.673
均值 3 c 1.925 5.418 6.469 6.319
极差 c 9.080 2.324 0.235 0.354
注:a 、b 、c分别表示提取率 、样品糖质量分数和蛋白质量分数
对蛋白含量而言 , 提取液 pH 值 、提取温度及提取时
间的极差分别为 9.080 , 2.324 , 0.235 , pH 值对蛋白
含量影响最大 ,温度次之 , 时间影响最小。最佳提取
条件为提取液 pH 为 12 ,提取温度为 90℃, 提取时间
为 8h , 此时蛋白含量最小。
2.3　提取率 、样品糖含量和蛋白含量的方差
分析结果
　　由表 4 提取率方差分析可知:提取温度对提取率
影响极显著 ,提取液 pH 值对提取率影响显著 , 提取
时间对提取率影响不显著。三个因素的 F 比分别为
51.450 , 108.117 , 1.450 , 则温度对提取率影响最大 ,
pH 值次之 , 时间影响最小 ,与极差分析一致。
表 4　提取率方差分析
Tab.4　The variance analysis of extraction rate
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
提取液 pH 3.087 2 51.450 显著
提取温度 6.487 2 108.117 极显著
提取时间 0.087 2 1.450
误差 0.06 2
注:F0.05(2 ,2)=19.0 , F0.01(2 ,2)=99.0
由表 5样品糖含量方差分析可知:提取液 pH 值
对样品糖含量影响极显著 ,提取温度对样品糖含量影
响显著 , 提取时间对样品糖含量影响不显著。三个因
素的 F 比分别为 620.425 , 22.749 , 2.647 , 则 pH 值
对糖含量影响最大 ,温度次之 , 时间影响最小 ,与极差
分析一致。
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表 5　样品糖含量方差分析
Tab.5　The variance analysis of total carbohydrate contents
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
提取液 pH 822.683 2 620.425 极显著
提取温度 30.165 2 22.746 显著
提取时间 3.510 2 2.647
误差 1.33 2
注:F0.05(2 ,2)=19.0 , F0.01(2 ,2)=99.0
由表 6 样品蛋白含量方差分析可知:提取液 pH
值对样品蛋白含量影响极显著 , 提取温度对样品蛋
白含量影响显著 , 提取时间对样品蛋白含量影响不
显著。三个因素的 F 比分别为 522.262 , 34.278 ,
0.460 ,则 pH 值对蛋白含量影响最大 , 温度次之 , 时
间影响最小 ,与极差分析一致。
表 6　样品蛋白含量方差分析
Tab.6　The variance analysis of protein contents
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性
提取液 pH 123.776 2 522.262 极显著
提取温度 8.124 2 34.278 显著
提取时间 0.109 2 0.460
误差 0.24 2
注:F0.05(2 ,2)=19.0 , F0.01(2 ,2)=99.0
3　讨论
综合以上三个指标的正交实验分析结果可知:
提取液 pH 为 12 、提取温度为 90℃、提取时间为 8 h
的提取条件可使样品的糖含量及蛋白含量达到最佳
效果;但对于提取率而言 , pH 为 10 、温度为 90℃、时
间为 8 h 时才能达到最佳提取效果。故作者对此两
个提取条件又进行了比较验证:(1)pH 为 12 , 温度
为 90℃,时间为 8 h 做 3 次平行实验 , 所提取样品质
量依次为 0.63 , 0.62 , 0.60 g , 则提取率为(3.10±
0.1)%。3 次实验均取 8.8 mg 样品 , 用蒸馏水在
200 mL容量瓶中定容至 200 mL , 依照前述方法 , 测
得 490 nm 和 595 nm 的吸光度分别为 0.272 , 0.274 ,
0.275;0.034 , 0.034 , 0.034 , 最终测得糖质量分数与
蛋白质量分数分别为(81.79±0.7)%, 0.57%。(2)
pH 为 10 , 温度为 90℃, 时间为 8 h 这正是表 1 所设
计的正交表中的 3 号实验:提取率为 4.50%, 糖质量
分数与蛋白质量分数分别为 53.401%, 9.566%。二
者相比之下 , pH 为 12 、温度为 90℃、时间为 8 h 是更
佳的实验条件。传统实验条件是 pH 为 10 、温度为
80℃、时间为 6 h , 即是表 1所设计的正交表中的2 号
实验:提取率为 3.30%, 糖质量分数与蛋白质量分数
分别为 52.335%, 11.221%。由于提取多糖时藻体
中的蛋白质也被提取 ,蛋白质的提取可引起细胞结构
的破坏 , 这有利于多糖的提取 , 碱性越强越利于蛋白
质的提取并且螺旋藻多糖在水中的溶解度随温度上
升而升高 , 故优化后的实验条件 pH 为 12、温度为
90℃既可使螺旋藻多糖从细胞中充分释放充分溶解 ,
高温下又可使蛋白易变性被沉淀 ,导致样品糖含量明
显高于传统条件而蛋白含量又明显低于传统条件。
糖含量明显提高而蛋白含量又明显降低使得多糖中
杂质减少 , 故较传统条件提取率稍偏低。提取时间对
实验结果无显著影响 , 8h 已可使提取过程达到平衡。
再次相比之下 ,可知条件优化后实验效果要明显优于
传统实验条件 , 故确定 pH 为 12 、温度为 90℃、时间
为 8 h 是最佳实验条件。
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Study on the extraction technology of polysaccharides from
Spirulina platensis ———the optimized TCA method by Orthogo-
nal design
SUN Yuan-zheng , ZHANG Xue-cheng , JI Lei
(Colleg e of Marine Life Sciences , Ocean Univer sity of China , Qingdao 266003 , China)
Received:Mar., 10 , 2005
Key words:polysaccharides from Sp irul ina p la tensi s;TCA;Orthogonal design
Abstract:The ex tr action techno lo gy o f polysaccha rides from S pirulina p latensis by r emoving pro tein w ith
TCA w as studied in this ar ticle , the or thogona l design w as em ployed to test the effects o f the three facto rs in-
cluding pH of w ater , temperature of ext raction and time of ex traction on the ext raction rate , to tal ca rbohydrate
contents and pro tein contents of polysaccharide s from S .p latensis and optimize the three factor s.The final r e-
sult indicated tha t the optimum pH of w ater , tempera ture and time o f e xtr action were 12 , 90℃ and 8h , under
this optimum condition the fractim of poly saccharide gained from S .p latensis w as a w hite pow de r , the ext rac-
tion ra te , the fr action of carbohydra te contents and f raction of pr otein contents we re 3.10%, 81.79% and
0.57%.
(本文编辑:张培新)
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