全 文 ：螺旋藻多糖抗癌作用的实验研究
曲显俊　崔淑香　解砚英　侯金玲　周玲　董强
(山东省医学科学院药物研究所 ,济南　 250062)
摘要　本实验对螺旋藻多糖的抗癌作用进行了体内外实验研究和作用机理探讨。以 0. 3～ 1. 5g· L-1对 B37乳
腺癌细胞的抑制率最高可达 68. 0% ,对 K562白血病细胞抑制率为 46. 0% ,对两细胞的 IC50分别为 1. 48和
1. 56g· L-1。 当螺旋藻多糖以 300, 150和 75mg· kg-1灌胃给药时 ,对小鼠 S180肉瘤的抑瘤率分别为 55. 2% ,
44. 6%和 33. 8% ;对 H22小鼠肝癌的抑瘤率分别为 47. 1% , 36. 4%和 31. 0% ;对 EAC小鼠腹水癌的抑瘤率分
别为 56. 9% , 44. 7%和 22. 8% ,同时具有明显提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用。 以 M T T法检测螺旋
藻多糖的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对 NK细胞活性的影响 ,也显示具有提高淋巴细胞转化率和促进 NK细
胞杀伤靶细胞的作用。测定螺旋藻多糖对脾淋巴细胞 TNF-α诱生作用 ,大剂量组上清液可达 75× 10-3 IU· L-1
(对照组 34× 10-3 IU· L-1 ) ,并有较好的剂量 -效应关系。 PSP治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产生白细胞介素
-2( rIL-2)的功能增强。另外 ,口服螺旋藻多糖还具有一定提升或恢复因使用环磷酰胺所致动物外周血白细胞
降低的作用。
螺旋藻多糖具有广泛的生物学活性。以往研究多集中于抗衰老 ,提高免疫作用等方面。 近年来其在抗肿
瘤方面的作用又引起了人们的重视。 由于它是天然化合物 ,且具有无毒 ,高效的特点 ,明显不同于常用细胞毒
类抗癌药 ,因此 ,有必要系统地研究其抗癌疗效和作用机理。 本文以钝顶螺旋藻提取多糖并对该多糖在体内
外的抗癌活性和作用机理进行了研究。
关键词　螺旋藻多糖 ,抗癌作用 ,免疫作用
ANTITUMOR STUDIES ON THE POLYSACCHRIDESSP IRULINA
PLATENSIS
Qǜ Xianjun, Cui Shuxiang , Xie Yanying, Hou Jinling , Zhou ling , Dong Qiang
(Dept . Pharmacology , Institute of Medica Materia , Shandong Academy of Medical Science ,
J inan 250062)
ABSTRACT　 The anti tumo r ef fects o f polysacch rides Spirulina Platensis ( PSP) w ere stud-
ied in vivo and vi tro. In vitro tests, the highest inhibi ted rates on B37 mamma carcinoma cells
and K562 leukemic cells w ere 68. 0% and 46. 0% respectiv ely when the concentra tion w as
0. 3～ 1. 5g· L-1 . In viv o tests, when the dosage w ere 300, 150, and 75mg· kg-1 p. o , the inhib-
ited rates w ere 55. 2% , 44. 6% and 33. 8% ; 47. 1% , 36. 4% and 31. 0% and 56. 9% , 44. 7%
and 22. 8% respectiv ely on the t ransplanted tumor cells o f Sa rcinoma 180, H22 Hepatic tumo r
and EAC tumor cells in mice. PSP is bio logical activ ated substance which has widely immune
ef fect. It had the effects o f increasing the w eight of spleen and thymus and o f increasing pro-
lifera tion of activ ated NK cell activi ty and TN F-αlev els f rom 34× 10-3 to 75× 10-3 IU· L-1 and
o f hav ing function o f activ ated splenocyte to produce interleukin-2( r IL-2) in tumo r-bearing
mice. It i s suggested that PSP has the abili ty to inhibi t tumo r and mechanism is part ly to en-
hance immuni ty in tumo r-bearing imce. In addi tion, enhancing o r recovering the number of
WBC which reduced by CTX is also important function in t rea tment of tumo r.
KEY WORDS　 Po lysacchrides Spirulina Platensis ( PSP) , Anti tumo r effect , Immune effect
1　材料
1. 1　螺 旋藻 ( Spirulina platensis )多 糖
( PSP)　作者自己提取 ,白色粉末状结晶 ,纯
度 86. 9% ,将另文发表。
1. 2　动物　 Balb /c小鼠 ,体重 19- 22g ,昆
明种小鼠 ,体重 19～ 22g ,山东医科大学实验
动物中心提供。
1. 3　化学药品和试剂　 r IL-2,每瓶 2×
10 《中国海洋药物》杂志 2000年第 4期 (总第 76期 )
10
6
IU,上海华新生物高新技术公司产品 ,批
号 970305; TN F-α和 TN F-α单克隆抗体 ,由
中国军事医学科学院邦定生物公司提供 ;放
线菌素 D( Actinomycin D) ,每支 5mg , Fluka
产品 ;四甲基偶氮唑盐 ( M TT)和 Co A, Sig-
ma 公司产品 ; 济南假单 胞菌苗 ( Pseu-
domonas J inanese V accine简称 PJV ) , 5-呋
喃氟脲嘧啶 (简称 FT-207) ,齐鲁制药厂产
品 ; 96孔培养板 , N UNCLON公司产品。
1. 4　肿瘤细胞株　 S180小鼠肉瘤 ; HepA小
鼠肝癌 , EAC小鼠腹水瘤 , B37乳腺癌细胞 ,
K562白血病细胞 , L929 TN F敏感细胞 , CT LL-
2 r IL-2依赖细胞均由本室保存。
1. 5　仪器　 DG 3022A型酶联免疫检测仪 ,
南京华东电子管厂出品 ; Forma 311型 CO2
孵箱 , Forma公司产品 ; GB 303型电子分析
天平 , M ET TLER公司产品。
2　方法
2. 1　 PSP体外对 B37和 K562细胞的生长抑制
作用观察
分别取对数生长期细胞 ,胰酶消化后以
含 10% FCS的 RPM I 1640培养液稀释细
胞 ,按每孔 10000加入 96孔培养板中 ,每孔
0. 2mL, 4h后加入不同稀释度的 PSP,并以
阿霉素 ( 0. 3mg· L-1 )作阳性对照 ,每个浓度
设 3个复孔 ,置 37℃ 5% CO2孵箱中连续培
养 72h,培养结束前 4h 各孔加入 MT T
10μL( 5g· L-1)。经离心 ,洗涤加入 DM SO充
分震荡混匀后于酶标仪 570nm处测 A值。
2. 2　 PSP对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
无菌取传代后 5d的瘤细胞悬液 ,经生理
盐水稀释计数后调整细胞至 2× 1010～
6× 1010 /L,接种于小鼠右侧腋下部位 ,每只
0. 2mL。次日随机分组 ,每组 10只 ,对照组动
物数为试验组鼠数× 组数 ,分别为 PSP大
剂 量 组 ( 300mg· kg-1 ) 中 剂 量 组
( 150mg· kg-1 ) , 小剂量组 ( 75mg· kg-1 ) ,
FT207对照组 ( 120mg· kg-1 )灌胃给药 ,每只
0. 8mL,每日 1次 ,连续 10d,同时设立 PJV
对照组 ( 20mg· kg-1 ,隔日皮下注射 )。第 11d
处死小鼠取瘤块称重 ,计算抑瘤率 ,脾指数和
胸腺指数。
2. 3　 PSP促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化实
验 [1, 2 ]
取 Balb /c小鼠按上述方法接种 S180瘤细
胞并分组给药 10d。 无菌取脾制成单细胞悬
液 ,经 NH3 CI-Tris溶解、 Hank′s液洗涤红
细胞后以含 10% FCS的 RPM I 1640培养基
调整细胞浓度 1× 1010 /L,加入 96孔板中 ,每
孔 0. 1mL,设加 CoA ( 0. 1mL, 10mg· L-1 )孔
和不加 Co A(加 0. 1mL培养基 )对照孔 ,置
5% CO2 37℃孵箱中培养 72h,同 2. 1测 A值 ,
以各组加 CoA孔 OD值与不加 CoA对照孔
A值比较 ,计算淋巴细胞转化率。
2. 4　 NK细胞活性测定 [1, 2 ]
同 2. 3处理动物和制备脾细胞。 取经
Co A激活 72h的脾细胞作效应细胞 ,洗去
Co A后 ,调整细胞浓度至 1× 1010 /L,每孔
0. 1mL, 入培养板中 ,即每孔 1× 106 ,另取
K56 2细胞作为靶细胞 ,每孔加入 2× 108 /L,效
应细胞 ,靶细胞= 50: 1与上述不同药物处理
的脾细胞作混合培养 10h。同 2. 1测 A值 ,以
各组混合培养孔 A值减去该组效应细胞培养
孔 A值 ,并与靶细胞孔 A值之比得杀伤率
(% )。
2. 5　 PSP对荷瘤小鼠 TNF-α的诱生作用测
定 [3、 4 ]
2. 5. 1　 TN F-α的诱生
动物分组及治疗方法同 2. 4制备培养脾
细胞上清液。
2. 5. 2　制备 TN F-α标准曲线及各组上清液
测定
以 96孔培养板加入不同浓度的 TN F-α
标准品 50μL(终浓度分别为 20× 10-3 , 40×
10
-3
, 60× 10-3和 80× 10-3 IU· L-1 ) ,制定标准
曲线。在另一区域 ,加入不同浓度的各组脾细
胞诱导上清液 50μL,共同加入终浓度为 1mg
· L 的 Act-D 50μL,最后加入 L929细胞
50μL,置 37℃ , 5% CO2孵箱中孵育 20h。
2. 5. 3　 TN F-α中和试验
按 ( 2. 5. 3)方法在 96孔板中加入不同稀
释浓度的 TN F-α单克隆抗体 50μL(终浓度
1mg· L-1 ) ,混匀置 37℃ 5% CO2 孵箱中。
45min后再依次加入 Act-D和细胞 ,同上培
11《中国海洋药物》杂志 2000年第 4期 (总第 76期 )
养 20h。 同 2. 1测 A值。
2. 6　 PSP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞 r IL-2水
平的影响 [3、 4 ]
2. 6. 1　 r IL-2诱生
动物处理方法同 2. 3制备脾细胞悬液 ,
培养基稀释至 5× 109 /L,加入 24孔板中 ,每
孔 1mL,再加入含 CoA的培养液 1m L
( 5mg· L-1 ) ,置 37℃ , 5% CO2的孵箱中培养
24h,取上清液离心后 -20℃备用。
2. 6. 2　标准 rIL-2活性的标定及各组诱导
上清液的测定
将 CTLL-2依赖细胞洗涤 2次后稀释至
4× 109 /L,接种于 96孔培养板中 ,每孔 0.
1ml(含 4× 108 /L ) ,然后加入不同稀释浓度
rIL-2的培养基 0. 1mL及待测上清 0. 1mL,
置 37℃ , 5% CO2孵箱中培养 48h。培养结束
同上处理测 A值。以细胞最高存活孔 A值为
100% ,计算各稀释浓度及待测样品稀释浓度
的细胞存活率 ,并以各稀释度对数值为横坐
标 ,以细胞存活率为纵坐标 ,做每个样品及标
准品的剂量反应曲线 ,通过曲线回归 ,计算
50%细胞存活率对应的稀释度 ,以其倒数表
示本次试验条件下的实验单位 ( LU ) ,再按下
式计算每个测定样品的参考单位 ( RU )。
参考单位 ( RU ) = 样品的 LU标准品的 LU×标准品
RU ( IU /ml )
2. 7　 PSP对小鼠外周血白细胞的影响
　　取昆明种小鼠 ,一次性皮下注射 CTX
80mg· kg-1。第 3d尾静脉取血检查随机分
组 ,灌胃给药 10d后取血查外周血白细胞。
3　结果
3. 1　体外 PSP在 0. 3～ 1. 5g· L-1时对 B37
和 K562白血病细胞的最大抑制率分别为
68. 0%和 46. 0% (见图 1) ,对两细胞的 IC50
分别为 1. 48和 1. 56g· L-1 ,显示 PSP体外
直接抑制细胞作用较弱。
图 1. PSP体外对 B37和 K562细胞的抑制作用
3. 2　 PSP在 75～ 300mg· kg-1的剂量范围
对小鼠 S180肉瘤 , EAC小鼠腹水瘤和 H22小
鼠肝癌均有一定的抑制作用 ,其中对 S180肉
瘤抑制作用较强 ,实验结果平均在 33. 8% ～
55. 2%之间 ,对 H22的抑瘤率为 31. 0% ～
47. 1% ,对 EAC腹水瘤的抑制率为 22. 8%
～ 56. 9%。 同时对荷瘤小鼠具有明显增加脾
指数和胸腺指数的作用 ,不伴有降低体重或
其他毒副作用 ,见表 1。
表 1　 PSP对 S180, HepA和 EAC小鼠肿瘤抑制作用结果 (% , x-± s )
组别
S180 Hep A EAC
抑瘤率 脾指数 胸腺指数 抑瘤率 脾指数 胸腺指数 抑瘤率 脾指数
对照组
大剂量
中剂量
小剂量
FT207
PJV
　
55. 2
44. 6
33. 8
56. 5
35. 2
0. 61± 0. 13
0. 88± 0. 14
0. 95± 0. 15
0. 75± 0. 16
0. 65± 0. 16
1. 10± 0. 03
0. 40± 0. 14
0. 72± 0. 12
0. 56± 0. 10
0. 48± 0. 07
0. 37± 0. 04
0. 81± 0. 03
　
47. 1
36. 4
31. 0
63. 1
41. 2
0. 66± 0. 15
1. 06± 0. 16
1. 12± 0. 09
0. 80± 0. 05
0. 63± 0. 13
1. 15± 0. 09
0. 38± 0. 12
0. 57± 0. 08
0. 52± 0. 11
0. 45± 0. 03
0. 31± 0. 07
0. 78± 0. 03
　
56. 9
44. 7
22. 8
39. 0
47. 2
0. 56± 0. 13
0. 89± 0. 06
0. 80± 0. 01
0. 67± 0. 07
0. 48± 0. 12
0. 94± 0. 14
P < 0. 05　 v s对照组
3. 3　 PSP具有明显促进荷瘤 Balb /c小鼠脾
淋巴细胞转化作用 (见图 2)并有较好的剂量
-效应关系。
3. 4　 PSP能促进荷瘤小鼠脾 NK细胞对靶
12 《中国海洋药物》杂志 2000年第 4期 (总第 76期 )
细胞的细胞毒作用 (图 3) , S180荷瘤对照组小
鼠脾 NK细胞活性明显低于正常对照组。
图 2　 PSP对荷瘤小鼠淋巴细胞转化率的影响 (% )
图 3　 PSP对荷瘤小鼠 N K细胞活性的影响
3. 5　 PSP对小鼠脾淋巴细胞 TN F-α活性的
诱导作用 , TNF-α活性与 L929敏感细胞的生
存关系见图 4,得到各对应组脾淋巴细胞
TN F-α的浓度 ,并由 TN F-α单克隆抗体中
和实验得到证实 ,见表 2。
图 4　 TN F-α活性与 L929细胞存活率之间的关系
表 2　各组小鼠脾淋巴细胞培养上清 TN F-α测定结果
组别 TNF-α( IU /ml)
TN F-α单抗中和前 TNF-α单抗中和后
对照
S180对照
大剂量
中剂量
小剂量
PJV
34
24
75*
63*
42*
54*
0
0
20
22
0
18
* P < 0. 05　 v s S180对照组 , P < 0. 05　 v s正常对照
组
3. 6　 PSP治疗后各剂量组脾细胞 r IL-2水
平见图 4,计算方法参考图 5。
A　正常对照　 B　 S180对照　 C　小剂量组　 D
　中剂量组　 E　大剂量组　 F　 PJV对照组　*
P < 0. 05　 v s　 B组
图 5　 PSP对荷瘤小鼠 IL-2水平的影响
图 6　 IL-2与细胞存活率之间的关系及 IL-2计算方法
3. 7　 PSP具有明显升高小鼠外周血白细胞
的功能 ,同时不同程度的增加脾指数和体重
作用 ,见表 3。
13《中国海洋药物》杂志 2000年第 4期 (总第 76期 )
表 3　 PSP对各组小鼠外周血白细胞的提升作用
组别 体重 ( g ) 脾指数 (% ) 胸腺指数 (% ) WBC(× 109 /L)
正常对照
对照
大剂量
中剂量
小剂量
P. J. V.
23. 45± 1. 07
18. 26± 1. 14*
22. 38± 1. 46
21. 00± 1. 11*
20. 15± 1. 63*
19. 20± 1. 82*
0. 72± 0. 30
0. 49± 0. 16*
0. 80± 0. 18
0. 71± 0. 24
0. 65± 0. 15
1. 04± 0. 10
0. 43± 0. 09
0. 22± 0. 16*
0. 45± 0. 18
0. 48± 0. 14
0. 40± 0. 20
0. 42± 0. 26
10. 74± 0. 85
7. 31± 0. 92*
9. 83± 1. 60
9. 87± 1. 21
8. 74± 1. 12*
7. 88± 0. 87*
　* P < 0. 05　 vs　正常对照组
3　讨论
对螺旋藻多糖的研究已有报道 ,以往的
研究多集中于螺旋藻抗衰老 ,提高免疫功能
等保健方面 ,少有直接观察其抗癌作用及机
理的研究。本实验中 ,以 PSP 75mg时即有较
明显的抑瘤作用 ,并有剂量效应关系。这种抗
癌作用的特点是不伴有明显的毒副作用 ,还
能治疗或预防 CTX对外周血白细胞的毒性
作用。有报道 PSP有治疗放射线对正常细胞
的毒性作用 [5、 6 ] ,显然 ,这种独特的双重作用
有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。 PSP体
外对肿瘤细胞的直接抑制作用较弱 ,虽然刘
力生也观察到其对肿瘤细胞 DNA, RN A和
蛋白质有一定的抑制作用 ,但是报道结果差
异较大 ,还需进一步证实 ,结合本实验观察到
的现象 ,说明 PSP对肿瘤细胞的直接杀伤或
抑制并不起主要作用。
目前认为 ,肿瘤所引起的免疫反应的增
强和减弱的变化过程 ,虽然在一定条件下 ,肿
瘤越大对机体免疫系统的刺激越强 ,但是 ,荷
瘤小鼠脾活性的淋巴细胞增殖能力却显著下
降 ,也可以认为是肿瘤抑制了机体的免疫力。
本实验荷瘤小鼠对照组动物免疫活性显著下
降也说明这个问题 ,因而提高机体免疫学水
平是抗癌作用的主要机理之一。 在证实 PSP
具有良好抗癌效果的基础上 ,探讨了 PSP增
强荷瘤动物免疫活性的作用机理。首先观察
了 PSP对两个主要免疫学器官脾脏和胸腺
的增重作用 ,并显示呈剂量依赖性关系 ,说明
确与抑瘤作用有关。经体外对脾细胞以 CoA
刺激后转化率升高 ,这是提高机体特异与非
特异免疫学作用的基础。
越来越多的证据表明: N K细胞在机体肿
瘤非特异免疫中具有重要作用 ,有直接细胞
毒作用和分泌淋巴因子功能 [7、 8 ]。本实验荷瘤
小鼠体内 NK细胞活性显著降低 ,而经 PSP
治疗组均不同程度地提高 NK细胞活性 ,并与
瘤重的大小一致。白细胞介素-2也是参入提
高机体免疫应答的核心物质 ,尤其增加对细胞
毒 T淋巴细胞 , N K细胞和 LAK细胞等使其
杀伤活性增加 ,进而清除体内癌细胞。 PSP增
强 r IL-2活性的还可能增进抗体和干扰素的
分泌 , T细胞受到激活也能提高 TN F-α的水
平。PSP促进荷瘤小鼠分泌 TN F,无疑是提高
抗肿瘤活性的基础 ,其功能除具有直接杀伤肿
瘤细胞外 ,也能增强 NK细胞活性 ,刺激 T淋
巴细胞诱导γ-干扰素和淋巴因子的分泌 ,调
节 MHCⅡ型抗原的表达等功能 ,所以 , TN F
与其他淋巴因子 ,可溶性免疫分子之间互相诱
生 ,共同参与肿瘤免疫调节作用 [9～ 11 ]。本实验
提示 PSP主要是通过增强和恢复机体的免疫
网络功能来达到杀灭肿瘤细胞的。肿瘤的放射
治疗和化学治疗都存在着抑制机体免疫功能
等严重的毒副作用 , PSP在具有良好抑瘤效
果的同时 ,还具有较强地逆转或弥补这些药物
的不足之功能 ,适合于联合用药 ,所以 , PSP
在免疫化疗中有相当好的应用前景。
参考文献
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14 《中国海洋药物》杂志 2000年第 4期 (总第 76期 )