全 文 ：·生物技术 · 北方园艺 2011(14):116～ 119
第一作者简介:李建民(1964-),男 ,教授, 现从事植物生物技术方
面的教学与研究工作。 E-mail:Beyond 3862740@163.com。
基金项目:科技部国家科技支撑计划资助项目(2006BAI06A15-
13);吉林省自然科学基金资助项目。
收稿日期:2011-04-19
龙牙楤木体细胞胚胎发生的细胞组织学研究
李建 民1 , 张 　程2 , 马玉林1 , 李喜 文3
(1.青海师范大学 生命与地理科学学院 ,青海西宁 810008;2.安徽科技学院 ,安徽凤阳 233100;
3.东北师范大学遗传与细胞研究所,吉林长春 130024)
　　摘　要:以龙牙楤木幼芽为外植体 ,在改良 MS培养基上以体细胞胚胎发生获得了再生植株
并对其发生过程进行了组织切片和扫描电镜观察。结果表明:龙牙楤木体细胞胚胎发生为典型
的单细胞起源。其胚性原始细胞既有内起源 ,又有外起源。
关键词:龙牙楤木;幼芽;组织培养;体细胞胚胎发生;组织细胞学
中图分类号:S 567.1+9　文献标识码:A 　文章编号:1001-0009(2011)14-0116-04
　　龙牙楤木是五加科(Araliace)楤木属(Aralia L)的
一种多年生乔本药用植物 ,又称刺老鸦 ,具有补气 、活
血 、祛风 、利湿 、止痛等功效 。分布于我国东北地区及
朝鲜 、日本 、俄罗斯的西伯利亚地区[ 1] 。其幼嫩茎叶作
为有名的山菜 ,倍受我国及东南亚一些国家的青睐。
对该植物的组织培养和体细胞胚胎发生再生植株已作
了报道[ 2] 。现对这一过程进行了组织细胞学和扫描电
镜的研究。
1　材料与方法
1.1　试验材料
以野生龙牙楤木(Aralia elata (Miq.)Seem.)的幼
芽为外植体 。
1.2　试验方法
1.2.1　组织培养　秋末取落叶枝条 ,在 23 ～ 25℃室内
水浸。待其休眠芽萌发长出 1 ～ 3 cm的幼芽后剪下 ,用
70%酒精浸泡 30 s ,然后用0.1%HgCl2溶液灭菌 5 min ,
无菌水冲洗3 ～ 4次 ,在无菌条件下将幼芽切成4 mm左
右的切段 ,接种于改良 MS 培养基上。基本培养基为
MS培养基 ,附加 2%蔗糖 、300 mg/L 水解酪蛋白 、0.7%
琼脂 ,pH 5.8 ,添加激素为(1)MS-1培养基:0.5 mg/ L
2 ,4-D+0.5 mg/ L BA+0.5 mg/L NAA;(2)MS-2培养
基:2.0 mg/ L 2 ,4-D+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L NAA;
(3)MS-3培养基:2.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L BA +0.5
mg/L NAA+0.2%活性碳。培养温度为 25℃,每日16 h
光照下培养 ,光照强度为 1 500 ～ 2 000 lx 。
1.2.2　组织解剖学观察　取不同发育时期的愈伤组
织材料 ,用 FAA 液固定 24 h 以上。常规石蜡切片法
制片[ 4] ,切片厚 10 ～ 13 μm。用番红-固绿对染或苏木
精染色 ,中性树胶封片。置于 Olympus-BH2显微镜下
观察并照相。
1.2.3　扫描电镜观察　取不同发育时期的愈伤组织
材料 ,用2.5%的戊二醛室温下固定 4 h ,酒精 、醋酸异
戊酯系列脱水。用日本 HCP-2CO2临界点干燥仪进行
临界点干燥 , IB-3 离子溅射仪镀金处理 , 最后在
HIACHI-S570扫描电镜上观察 、照相。
Study on Miniature Chinese Rose Stem Section Tissue Culture
Rapid Propagation Technical
LIU Hui
(College of Biotechnolo gy and Food Engineering , Anyang Institute of Techno logy , Anyang , Henan 455000)
Abstract:The optimal tissue cultures of miniature Chinese rose stem section were singled out using miniature Chinese
ro se stems as explants , according to the number of bourgeon sprout and cluster buds of successive expanded
reproduction.The results show ed that the optimal nutrient medium induced lateral bud w as MS+6-BA 1.2 mg/L+
NAA 0.05 mg/ L and successive nutrient medium was MS +6-BA 1.0 mg/ L+NAA 0.01 mg/ L.
Key words:miniature Chinese rose stem;tissue culture;6-BA ;NAA
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2　结果与分析
2.1　胚性愈伤组织的形成 、体细胞胚发生的诱导及植
株再生
龙牙楤木幼芽切段接入 MS-1培养基培养 7 d后 ,
在切段切口处开始膨大 ,并形成致密的愈伤组织 ,且生
长旺盛。1个月后继代 1 次 ,愈伤组织颜色逐渐转为
浅黄色 ,组织致密。将其转入 MS-2培养基培养 ,愈伤
组织长势为先快后慢 , 4周后发现愈伤组织表面开始
出现褐化现象 ,同时产生一些表面光滑 、质地紧密 、颜
色略淡的胚性颗粒状结构即胚性愈伤组织 。将这些褐
化的胚性愈伤组织转至含有 0.2%活性碳的 MS-3培
养基上 ,褐化程度被减弱 ,愈伤组织呈黄褐色 ,颗粒状
结构增殖加快 。4周后 ,在其黄褐色愈伤组织表面出
现许多白色或浅褐色的单独或丛生的粒状突起物。将
这些突起物分离下来 ,在实体显微镜下观察 ,发现是正
处于球形期 、心形期 、鱼雷期和子叶期的体细胞胚。继
续培养也可观察到发育成转绿的子叶晚期阶段的体细
胞胚。培养 5 ～ 6周后 ,正常的胚状体很快进一步发育
形成幼小植株。从发育过程看 ,这种体细胞胚的发育
阶段和形态特征与正常合子胚十分相似。统计结果表
明 ,在 MS-3培养基上 ,体细胞胚诱导率为 75%。及时
将幼小植株转移到含 1%活性碳的1/2MS无激素基本
培养基上 ,小植株生长迅速 ,形成具根 、茎 、叶的完整植
株 。1个月后植株高达 5 cm左右 。
2.2　组织解剖学观察
组织切片观察结果表明 ,培养在 MS-1培养基上
的愈伤组织是由正在进行平周分裂的分生组织和周围
薄壁细胞组成 ,其组织外表面呈不规则性状。转移到
MS-2培养基 3周后 ,此时的愈伤组织是由薄壁细胞组
织和胚性细胞团所组成。把这种胚性愈伤组织 ,转移
到 MS-3培养基后 ,发现在愈伤组织内部和愈伤组织
表面均出现了一种圆形的 、单个胚性原始细胞(图 1 、
2)。该细胞的特征是细胞壁加厚 、原生质浓 、细胞核增
大且位于细胞中央和染色较深。位于愈伤组织内部的
胚性原始细胞在进行有丝分裂时首先进行横向分裂 ,
形成2个大小不等的顶细胞和基细胞(图3),即2-细胞
原胚 。之后顶细胞进行 3次分裂形成八分体。基细胞
与八分体一起形成八分体原胚(图4),直至形成多细胞
原胚(图5)。而位于表面的胚性原始细胞先进行垂周
分裂形成 2-细胞原胚(图 6),之后经过多次平周分裂
和垂周分裂形成附着在愈伤组织表面的早期多细胞原
胚(图 7)。以后这些原胚继续发育 ,进入体细胞胚的各
个发育阶段 ,即球形期 、心形期(图 8)、鱼雷期 、子叶期
(图 9)。由图 9可看到子叶期的体细胞胚表现出强烈
的极性并已分化形成叶原基 、顶端分生组织及胚根。
图 1　　　　　　　　　　　　　　　图 2　　　　　　　　　　　　　　　图 3
图 4　　　　　　　　　　　　　　　图 5　　　　　　　　　　　　　　　图 6
2.3　扫描电镜观察
用扫描电镜观察在 MS-1培养基上继代培养 1次
后的愈伤组织表面结构时 ,看到该表面的细胞大部分
由管状细胞组成(图10),较为松散。图 11所示培养在
MS-2培基中胚性分生细胞区域的扫描电镜图象。从
中可以看到该区域主要由球形细胞组成 ,细胞排列紧
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密。另外 ,可看到由分生细胞分裂后形成的二细胞(图
12)和多细胞团(图 13)。当将这些胚性愈伤组织转入
MS-3培养基上培养 3 ～ 4周后 ,可见愈伤组织表面产
生许多胚状体(图 14),继续培养 5 ～ 6周后 ,可见发育
至子叶期的胚状体(图 15)。
图 7　　　　　　　　　　　　　　　图 8　　　　　　　　　　　　　　图9
图 10　　　　　　　　　　　　　　图 11　　　　　　　　　　　　　　图 12
图 13　　　　　　　　　　　　　　图 14　　　　　　　　　　　　　　图 15
　　
3　讨论与结论
对于体细胞胚胎发生是起源于单细胞还是多细胞
集合体 ,一直存在不同看法[ 3-5] 。从近些年的研究报道
看 ,大多数研究结果认为体细胞胚是起源于单细胞
的[ 5-6] 。对该问题的认识是与植物的合子发生联系在
一起。在被子植物发育的特定阶段 ,分化成熟的雌 、雄
配子经过受精作用产生的合子是一个具有本物种植物
的全部遗传信息的特异性细胞。它们单个地游离存在
于胚囊里 ,成为具有全能性的分生细胞。在双子叶植
物合子胚发育过程中 ,合子的第一次分裂往往是横向
分裂 ,表现出细胞的极性化 。形成靠珠孔端的基细胞
和靠合点端的顶细胞。另外 ,也有一些植物的合子纵
向分裂 ,形成 2-细胞原胚 ,表现出细胞分裂轴向对形态
建成的重要影响 。以后经过 4-细胞原胚 、八分体 、多细
胞原胚等各个不同时期发育成的合子胚 。
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在离体培养的体细胞胚发生过程中 ,胚性原始细
胞是在不同培养基和激素等作用下产生的 。该细胞的
特征是细胞壁加厚 、原生质浓 、细胞核大 ,且位于细胞
中央(图 1 、2)。胚性原始细胞在首次细胞分裂时表现
出明显的极性 ,即第一次细胞分裂为不均等分裂。由
于体细胞胚发育的不同步性 ,在一块愈伤组织或一个
胚性复合体中可看到由不同单个胚性细胞分裂形成的
二细胞 、四细胞 、多细胞以及各个不同发育时期的体细
胞胚。体细胞胚的发育过程与整体植物合子胚发育过
程是十分相似的。因此可推测在离体培养过程中 ,体
细胞胚状体的发生是由一个胚性原始细胞开始的 ,是
由单细胞起源的。许多植物的实验也支持了这个观
点 ,如桉树[ 7] 、红豆草[ 8] 、石刁柏[ 9] 等。一些通过原生
质体及悬浮单细胞培养获得体细胞胚的试验 ,也直接
证明胚状体来源于单个细胞 ,如甜菜[ 10] 、石防风[ 11] 、甘
蔗[ 12] 等植物。该研究采用组织切片观察 ,可看到龙牙
楤木的胚性愈伤组织内部或表面均分布一些胚性原始
细胞。在其分裂时 ,具有明显的极性 ,第一次不均等细
胞分裂的轴向与细胞长轴相垂直。分裂后形成了 2个
大小不等的顶细胞和基细胞 ,以后随着细胞逐渐分裂 ,
发育形成了球形胚 、心形胚 、鱼雷胚 、子叶胚等成熟的
体细胞胚 ,表现出有规律的秩序性 。由此可见 ,龙牙楤
木体细胞胚的发生过程与双子叶植物合子胚的发生过
程是十分相似的 ,认为龙牙楤木体细胞胚胎发生为典
型的单细胞起源。其胚性原始细胞既有内起源 ,又有
外起源。
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Cytology and Histology in Somatic Embryogenesis of Aralia elate (Miq.)Seem.
LI Jian-min1 , ZHANG Cheng2 ,MA Yu-lin1 , LI Xi-w en3
(1.College of Life and Geographical Sciences , Qinghai Normal University , Xining , Qinghai 810008;2.Anhui Science and Technolo gy
University , Fengyang , Anhui 233100;3.Institute of Genetics and Cytolog y , Northeast No rmal University , Changchun , Jilin 130024)
Abstract:Explants , excised from the young shoots of Aralia elata (Miq.)and cultured on MS media , were able to
regenerate new plants through somatic embryogensis.Acco rding to the observation of histology and scanning elect ron
microscopy , the results show ed that the origin of somatic embryos w as typical unicellular and its embryonic cells have
two original modes , endogenous origin and exogenous origin.
Key words:Aralia elate(Miq.)Seem.;young shoot;tissue culture;somatic embryogenesis;cytology and histology
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