全 文 ：灰树花紫外诱变育种研究
徐志祥 , 李　刚 , 李宝健
(中山大学生命科学学院∥基因工程教育部重点实验室 , 广东 广州 510275)
摘　要:应用原生质体紫外诱变技术 , 对灰树花菌株 Gr1 进行了紫外诱变处理。经过粗筛和精筛后 , 从 50 株诱
变株中选出两株多糖含量和产量明显优于原始菌株的突变株 Gr1a和 Gr1g , 其产量分别为 1.74%和 1.62%, 多糖
质量含量 (w)分别为 11.67%和 12.01%。经过摇瓶试验以及发酵试验 , 两株诱变菌株 Gr1a和 Gr1g菌丝得率和
多糖含量都很稳定 , 表明所得突变株是比原始菌株更优秀的稳定高产 、 高多糖含量的新菌株。
关键词:灰树花;紫外诱变育种;发酵;
中图分类号:S567.035　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2004)02-0084-04
　　灰树花 Grifola frondosa 是一种珍贵的大型药用
真菌 , 在日 本 俗称 舞茸 。它 隶属 于真 菌 门
Eumycota、 担子菌亚门 Basidiomycotina 、 非褶菌目
Aphyllophorales 、多孔菌科 Polyporaceae 、 多孔菌属
Polyporus
[ 1] 。
大量的药理和临床试验 , 已经证明灰树花的药
效十分广泛 , 且无任何毒副作用。灰树花具有免疫
调节和抗肿瘤作用 , 还可用来治疗肝硬化腹水 、 糖
尿病 、高血压等疾病 。[ 1-5] 。
原生质体诱变技术是一种行之有效的育种新方
法[ 6-8] 。到目前为止 , 在许多生物中 , 原生质体诱
变育种被广泛采用。在丝状真菌中也有许多成功的
报道 , 这为丝状真菌的遗传育种开辟了一条更为有
效的途径[ 9-12] 。
本文利用原生质体诱变技术对灰树花菌种进行
了诱变育种 , 并且对诱变株进行了摇瓶培养试验和
发酵罐试验 , 试图培育出生长更快 、产量和多糖含
量更高的灰树花新菌种。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　灰树花菌种　灰树花菌种 Gr1为本实验室
保存菌种 。
1.1.2　溶壁酶 (Lywallzyme)　购自广东省微生物
研究所。
1.1.3　PDA培养基 (w %)　土豆 20 , 葡萄糖 2 ,
磷酸二氢钾 0.1 , 硫酸镁 0.05。
1.1.4　灰树花再生培养基 　PDA 培养基中加入
0.6 mol L甘露醇 。
1.2　实验方法
1.2.1　灰树花原生质体制备方法　将新鲜的灰树
花菌丝体过滤 , 取适量的菌丝体放于一定浓度的溶
壁酶中 , 在适当温度的水浴中反应 , 每克湿菌丝体
加酶液 1 mL。在酶液作用的不同时间用显微镜检
测原生质体数量。
1.2.2　原生质体诱变方法　取 1.0×106 灰树花原
生质体均匀涂于再生培养基中 , 在紫外线下 (20
W)照射适当时间 , 照射距离为 40 cm , 然后置于
温室避光培养7 d。
1.2.3　菌粉得率计算方法　将诱变菌株切1 cm2 左
右至 100 g PDA 液体培养基中 , 振荡培养 7 d , 过
滤得湿菌丝体 , 烘干称量 , 以 100 g 培养基中得菌
粉干重计算得率。
1.2.4　多糖测定方法　采用硫酸苯酚法测定多糖
含量[ 13] 。
2　结果和分析
2.1　灰树花原生质体制备
采用如下条件制备原生质体 , 温度为 25 ℃,
酶质量分数为 3%, 反应时间为 3 h。用血球计数
板对原生质体进行计数 。制备的原生质体的照片如
图 1所示 。
2.2　原生质体紫外诱变选育优质高产灰树花新菌株
2.2.1　原生质体紫外诱变效应曲线及紫外线诱变
剂量的选择　取 20个 9 cm平皿 , 每皿分别装有新
制备的 106个 mL 的原生质体悬液 5 mL。每两个为
收稿日期:2003-06-13
基金项目:广州市科委重大科技攻关资助项目 (2001_Z_006_01)
作者简介:徐志祥 (1975年生), 男 , 博士;通讯联系人:李宝健;E_mail:xuzhixiang123@163.net
　第 43 卷　第 2 期
2004年　3 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.43　No.2
Mar.　2004 　
图 1　25 ℃ w=3%酶浓度酶解 3 h 条件下
制备的原生质体
Fig.1　The protoplasts after digestion for three hour
at 25 ℃ with w=3% enzyme
1组 , 共分为 10组 。分别照射 0 、 5 、 10 、 15 、 20 、
25 、 30 、 45 、 60 、 150 s , 然后每皿取 1 mL 适当稀
释后涂平板 。平板用黑布包裹后置于黑暗闭光的
28 ℃恒温箱培养 。待平板长出菌落后 , 菌落计数 。
每组以两个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数 。
以照射时间为横坐标 , 以再生菌落数为纵坐标 , 画
出灰树花原生质体紫外诱变剂量效应曲线 , 结果如
图 2所示 。
图2　灰树花原生质体紫外诱变剂量效应曲线
Fig.2　The effect curve of UV mutagenesis dosage
on Grifola frondosa protoplasts
由图2可以看出 , 灰树花原生质体经紫外线照
射后 , 再生菌落数开始减少。在 0 ～ 50 s照射时间
内 , 曲线的变化很剧烈 。50 s以后 , 曲线的下降趋
于平缓 。根据上述结果我们测出灰树花原生质体半
致死率时的照射剂量约为 20 s。
原生质体在紫外诱变后的再生情况如图 3所
示 。
2.2.2　灰树花诱变株的初筛　以 20 s (图 3 (b))
作为照射剂量诱变灰树花原生质体 , 连续诱变 10
图 3　无紫外照射和有紫外照射时再生菌落的情况
Fig.3　Regeneration without UV irradiation and with UV irradiation
(a)无紫外照射;(b)紫外照射 20 s;(c)紫外照射 40 s;(d)紫外照射 70 s
85　第 2 期 徐志祥等:灰树花紫外诱变育种研究
批 , 每批稀释后涂 5个平皿 。将再生的单菌落分别
接种至新的平皿中。原生质体诱变后形成的再生菌
落在菌落直径和生长活力方面都有较大差异 , 在新
的平皿中生长的菌株选出 50株菌落直径最大 、 生
长最旺盛的诱变株。
(1)灰树花诱变株的生长比较。将 50株诱变株
每株接两个斜面和两个三角瓶培养 , 26 ℃斜面培
养10 d , 测量每天生长的长度 , 计算出菌丝生长速
率 (cm 日)。摇瓶培养按二级发酵方式培养至发酵
终点 , 计算菌丝得率 。综合菌丝生长速率 、 菌丝得
率两项数据 , 从 50 株诱变株中选出最好的 8株 。
根据诱变时的原始批次和编号 , 这 8株菌分别命名
为:Gr1a , Gr1b , Gr1c , Gr1d , Gr1e , Gr1f , Gr1g ,
Gr1h。
(2)高产 、 高多糖质量分数诱变株的获得 。取
上述 8株灰树花诱变株进行摇瓶发酵试验 , 接种量
相同 , 分别记录发酵周期 、菌粉得率并测定其多糖
质量分数。发酵周期以菌丝量不再增加发酵终点判
断标准 。连续进行 3次发酵试验 , 取其平均值 , 结
果如表 1所示 。
根据表 1 结果 , 从中选出发酵周期 、 菌粉得
率 、多糖含量3项指标都优于原始菌株的两株灰树
花诱变株 , 即 Gr1a和 Gr1g 。而且经方差统计分析 ,
其差异具有显著性 。
(3)灰树花诱变株的遗传稳定性试验。鉴于突
变菌株的性状常常不稳定 , 尤其是在连续继代培养
时 。为了检测所得两株灰树花突变株性状是否稳
定 , 我们将上述两株突变株连续转接 6代 , 每代均
进行摇瓶培养 , 结果如表 2所示。
　　由表 2可以看出 , 两株诱变菌株 Gr1a 和 Gr1g
菌丝得率和多糖质量分数都很稳定 , 而且 6批发酵
试验中Gr1a和Gr1g 基本上每次在产量和多糖质量
分数上都显著超过原始菌株 。说明筛选出的这两株
诱变菌种在产量上和质量上都很稳定 。
表 1　8株诱变株的发酵周期 、 菌粉得率和多糖质量分数的比较
Tab.1　The comparison of fermentation cycle , mycelial yield and poly saccharide content of 8 mutants
项目 Gr1a Gr1b Gr1c Gr1d Gr1e Gr1f Gr1g Gr1h 原始菌株
发酵周期 h 180 204 170 240 198 216 160 190 192
菌丝得率 % 1.74 1.16 1.78 1.05 1.32 0.87 1.62 0.79 1.47
w (多糖) % 11.67 12.22 9.66 11.85 8.41 10.23 12.01 7.89 10.05
表 2　Gr1a和Gr1g 连续进行 6代摇瓶培养的菌粉得率和多糖质量分数比较
Tab.2　The comparison of mycelial yield and polysacchride content after 6 continuous shaking bottle culture of Gr1a and Gr1g
项目 1 2 3 4 5 6 平均值
Gr1a菌丝得率 % 1.75 1.59 1.66 1.44 1.72 1.69 1.64
w(Gr1a多糖) % 11.11 12.23 10.55 10.23 11.58 11.76 11.24
Gr1g菌丝得率 % 1.58 1.72 1.44 1.73 1.77 1.64 1.65
w(Gr1g 多糖) % 12.33 11.35 10.90 11.68 12.15 12.21 11.77
3　讨　论
丝状真菌菌丝为多细胞 , 不宜作诱变材料。去
除细胞壁的原生质体对外界环境比较敏感 , 经诱变
剂处理以后容易发生突变 , 而且原生质体诱变技术
一般能保持原有菌种的主要生物学性状特点 , 并且
育种周期短 , 突变株生物学性状比较稳定 , 不易退
化。因此 , 原生质体诱变育种方法已成为当前丝状
真菌育种的一种主要方法 。
诱变法选育菌种工作量较大 , 要筛选到一株性
能优异稳定的菌株 , 需要做大量工作。利用粗筛方
法 , 首先筛选生长旺盛 、 生长速率快的菌株 , 缩小
了筛选范围 , 再利用精筛方法 , 进一步缩小筛选范
围 , 最后对 8株诱变株进行详细 、 系统的研究 , 并
从中筛选到所需菌株。这种筛选方法大大降低了工
作量 , 并且工作效率高 。
本文应用灰树花原生质体作为诱变的材料 , 结
果表明 , 与其他的丝状真菌一样 , 利用这种方法进
行灰树花的菌种改良是可行的。我们用灰树花菌株
Gr1作为出发菌株。采用 20 s作为诱变时间 , 对灰
树花菌株 Gr1 进行了紫外诱变处理 。诱变株 Gr1a
和Gr1g 产量分别为 1.74%和 1.62%, 多糖质量分
数分别为 11.67%和 12.01%。经过 6代 PDA 斜面
继代培养以及摇瓶试验 , Gr1a 和 Gr1g 基本上每次
在产量和多糖质量分数上都明显超过原始菌株 。说
明筛选出的这两株诱变菌种在产量上和质量上都很
86 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷　
稳定 。而且多糖质量分数和产量均高于文献中报道
的的其他灰树花菌种的产量和多糖质量分数 。
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UV Induced Mutagenesis of Grifola frondosa
XU Zhi_xiang , LI Gang ,LI Bao_jian
(Key Laboratory of Genetic Engineering of Ministry of Education ∥
School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:In order to exploit the potential of Grifola frondosas production , a UV induced mutagenesis was carried out
for Grifola frondosa strain “Gr1” using protoplast.By preliminary screening and intensive screening from 50mutants , we
obtained two mutants , production reaching 1.74% and 1.62% and polysaccharides contents reaching 11.67%(w)and
12.01%(w).Results of continued cultivation for 6 generations on PDA slants and subsequent tests of shaking bottles ,
showed that these two mutants are good strains with steady properties , high yield and high content of polysaccharides.
Key words:Grifola frondosa;submerged culture;UV induced mutagenesis
87　第 2 期 徐志祥等:灰树花紫外诱变育种研究