全 文 ：黑种草子不同组分抑制亚硝酸盐积累、血小板聚集和血管收缩的体外
实验研究
章丹丹1， 凌 霜1， 张洪平2， 卞 卡1，3*
(1． 上海中医药大学 穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203;2． 新疆医科大学附属中医医院，新疆
乌鲁木齐 830000;3． 美国乔治华盛顿大学 生物化学与分子生物学系，华盛顿 20052)
收稿日期:2012-09-18
基金项目:国家科技重大专项重大新药创制 (2009ZX09311-003) ;国家自然科学基金青年项目 (81001666) ;上海市教育委员会科研
创新项目 (13YZ048) ;上海高校选拔培养优秀青年教师基金资助项目 (SZY07029)
作者简介:章丹丹 (1980—) ，女，副研究员，研究方向:中药新药开发及机制。E-mail:izhangdd@ 126． com
* 通信作者:卞 卡，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:炎症医学与心血管药理。
摘要:目的 研究黑种草子不同组分对巨噬细胞活化后含亚硝酸盐量、血小板诱导后聚集、离体血管经苯肾上腺素引
起收缩的影响。方法 黑种草子醇提物经萃取分别得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物，后经大孔树脂纯
化分别得到组分Ⅰ (总黄酮类成分)、Ⅱ (总皂苷类成分)和Ⅲ (总多糖类成分) ;组分Ⅳ (总生物碱成分)为黑种
草子经酸水提取后乙醇洗脱乙酸乙酯萃取。以脂多糖和干扰素 γ诱导小鼠巨噬细胞活化引起细胞上清液中亚硝酸盐累
积;以二磷酸腺苷、花生四烯酸、胶原诱导大鼠体外血小板聚集;以苯肾上腺素引起大鼠离体血管收缩，而后考查黑
种草子不同组分对上述指标的影响。结果 组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ抑制亚硝酸盐形成，组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ具有抗血小板聚集作
用，组分Ⅳ具有部分内皮依赖性血管舒张活性。结论 黑种草子Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组分可干预血管系统中炎症的多个环节，
且各有偏重，这是其活血通经药效的物质基础。
关键词:黑种草子;组分;炎症;巨噬细胞;血小板;离体血管
中图分类号:R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)07-1376-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 07． 005
The inhibitory effect of different fractions from Nigellae Semen in vitro on nitrite
accumulation，platelet aggregation and vasoconstriction
ZHANG Dan-dan1， LING Shuang1， ZHANG Hong-ping2， BIAN Ka1，3*
(1． Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China;2． Tradi-
tional Chinese Medical Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 83000，China;3． Department of Biochemistry and Molecular Biology，George
Washington University，Washington，DC 20052，USA)
ABSTRACT:AIM To study the effect of different fractions of Nigellae Semen on nitrite produced from macropha-
ges，platelet aggregation and vasoconstriction． METHODS Three fractionsⅠ-Ⅲ (total flavones，total saponis，total
polysaccharides)of Nigellae Semen were extracted by EtoAc，n-BuOH and water respectively，and then purified with
microporous resin D101． Nigellae Semen was extracted by acid water and then isolated by ethanol to form the Fraction
Ⅳ (total alkaloids )． Nitrite production of activated mouse macrophages by lipopolysaccharide plus IFN-γ was
measured by Griess assay． Rat platelet aggregation was induced by adenosine diphosphate，arachidonic acid and col-
lagen in vitro． The vasodilator effects of four fractions were investigated by isometric tension changes of aortic rings．
RESULTS Fraction Ⅰ (total flavones) ，Ⅱ (total saponis)and Ⅳ (total alkaloids)demonstrated the inhibi-
tion against macrophage nitric oxide (NO)production and platelet aggregation，and only Fraction Ⅳ (total alka-
loids)reduced phenylephrine-induced vasoconstriction of pre-constricted aorta rings dependent on endothelium．
CONCLUSION Fraction Ⅰ，Ⅱ and Ⅳ can work on the multi-nodes during the pathological progress of inflam-
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mation through their properties of inhibition of nitrite accumulation，anti-platelet aggregation and vasodilatation，
which is the basic mechanism of its traditional effect of activating blood to promote menstruation partly．
KEY WORDS:Nigellae Semen;fracions;inflammation;macrophage;platelet aggregation;isolated aorta ring
黑种草子 Nigellae Semen 为瘤果黑种草 Nigella
glandulifera Freyn et Sint． 的干燥成熟种子，始载
于《中国植物志》，别名为斯西旦 (维药名)、色
拉那博 (藏药名)和景郎 (傣药名) ，作为维吾尔
族药收入 1977 年起至今各版 《中国药典》。其性
味甘、辛，温，有补肾健脑、活血通经、解毒利
尿、通乳之功效，还可乌发、抗衰老［1］。黑种草
子具镇痛活性，其水、醇提取物及 α-常春藤皂苷
具有抗肿瘤作用，黑种草子提取油能抑制大鼠血小
板聚集［2-5］。
本实验对黑种草子黄酮类组分、皂苷类组分、
多糖类组分、生物碱类组分进行提取、纯化和初步
的质量控制，并分别评价了其对亚硝酸盐积累、血
小板聚集和血管收缩方面的体外作用。
1 材料和仪器
1. 1 药材 黑种草子购于新疆乌鲁木齐二道桥市
场，由上海市食品药品检验所鉴定为黑种草子
(报告书编号:20080350) ，凭证标本存于上海中
医药大学穆拉德中药现代化研究中心。
1. 2 动物 SD 雄性大鼠，清洁级，220 ～ 250 g，
购自中国科学院上海实验动物中心。动物使用许可
证 号: SYXK (沪 ) 2004-0005， 合 格 证 号:
0026181。大鼠饲养于上海中医药大学动物实验中
心 SPF 级实验动物实验室。小鼠巨噬细胞株
RAW264. 7，购自美国 ATCC公司。
1. 3 试剂 大孔吸附树脂 D101、S-8、H101 均购
自上海文旻生化技术有限公司;二磷酸腺苷
(ADP)、花生四烯酸 (Arachidonic acid)、阿司匹
林 (Acetylsalicylic acid)、噻唑兰 (MTT)、细菌脂
多糖 (LPS)、乙酰胆碱 (Acetycholine，Ach)、去
氧肾上腺素 (Phenylephrine)、Foskolin、Griess 试
剂均购自 sigma。胶原 (collagen)自制。Fetal bo-
vine serum (FBS) ，RPMI-1640 培养基干粉购于
Gibco公司;鼠重组干扰素-γ(IFN-γ) ，Millpore 公
司;其他试剂为国产分析纯。
1. 4 仪器 PowerLab 离体组织灌流和数据采集分
析系统，AD Instruments 公司;SpectraMAX 190 型
酶标仪，Molecular Devices 公司;TYXN—96 多功
能智能血液凝聚仪，上海通用机电技术研究所;
5810 R高速冷冻离心机，Eppendorf公司。
2 方法
2. 1 黑种草子不同组分的制备及测定
2. 1. 1 组分Ⅰ 药材粉碎后，75%乙醇提取 3 次
(80 ℃，2 h) ，石油醚脱脂，醇提物分散水中，乙
酸乙酯萃取，经 D-101 树脂富集，收集 70%乙醇
洗脱液，浓缩干燥得组分Ⅰ，以芦丁为标准品，三
氯化 铝 为 显 色 剂［6］，测 定 总 黄 酮 质 量 分 数
为 60. 19%。
2. 1. 2 组分Ⅱ 乙酸乙酯萃取后的水液继用水饱
和正丁醇萃取，经 D101 大孔树脂富集，浓缩干燥
得组分Ⅱ，以常春藤皂苷元为对照品，采用香草醛
-冰醋酸-高氯酸显色法［7］，测定总皂苷质量分数
为 59. 63%。
2. 1. 3 组分Ⅲ 经醇提后的药渣加入双蒸水 (液
料比 6 ∶ 1)80 ℃加热回流 2 h，提取 3 次，提取液
过滤，减压浓缩至小体积，加入乙醇至含醇量为
80%，4 ℃静置过夜，收集沉淀，用 80%乙醇洗涤
3 次，挥干乙醇后，热水溶解沉淀，sevage 法除蛋
白，经 S-8 大孔树脂搅拌吸附，水洗至还原糖检出
阴性，合并水洗液，减压浓缩后加乙醇至含醇量为
80%，4 ℃静置过夜，收集沉淀，依次用 75%乙
醇、丙酮、乙醚 2 ～ 3 次洗涤，得到组分Ⅲ，以葡
萄糖为标准品，苯酚-硫酸显色法测定总多糖质量
分数为 67. 61%。
2. 1. 4 组分Ⅳ 药材打粉用酸水加热提取 3 次，
趁热过滤，合并上清液减压浓缩至小体积，用
H101 大孔吸附树脂吸附过夜，水洗脱后用乙醇洗
脱，水浴干燥乙醇洗脱液，用酸水溶解并过滤，碱
化后用乙酸乙酯萃取，冷冻干燥乙酸乙酯萃取物得
组分Ⅳ。以苦参碱为对照品，紫外分光光度法测定
生物碱质量分数为 13. 20%。
2. 2 黑种草子不同组分对巨噬细胞亚硝酸盐的影
响 小鼠 RAW264. 7 细胞株以含 10% FBS的 RPMI-
1640 培养液在含 5% CO2 的 37 ℃培养箱中培养。
接种细胞至 96 孔板 (5 × 104 cell /100 μL) ，培养 4
h。模型组以 LPS (100 ng /mL)和 IFN-γ (10
U /mL)协同刺激巨噬细胞，黑种草子各组分处理
组 1、10、100 μg /mL (临用前用 DMSO 溶解，
DMSO 终质量分数 ＜ 0. 1%)与刺激剂同时加入，
空白组加入 0. 1% 的 DMSO。培养 24 h后，取细胞
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上清 100 μL，加入等体积的 Griess 试剂，室温 10
min后于 540 nm 处读取吸光值，代入亚硝酸盐标
准曲线换算亚硝酸盐的量，并计算抑制率。
抑制率 (%) = ［(模型组吸光值 －各剂量干
预组吸光值)/(模型组吸光值 － 空白对照组吸光
值］× 100%
2. 3 黑种草子不同组分对血小板聚集的影响［8］
根据 Born比浊法检测待测药物对大鼠血小板聚集
的影响。大鼠麻醉后自腹主动脉取血，3. 8%枸橼
酸钠抗凝后制备富血小板血浆 (PRP)和贫血小板
血浆 (PPP)。以 PPP 调整 PRP，使血小板数约为
2 × 108 个 /L。取 200 μL PRP，37 ℃孵育 5 min 后
加入不同质量浓度的黑种草子各组分 12. 5、25、
50 μg /mL (临用前溶于无水乙醇，血浆中无水乙
醇终质量分数 ＜ 0. 005%，对实验结果无影响) ，
孵育 5 min，阳性药为阿司匹林，溶媒对照为
0. 1%的无水乙醇。最后分别加入终浓度为 5
μmol /L 的二磷酸腺苷、0. 25 mmol /L 的花生四烯
酸和终质量浓度为 0. 15 μg /L 的胶原，记录 5 min
内最大聚集率。
2. 4 黑种草子不同组分对离体主动脉环舒缩效应
的影响 大鼠处死后迅速开胸取出胸主动脉，放入
新鲜预冷的 Kreb-Henseleit (K-H)液中，切割成 3
mm长的动脉环，分为保留内皮组和去除内皮组
(牙签摩擦法制备)。将血管环悬挂在 37 ℃恒温水
浴槽中，持续通入 95% O2 和 5% CO2 的混合气体。
动脉环一端以 L 型不锈钢丝固定于浴槽底部，另
一端连接张力换能器，用 PowerLab /4SP 生物信号
记录分析系统记录血管的等张力收缩力。动脉环静
息负荷 2 g，每 20 min 换 K-H 液一次，平衡 90
min。应用 60 mmol /L KCl 收缩两次，取收缩良好
的血管环进行实验。以 10 －6mol /L去氧肾上腺素收
缩血管环，反应平衡后用累加浓度法考察内皮完整
性。乙酰胆碱 (Ach)10 －8 ～ 10 －5 mol /L 引起内皮
依赖性舒张反应，以 10 － 7 mol /L Ach 舒张达到
15% ～ 20%、10 － 6 mol /L Ach 达到 60%、10 － 5
mol /L Ach达到 80%以上判断内皮完好。以 Ach舒
张反应 ＜ 1%判断内皮已去除完全为标准。平衡 1 h
后以 10 －6 mol /L 去氧肾上腺素预收缩血管，稳态
后用累加浓度法分别加入黑种草子各组分，临用前
用 75%乙醇溶解 (经实验证明 75%的乙醇对血管
张力无影响) ，各质量浓度 (10 －7 ～ 10 －3 g /mL)
间隔约 2 min，最后加入 10 －6 mol /L Foskolin 至最
大舒张作为 100%舒张参照，记录浓度舒张曲线并
计算舒张率。
2. 5 统计学处理 结果以 x ± s表示，组间差异以
SPSS 15. 0 软件进行 t检验分析。
3 结果
3. 1 黑种草子不同组分对激活巨噬细胞中含亚硝酸
盐量的影响 LPS 和 IFN-γ 协同诱导巨噬细胞
RAW264. 7可产生大量 NO，其稳定产物亚硝酸盐在
细胞上清液中的量剧增 (P ＜0. 01)。黑种草子组分Ⅰ
1 μg /mL剂量即能抑制亚硝酸量 (P ＜ 0. 01) ，组分
Ⅱ和Ⅳ100 μg /mL 剂量对亚硝酸盐具抑制作用 (P ＜
0. 01) ，而组分Ⅲ无抑制效果 (表 1)。
表 1 黑种草子不同组分对激活巨噬细胞中亚硝酸盐的影
响 (x ± s，n =6)
Tab. 1 Effects of fractions on nitrite accumulation in stim-
ulated macrophages (x ± s，n =6)
组别 组分
剂量 /
(μg·mL －1)
亚硝酸盐 /
(μmol·L －1)
抑制率 /%
空白组 － － 6. 24 ± 0. 01 －
模型组 － － 64. 58 ± 0. 01 －
黑种草子
处理组
1 29. 64 ± 0. 03 59. 88 ± 0. 03＊＊
Ⅰ 10 5. 86 ± 0. 01 100. 65 ± 0. 01＊＊
100 5. 66 ± 0. 01 100. 99 ± 0. 01＊＊
1 63. 91 ± 0. 01 1. 15 ± 0. 01
Ⅱ 10 62. 04 ± 0. 03 4. 35 ± 0. 03
100 6. 03 ± 0. 01 100. 35 ± 0. 01＊＊
1 67. 03 ± 0. 04 － 4. 20 ± 0. 04
Ⅲ 10 63. 05 ± 0. 05 2. 63 ± 0. 05
100 62. 34 ± 0. 02 3. 85 ± 0. 04
1 62. 76 ± 0. 03 3. 13 ± 0. 03
Ⅳ 10 62. 19 ± 0. 04 4. 10 ± 0. 04
100 39. 02 ± 0. 03 43. 82 ± 0. 03＊＊
注:与模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3. 2 黑种草子不同组分对不同诱导剂诱导的大鼠
血小板聚集的影响 二磷酸腺苷、花生四烯酸、胶
原均能引起大鼠血小板聚集，阳性对照药阿斯匹林
25 μmol /L显著抑制其聚集 (P ＜ 0. 05)。组分Ⅰ
25、50 μg /mL仅对二磷酸腺苷引起的血小板聚集
有抑制作用 (P ＜ 0. 05)。组分Ⅱ25、50 μg /mL 同
时对二磷酸腺苷和花生四烯酸引起的血小板聚集有
抑制作用 (P ＜ 0. 05)。组分Ⅲ对 3 种诱导引起的
血小板聚集均无抑制作用，组分Ⅳ50 μg /mL 对二
磷酸腺苷诱导血小板聚集有抑制作用 (P ＜ 0. 05)。
见表 2。
3. 3 黑种草子不同组分抗血管收缩的影响 黑种
草子组分Ⅳ对内皮完好组 (+ Endo)和去除内皮
组 (－ Endo)血管环均表现出舒张效应外，其他
组分均无法舒张去氧肾上腺素预刺激的离体血
管环。内皮完好的血管环经组分Ⅳ10 －3mg /mL处理
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表 2 黑种草子不同组分对大鼠体外血小板聚集的影响 (x ± s，n =4 ～ 7)
Tab. 2 Effects of fractions on induced platelet aggregation (x ± s，n =4 ～ 7)
组别 剂量 /(μg·mL －1)
最大聚集率%
二磷酸腺苷 花生四烯酸 胶原
溶媒对照组 － 63. 0 ± 5． 2 88. 2 ± 7． 1 65. 0 ± 10． 5
50 48. 3 ± 11． 8* 77. 3 ± 8． 5 56. 4 ± 12． 0
组分Ⅰ 25 46. 6 ± 10． 0* 78. 0 ± 7． 4 51. 3 ± 13． 6
12. 5 59. 1 ± 6． 4 83. 7 ± 5． 9 61. 1 ± 15． 3
50 47. 4 ± 10． 7* 76. 6 ± 6． 9* 69. 1 ± 11． 7
组分Ⅱ 25 44. 7 ± 16． 1* 76. 9 ± 7． 6* 76. 7 ± 17． 6
12. 5 54. 6 ± 10． 4 80. 5 ± 8． 5 78. 2 ± 11． 3
50 55. 7 ± 14． 0 84. 7 ± 32． 1 60. 6 ± 17． 4
组分Ⅲ 25 54. 5 ± 12． 5 85. 7 ± 33． 2 61. 5 ± 10． 6
12. 5 59. 5 ± 15． 0 82. 8 ± 46． 5 61. 9 ± 7． 9
50 47. 0 ± 10． 8* 78. 7 ± 44． 3 59. 3 ± 6． 1
组分Ⅳ 25 53. 6 ± 10． 1 77. 0 ± 40． 3 68. 8 ± 9． 2
12. 5 54. 0 ± 20． 7 78. 5 ± 38． 3 68. 8 ± 14． 5
阿斯匹林 25 μmol /L 43. 2 ± 17． 9* 39. 8 ± 18． 3* 35. 7 ± 24． 0*
注:与溶媒对照组比较，* P ＜ 0. 05
后，舒张率达 (82. 37 ± 13. 78)%，去除内皮后舒
张率达到 (40. 48 ± 22. 64)%，有无内皮的 10 －3 ～
10 －4 mg /mL 剂量组之间舒张效果有差异 (P ＜
0. 01，P ＜ 0. 05) (图 1)。
与内皮保留组比，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 1 黑种草子不同组分对内皮完整 (+ Endo)或去除内皮 (－ Endo)血管舒张的影响 (x ± s，n =3 ～ 6)
Fig. 1 Effects of fractions on vascular tension of aorta rings with or without endothelium (x ± s，n =3 ～ 6)
4 讨论
前期对黑种草子总皂苷进行了抗炎机制研究，
发现其是通过影响 MAPK 信号转导通路中的 ERK
蛋白磷酸化水平，抑制相关细胞因子、诱导型一氧
化氮合酶 (iNOS)、环氧合酶 2 (COX-2)表达，
降低亚硝酸盐的产量［7］，提示黑种草子皂苷类组
分含有镇痛抗炎的活性物质。但未对黑种草子进行
组分分离和多方面活性的评价。
血小板在长期内被看作是血液中的无功能的细
胞碎片，但作为成熟巨核细胞上脱落下来的小块细
胞质，仍保持从巨核细胞来源的 mRNA，在伤口愈
合、炎症反应、血栓形成、肿瘤转移等生理和病理
过程中起着重要作用。在二磷酸腺苷、花生四烯
酸、胶原等诱导下，血小板的 cAMP 水平降低和
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Ca2 +浓度增加而引起活化和黏附，同时释放血栓
烷 A2、致密颗粒和 α 颗粒通过与表面相连管道系
统释放 5-羟色胺、细胞生长因子、血液凝固因子
和血管通透因子等多种活性物质，促进血管收缩，
促纤维蛋白形成，可加强损伤部位的炎症和免疫反
应［9］。阿司匹林是临床上抗血小板聚集的常用药，
现已出现阿斯匹林抵抗现象。黑种草子作为药食同
源的维吾尔族习用药，其 4 个组分就抑制血小板聚
集的种类及强度而言，活性顺序依次为皂苷类Ⅱ组
分 ＞黄酮类Ⅰ组分 ＞生物碱类Ⅳ组分。
血管内皮细胞不仅仅作为血液与血管壁之间
的屏障，还通过表达各种蛋白或因子，在维持血
液的正常流动以及调节血管张力方面具有重要的
作用，分为内皮依赖性舒张作用和非内皮依赖性
舒张作用［10］。生物碱类Ⅳ组分具内皮依赖性的血
管舒张，可能是通过调控血管内皮 eNOS 活性提
高 NO释放等引起血管舒张，具体机制仍需进一
步探讨。
巨噬细胞作为关键的免疫细胞，在致炎因子的
刺激下，释放大量的 NO，在有氧情况下，形成强
氧化剂-过氧亚硝酸阴离子，导致氧化应激、蛋白
硝基化而引起信号传导紊乱、炎症级联反应，慢性
炎症的长期持续性刺激，最终体内平衡的分子网络
向恶性方向演化［11-12］。在抑制亚硝酸盐产量方面，
黑种草子黄酮类组分Ⅰ ＞皂苷类组分Ⅱ ＞生物碱类
组分Ⅳ。
中药单味药是个复杂的化合物库，若以不同极
性的溶液加以提取进行大致归类，将类似的物质富
集，结合体外筛选可彰显出这类组分的药效活性，
给予传统功效相应的解释。本研究就黑种草子活血
通经和抗炎镇痛的传统功效进行了初步体外验证。
黄酮和皂苷类活性偏重抗炎和抗血小板聚集活性，
生物碱等水溶性成分兼具抗炎、抗血小板聚集和舒
张血管的多种效应，但抗炎抗血小板聚集的活性强
度不及皂苷类和黄酮类。多糖类组分Ⅲ虽然在此 3
个体外实验中均无效，但是不能排除体内吸收代谢
而转化产生有效物质的可能性。因此，对黑种草子
进行深入研究，有可能为抗炎、抗血小板聚集、促
血管舒张药物提供候选组分。
参考文献:
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