全 文 ：第 3 3卷 第 ” 期
科 学 通 报
C HI E NS SC EI E NC E BI U
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LI E
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I N l, , 3年 1 2 月
P E G 胁迫下高粱根中 6 k D 多肤的
增多与 K 十 累积增强的关系
贺 志 理 汤 章 城
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2 0 00 32 )
关健词 P E G 胁迫 、 6k6 D 乡肤 、 K + 早积 、 离粱根
细胞中 K + 的累积在渗透调节中起有重要作用 ,它的吸收 、 运输及其 K 十 亲和蛋白质的研
究正在探索之中 . 在大肠杆菌中 , H es se 等山分离到了对 K 十 具有 高 亲 和 力 的 k d p 系 统
( K , ~ 2 产 m ol / L ) , 它是由渗透胁迫诱导产生的 . 基因 k d p A B C 编码三个与膜结合的蛋白
质 (分子量分别为 4 7 , 9 0和 2 k2 D ) ; 基因 k d p D E 编码两个调节因子 . G ab er 等切在酵母中发
现了一个高亲和力的 K + 运输系统 , 它是由 t r kl 编码的质膜蛋白 . S eo et aD e 等阔分离了 ak d
基因 , 并证明即使在外界 K 十 浓度仅为 0 . 6拼m al / L 时 , ak d 表达仍能使酵母细胞吸收 K 十 . 在燕
麦根中 ,长期和短期去 K + 培养后 , 质膜和液泡膜蛋白均发生变化 , 朽 和 4k3 D 多肤显著增加
并与 K 十 累积相关 “ 一 ,] . 我们利用高粱根为材料 ,发现在渗透胁迫下 , K + 净累积比对照增加高
达 6 . 7 倍叨 . 动力学研究表明这种 K 十 累积增加是由于高粱根对 K + 亲和力增强所致 , 并且依
赖于蛋白质的合成 . 本工作用 S D s 一 P A G E 方法 , 分析了质膜 ( P M ) 与液泡膜 ( T G ) 蛋白
和可溶性蛋白 ( S P ) 的变化 , 发现 “ k D 多肤在渗透胁迫下变化显著 , 并与 K十 累积密切相
关 。
1 材 科 和方 法
1
.
1 材料
供试材料同文献 〔7〕 . 生长 d5 的幼苗用 一 1 . OM aP 渗透势的 P E G ( MW 一 10 0 0 ) 溶液处理
6 或 2 4 h (在图中标出 ) . 加环己酸亚胺 ( C H M ) 处理时 , 与 P E G 同时加人为 0P ; P E G 处
理后 2 , 4 , s h 分别加人为 P Z , P 4 和 P S ; 不加 C H M 为 P N .
1 .2 膜的制备和纯化
按 D u p o n t 方法阁 . 取约 5 0 9 高粱根 , 剪碎 , 加匀浆液 (蔗糖 0 · 2 , m o l / L , D T T 2 m m o l /
L
,
T r i s 2 5 tn m o l / L
, E D T A 4 m m o l / L
, p M s F l m m
o l / L ) 匀浆 , 经四层纱布过滤后 , 离心
( 10 0 0 0 x g
, z o m i n ) 去沉淀 . 上清液离心 ( 10 0 0 0 0 X g , 3 om i n ) , 再次离心所得上清液为
s p ; 沉淀置于 之一 3 m l 悬浮缓冲液 (蔗糖 o . 2 5 tn o l / L , n T T 2 m m o l / L , P j p e s 一 K o H s m m 。 l /
L
,
p H 7
.
0) 中 ,此悬浮液铺在不连续蔗糖梯度上 . 不连续蔗糖梯度分别由 16 m l 40 多 , 12 m l
3 0外和 12 m l 2 2多 (平 /平 ) 的蔗糖溶液组虎 离心 ( 20 0 0 0 0 X g , 2 . 5 h ) 后 , 收集 3 0一 2 2务
1 , 争3一 0 3一 2 6 一次稿 , 一9 9 3一 0 6一 2 4 收修改稿 .
第 2 3期 科 学 通 报 2 1 9 1
界面 (组分 1 )为 T G, 3 0一 4 0关 界面 (组分 2 ) 为 P M . 此样品用 K e z 2 0 0。 。 0 2 / L , o T T
一
Zm m o l / L
,
T r i s一 H C I 2 0m m o l / L ( p H S
.
0 ) 的溶液稀释至最终浓度为 K C I 1 5 o m m o l / L , D T T
1
.
5二 m o l / L 和 T r i s 一 H e l 1 5m m o l / L . 然后离心 ( 20 0 0 0 0 x g , 3 o m i n ) 得沉淀 .
L 3 标记酶测定
A T P a s e 的测定按 P o o l e 等方法〔 , , , N A D H C y r C 还原酶 和 C y r C 氧 化 酶 的 侧 定 按
D u p o n t 等方法 【`。 , .
L 4 膜蛋白的提取
纯化的膜加蛋白质提取液 ( T r i t o n X 一 10 0 1 . 0多 , aN lC l , 0 m m d / L , E n T A l m m o一/
L
, T r i s
一
H C I z o m m o l / L
,
p H 7
.
6 )
, 待样品完全溶解后 , 1 0 0 0 0 0 x 窟离心 3 0 m i n , 去沉淀 。
L S 蛋白质含 t 的测定
按 F a n g e r 方法 “ ` 1 .
1
。 ` S D S一 P A G E
按 L ae m m il 方法叻 . 分离胶浓度为 lz 外 , 银染按 lB u m 等方法 13 .]
L 7 K
十 含盘测定
按文献 〔月所述的方法 .
2 实 验 结 果
2
.
1 不连续蔗糖梯度离心后膜组分的酶活性
表 1说明线粒体和内质网在组分 1 和 2 中的含量 低 , 组分 1 中 的 A T P as e 活 性 被 1幼
m m o l / L K N O
, 抑制 弓9 . 1外 , 富含 ’ f G ; 组分 z 中的 A T P a s e 活性被 0 . l m m o l / L N a 3 V O 、 抑
制 4 , . 5多 , 富含 P M .
.2 2 P E G 胁迫下 6 6 k D 多肚的增加和 C H M 的抑制效应
图 1 表明高粱在 一 1 . 0 M P o P E G 溶液中处理 h6 后 , 根中蛋 白质谱带发生明显的 变 化 .
P M 和 s P 中 , “ k D 多肤显著增加 , 而在 T G 中无明显的变化 · 当在 P E G 溶液中同时加人 .0 1 m m ol / L (T ` P M S 尸 标准 分 “ “
e H M 时 , P M 和 s P 中 6 6 k D 多肤的增加不再出现 , 。 ; k r )
图谱与对照无差异 (图 2 ( b ) ) . 6 “ kD “ 7 “ D
2
·
3 6 6 k D 多肚的增加与 K 十 累积的关系 · 们 k n
P E G 胁迫下 , 高粱根中 K 十 累积显著增加 ; 但当
同时加人 .0 1~ o1 / L C H M 培养时
, K 十 的刺激累积 “ 。 kD
效应被完全抑制 (图 2 ( 。 ) ) . 图 2 示 K 十 的累积增加与“ lcD 多肤的诱导增加相一致 . P E G 处理过程中 ,分 `翻 k)I
别在 o , 2 , 4 和 s h 加人 o . l m m o l / L C H M , K + 的累积
增加和 “ k D 多肤的增多均随加人时间的推迟而逐 渐
增加 (图 3 ) . 当在与 P E G 同时加入和 P E G 处理后 图 l 质膜 ( P M ) 、 液泡膜 ( T G ) 和上
h2 加人 C H M 时 , K 十 的净累积为单独用 P E G 处理 ` 清液 ( s P ) 蛋白的 SDS 一 P A G E 结果
时的 5% 和 1 7% , 6 6k D 多肤增加不明显 . 当 PE G 处 c 为对照 , T 为 一 ` · 0 M p · p E G 处理 6h
理后 4 :、 茄人 c H M 时 , K 十 累积为单独用 PE G 处理时的 31 务 , 6 6k D 多肤明显增加 . 当用
P E G 处理后 h8 加入 C H M , K 十 累积为单独用 P E G 处理时的 90 沁 , “ k D 多肚含量与单独
21 2 9科 学 通 报 第 3 8卷
表 1不连续蔗搪梯度后膜组分的酶活性分布
标 记 酶 组分 l特异活性
组分 2
(产。 。 l h一 ,二 g 一 ’ )
N A D H C y t C 还原酶
C y t C 氧化酶
A T P a s e
无抑制剂
+ 0
.
zm m o l / L N
a , v o -
(促进或抑制 )
十 15 0 m m b l / L K N O :
(促进或抑制 )
:::: ::;:
25
。
6 4
2 3
。
20
一 , . , %
1 0
。
4 8
一 , 9 . 1%
4 1
。
2 0
2 2
。
4 7
一 4 5 . 5%
4多。 3 5
+ 1 0
.
1%
250:Q150。
gQ乏loEz心资和+润
2 3
a()
( b )
图 2 C H M 对 +K 累积和 “ kD 多肤产生的抑制效应 (处理时间为 2 4五j
( a ) K
+
1— 对照 ,
累积 , ( b ) S D S 一 P A G E 结果 .
2— P E G 处理 , 3一 一 P二G + C HM
CK
入助 尽 产
窗Q,盏。日3啊加.另
图 3 C H M 对 +K 累积和 6 6 k D 多肤产生抑制的时间进程 (处理时间为 2 . h )
( a ) K + 累积 , ( b ) S D S一 P A G E 结果
用 P E G 处理者相近 。
3 讨 论
在实验中 , 我们除发现 6k6 D 多肤的增多与 K 十 累积增强的关系外 ,还发现在 PE G 处理
第 z 3期 科 学 通 报 2 1 9 3
2 4五后 5收 D 多肤的诱导产生 , 但在 P E G 处理 h6 后并不出现 . 作者认为 , 细胞中 K 十 的累
积是植物对水分胁迫的早期反应之一 , “ k D 多肤的增加与这一过程相关 ; 细胞中 K 十 浓度的
变化及由此带来的离子强度的变化 , 导致了某些抗水分胁迫有关物质的合成和基因表达及蛋
白质 (酶 )构象的改变 , 从而增强了植物对水分胁迫的适应能力 , 5 k4 D 多肤可能与植物对干旱
环境的适应有关 , 其特异性及功能有待于进一步研究 .
在文献 〔71 的基础上 ,我们又通过分离细胞组分的 S D S一 P A G E 分析和 C H M 抑制 K 十 累
积增加的时间效应 ,进一步证明了 6 6k D 多肤与 K + 累积增加的相关性 . 尽管高亲和力的 K +运
输系统不断被发现 , 其性质和机制尚缺乏了解 ,尤其在高等植物中 . 不同研究者分别在 K ’卜 /H +
同向运输体 、 K 十 / H 十 反向运输体 、 K 十 通道和 K + 一 A T aP s e 等方面进行了探讨 6[] , 我们正在
纯化足够量的 6 6k D 多肤 , 以备进行氨基酸序列分析 、 免疫分 析和其它特性测定 .
[ l ]
〔2
[ 3
参 考 文 献
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A l t e n d o r f
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N a 盆1 . 通 c a d . S c i . U S才 . 19 8呼, 8 1 : 4 7 4 6一
4 7 , 0
.
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F i n k
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G
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C毋 l l B 才 0 1
. , 1 9 88
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8 : 2 8 4 8一 2 8 5 9 .
S e n t e n c e
,
H
. ,
B o n n e a u d
,
N
.
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,
M
. 口忿 a l 二 S c 了 e n c r , 19 9 2 , 2 5 6 : 6 6 3一 6 6 5 .
F e r n a d o
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M
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S i d d i q i
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M
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G l a s s
,
A
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P l a ” r p 人y s i o l . , 1 9 8 9 . 8 9 : S 一 15 1 .
F e r ” a d o , M 二 K u l P a , J
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S i d d i q i
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M
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Y
. 亡手 a l 二 P l a . 了 P 八y ` 10 1 . , l , 夕0 , , 2 : 1 1 28一 1 13 2 .
F e r n a d o
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二 M e h r o k e , J
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P
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K r a t k y
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D u P o n t
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M 二 B e n n e t t
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1 9 7 0
,
2 1
: 6 8 0一 6 8 5 .
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