全 文 ：△ 基金项目:国家自然科学基金项目(81060362)，内蒙古自然
科学基金项目(2009BS1204)．
* 通讯作者:zbczdlqkx@ 126． com
广枣总黄酮对血管紧张素Ⅱ所致大鼠心肌纤维化的影响△
刘 婷1 朱德礼2* 舒 亮2 贾 磊1，2 王晓玲2 魏 玮1 杨雨民2
(1． 内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特 010050;
2． 内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020)
摘 要:目的:探讨广枣总黄酮(total flavones of fructus chorspondiatis TFFC)对大鼠心肌纤维化的作用及其机制。方法:采
用差速贴壁法培养新生大鼠 CFs，在体外建立 AngⅡ诱导 CFs 增殖模型成功后，将模型随机分为空白组(control):未加药
物;AngⅡ组:AngⅡ(100 nmol /L);TFFC + AngⅡ组:加入 AngⅡ(100 nmol /L)和不同浓度(25、50、100 mg /L)的 TFFC)组。
采用 MTT实验方法检测心肌成纤维细胞增殖，羟脯氨酸试剂盒检测胶原合成。结果:100 nmol /L 的 AngⅡ组明显促进 CFs
增殖(P ＜ 0． 05)，(50、100 mg /L)的 TFFC组明显抑制 100 nmol /L AngⅡ诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖(P ＜ 0． 05)与
胶原合成(P ＜ 0． 05)。结论:广枣总黄酮抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成，并成浓度依赖性。
关键词:广枣总黄酮;心肌纤维化;血管紧张素Ⅱ
中图分类号:Ｒ291． 2 文献标识码:A 文章编号:1006 － 6810(2014)12 － 0056 － 03
心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是指在心肌的正
常结构组织中胶原含量过度累积、或胶原成分发生变化从
而发生相应心肌结构的破坏以及功能紊乱的过程。这种病
理变化在多种心血管疾病中普遍存在，是许多心脏病晚期
的症状［1 － 2］。而《中国心血管病报告 2012》显示，当前导致
我国心血管病的相关危险因素呈现大幅的增长趋势。目前
全国大约有心血管病患者 2． 9 亿，相当于每 5 个成年人中
有 1 人是心血管病患者。AngⅡ是目前公认的促心脏纤维
化之一，心肌局部和或循环中 AngⅡ含量显著增加，是引起
心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖的非常重要的因素［3］
广枣是蒙医药材中使用频率很高的一味药，从属漆树
科。用于治疗心神不安、胸痹疼痛、气滞血瘀和气短心悸等
心血管病症［4］，具有养心安神、活血行气的作用，疗效显
著，为众多医家所习用。广枣总黄酮 (total flavones of fruc-
tus chorspondiatis TFFC)为经乙醇回流提取的黄酮类成份，
现代药理学研究多有报道，TFFC对缺血性心肌以及因急性
心肌缺血导致的多种房性和室性心律失常具有非常明显的
的保护作用、促进心肌的抗缺氧能力、并且可以改变血液流
变学和血液动力学起到血小板聚集的抑制作用、清除自由
基和抗氧化作用以及增强细胞免疫和体液免疫功能等［5］。
本研究观察广枣总黄酮对 AngⅡ诱导的大鼠心脏成纤维细
胞(cardiac fibroblasts，CFs)，增殖及胶原合成的影响，探讨
广枣总黄酮对 CFs的作用机制，为预防和治疗心肌纤维化
提供新的依据。
1 材料与方法
1． 1 动物:SPF级 Sprague － Dawley(SD)大鼠，出生 1 ～ 3d，
体重 16 ± 1． 1g，许可证号:SCXK (浙江)2008 － 0115，由浙
江中医药大学实验动物中心提供。
1． 2 药物试剂与仪器:四甲基氮唑蓝(Methyl Thiazoly Tet-
razolium，MTT)购自 Sigma 公司;DMEM 高糖培养基购自
Gibco公司;平衡盐溶液(PBS)购自杭州宏博生物公司;血
管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)购自 Sigma 公司;超级
小牛血清(Frontiers of Computer Science，FCS)购自杭州四
季青生物研究所;二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)
购自 Sigma公司;胰蛋白酶购自 Sigma公司;3H －脯氨酸购
自中国原子能研究院同位素研究所;羟脯氨酸购自南京建
成生物工程研究所;广枣总黄酮(Total Flavones of Fruc-
tusChoerospondiatis，TFFC)中国中医科学院中药研究所制
定;2500E型 CO2 培养箱(Nu Aire公司);LS6500 型液态闪
烁计数仪(Beckman 公司);Mode l680 型酶标仪(BIO －
ＲAD公司);JY92 － II超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技
术研究所);倒置显微镜(重庆奥特公司);CA － 1080 －Ⅱ洁
净工作台(上海汇龙仪表电子公司);高速低温离心机(Sig-
ma公司);培养皿、96 孔培养板(Greiner公司)。
1． 3 CFs培养及鉴定:在无菌条件下取下出生后 2 ～ 3d 的
SD大鼠的心室，剪碎，磷酸盐缓冲液冲洗，用 0． 125%胰蛋
白酶在 37℃分散细胞，每 5 min收集 1 次细胞。离心 2 次，
将所得全部细胞置于 100 mL 培养瓶中，加入含 10% FCS
的 DMEM 培养液 8 mL，在 5% CO2、37℃孵箱中培养 60
min，采用差速贴壁法分离 CFs［6］。待 CFs生长接近融合时
以 1∶ 2 传代。在倒置显微镜下，细胞呈梭形、多角形，细胞
质透明，胞核椭圆形，颜色淡，常含有 2 ～ 3 个核。培养至第
4 天时，CFs出现集落样迅速生长，呈放射状、螺旋状、瀑布
状、编织状排列。经免疫组化检查:几乎所有细胞纤维粘连
蛋白(Fn)染色阳性(胞浆中可见棕黄色颗粒)和平滑肌肌
动蛋白染色阴性(未见棕黄色颗粒)，证实为所需的 CFs，且
纯度较高。实验采用 2 ～ 3 代细胞。
1． 4 实验分组:取第 2 ～ 3 代 CFs进行实验，0． 25%胰酶消
化制备细胞悬液，调细胞密度 2． 5 × 104 个 /ml，每孔 200μl，
接种在 96 孔板中，在 37℃5% CO2 及饱和湿度下培养，24
h后换无血清 DMEM，继续孵育 24 h，使细胞生长同步化。
根据加入条件不同分为:①空白组(control):未加药物;②
65 中国民族医药杂志 2014 年 12 月第 12 期
Ang Ⅱ组:AngⅡ(100 nmol / l);③TFFC + AngⅡ组:加入
AngⅡ(100 nmol / l)和不同浓度(25、50、100 mg / l)的 TFFC，
每组设 4 个复孔。
1． 5 MTT法检测细胞增殖活性:按照 1． 4 分组培养，继续
培养 24 h、48 h、72 h。分别于药物作用结束前 4 h，加 5mg /
ml的 MTT 20μl /孔，4 h 后终止培养，吸掉培养液，每孔加
150μl的 DMSO，振荡 10min使结晶充分溶解，在酶标仪 490
nm波长测定光吸收值(A)，用只加培养液不加细胞的空白
孔调零。
1． 6 3H －脯氨酸掺人法测定 CFs 胶原合成:按照 1． 4 分
组培养，药物作用 72 h后，从每孔各吸取 0． 5ml培养基，采
用经脯氨酸比色法测定 CFs 培养上清胶原含量，按羟脯氨
酸试剂盒说明书方法，紫外可见分光光度计 550 nm波长测
培养液吸收光值(A)，计算培养液中羟脯氨酸含量。样品
中羟脯氨酸浓度(U/L)= ［(测定管 A －空白管 A)/(标
准液 A －空白管 A］×标准管浓度(0． 05μmol /mL);样品
中胶原的浓度(μg /mL 培养基)=样品中羟脯氨酸浓度 ×
7． 46(7． 46 是从羟脯氨酸换算为胶原时的计算常数)。
1． 7 统计学处理:所有实验数据均以均数 ± SD表示，两组
之间比较选用 t 检验，数据统计采用 SPSS13． 0 行相关分
析。
2 结 果
2． 1 CFs增殖活力:采用 MTT 比色法测定 CFs 增殖，Ang
Ⅱ作用后细胞 A 值均明显增加，各时间段与 control 比较
(P ＜ 0． 01)．而 TFFC作用 CFs后 A值有不同程度降低，与
AngⅡ组比较(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)，说明 TFFC对 AngⅡ
诱导的 CFs增殖有抑制作用。并且明显的浓度依赖性。见
表 1。
表 1 TFFC对 CFs增殖的影响(± s，n = 4)
Group A(24 h) A(48 h) A(72 h)
Control 0． 481 ±0． 070＊＊ 0． 618 ±0． 069＊＊ 0． 780 ±0． 073＊＊
AngⅡ 0． 747 ±0． 073 1． 006 ±0． 061 1． 136 ±0． 067
AngⅡ+ TFFC 25 mg /L 0． 698 ±0． 073* 0． 886 ±0． 096* 1． 005 ±0． 075*
AngⅡ+ TFFC 75 mg /L 0． 621 ±0． 055* 0． 744 ±0． 071* 0． 948 ±0． 057*
AngⅡ+ TFFC 100 mg /L 0． 515 ±0． 049＊＊0． 689 ±0． 090＊＊0． 796 ±0． 070＊＊
注:与 AngⅡ组比较* P ＜0． 05 ，＊＊ P ＜0． 01。
2． 2 CFs胶原合成:采用 3H －脯氨酸掺入法检测 CFs 胶
原合成，结果中 AngⅡ明显能促进 CFs的 3H －脯氨酸掺入
率增加，而 TFFC以浓度依赖方式对其增加产生抑制作用，
并具有统计学意义(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。见表 2。
表 2 TFFC对 CFs胶原合成的影响(± S，n = 4)
Group CPM(3H － proline incorporation)
Control 1431． 67 ± 205． 83＊＊
AngⅡ 2476． 17 ± 246． 70
AngⅡ + TFFC 25mg /L 2241． 83 ± 302． 40
AngⅡ + TFFC 50mg /L 1863． 33 ± 213． 20*
AngⅡ + TFFC 100mg /L 1518． 50 ± 322． 60＊＊
注:与 AngⅡ组比较，* P ＜0． 05 ＊＊ P ＜0． 01
3 讨 论
心肌重塑是心血管疾病的非常重要的生理病理过程，
最终会引起心律失常、心功能衰竭、心源性猝死的发生。
MF是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是
心肌重构的主要表现之一。当今比较成熟的看法认为，MF
的产生是一个繁杂的病理过程，主要是因为心肌胶原合成
与降解失衡，与循环中和心脏局部血管紧张素家族、氧化应
激、炎性因子、生长因子及细胞外基质等有密切关系［7 － 10］。
涉及细胞凋亡、免疫系统、细胞信号调节等诸多因素。
脯氨酸(Proline)是 CFs 胶原合成的重要底物，测定用
同位素标记的 3H － Proline 掺入率可直接反映 CFs 的胶原
合成能力。在体外培养的细胞模型中，CFs 合成胶原蛋白
并分泌至培养液中，培养液中的胶原蛋白在碱性环境下受
裂分解，释放羟脯氨酸。羟脯氨酸经 Proline 水解而来，是
机体胶原蛋白的主要成分之一，是胶原蛋白中独有的氨基
酸，在一般胶原蛋白中的含量约为 13． 4 % ，在其他蛋白
质中含量极少或基本没有。因此，羟脯氨酸含量可作为衡
量其胶原组织代谢和判断纤维化程度的首要观察指
标［11 － 12］。
本实验以 AngⅡ刺激 SD大鼠 CFs增殖，构建 MF的细
胞模型，采用 MTT 法和 3H － Proline 掺入法观察 TFFC 对
CFs增值及胶原合成的影响发现，TFFC可呈浓度依赖方式
对抑制 CFs的增值和胶原。从而干预心肌纤维化的进一步
发展。
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2014 年 9 月 16 日收稿
△基金项目:国家自然科学基金(81260568)，宁夏回族自治区自
然科学基金(NZ10191);银川市科技攻关课题(2012017)。
作者简介:刘丽，女，在读硕士研究生，2012 级回医药专业。E －
mail:liulill220@ sina． com。
回药失荅刺知丸对大鼠脑缺血再灌注后海马区 NGF水平的影响△
刘 丽1 杨华祥2 贾孟辉3 王佩佩3 于凌志1 左艳丽1 王晓丽3 马立凤3
(1．宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004;
2．宁夏医科大学回医药汤瓶八诊培训学院，宁夏 银川 750004;
3．宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 700001)
摘 要:目的:探讨失荅刺知丸对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法:60 只 SD 大鼠被随机均分为假手术组、局
灶性脑缺血再灌注对照组和失荅刺知丸灌胃组。线栓法制成大鼠大脑中动脉再灌注模型，免疫组化染色法检测脑缺血再
灌注后海马区 NGF阳性细胞的表达，TTC染色法检测脑组织梗死体积改变。结果:脑缺血再灌注组大鼠海马区 NGF 阳性
细胞分布稀疏，数目较假手术组、失荅刺知丸灌胃组明显减少(P ＜ 0． 05)，失荅刺知丸灌胃组明显减少再灌注损伤后的脑
组织梗死体积(P ＜ 0． 05)。结论:失荅刺知丸对大鼠脑缺血再灌注后的神经组织具有一定的保护作用。
关键词:脑缺血再灌注;失荅刺知丸;神经生长因子
中图分类号:Ｒ291． 3 文献标识码:A 文章编号:1006 － 6810(2014)12 － 0058 － 03
目前，缺血性卒中占脑卒中发病率的 70% ～ 80%［1］，
其致残率很高，是世界范围内导致死亡的第二位因素，也是
当今社会和医学界关注的重要课题。现代医学认为，缺血
性脑卒中的治疗原则是及时恢复缺血区的血液灌注，改善
脑组织的血液循环，增加缺血半暗带区的血流及氧的供应，
控制脑水肿，防治并发症。然而再灌注却会使缺血所致的
脑功能障碍和结构破坏进一步加重，脑组织损伤反而加重，
从而导致脑细胞发生不可逆损伤，这种现象被称为缺血再
灌注损伤［2］。因此，治疗过程中如何减少再灌注损伤、最
大限度的挽救脑细胞，恢复脑组织功能无疑是治疗的关键
所在。本课题在回医药经典方———“失荅刺知丸”能够有
效治疗缺血性脑血管病之研究基础上［3］，为进一步探讨该
方的神经保护作用机制，开展了本项目的实验观察研究。
兹报告如此。
1 材 料
1． 1 实验动物:SD 大鼠，清洁级，雄性，70 只，3 ～ 4 月，体
重 250 ～ 300g;由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证
号 SCXK(宁)2012—0001;所有大鼠在同一动物房中饲养，
以标准固型普通饲料喂养，室温(26 ± l)℃，湿度(50 ±
10)%，自由饮食。
1． 2 实验药物及试剂
1． 2． 1 实验药物:失荅刺知丸(《回回药方》)方药组成:柴
胡 18g、牵牛子 9g、芦荟 36g、失荅刺知(延胡索)6g、菖蒲
6g、番盐 6g、沙哈木罕合里(药西瓜油)9g、干姜 6g、白芥子
6g、砂糖 12g、芹菜 6g、诃子 18g，生药总量为 138g;上药由宁
夏医科大学第二附属医院药剂科提供，依据人和动物间体
表面积折算等效剂量公式，按原方计量配比生药材，除杂质
切制研末后，加入生药材 10 倍量的蒸馏水，浸泡 60 min 后
用煎药机煎药，沸腾后将功率调低保持微沸状态煎煮 30
min，滤取煎液;药渣再加人生药材 6 倍量的蒸馏水，待煮沸
后保持微沸状态煎煮 30 min，滤取煎液;合并两次煎液，将
药液于恒温水浴锅(100℃)蒸发水分至浓稠状，浓缩至药
液含生药量 1． 68g·mL －1，4℃冰箱保存备用。
1． 2． 2 试剂:麻醉药物 10%水合氯醛:宁夏医科大学总医
院制剂中心提供，批号 H20080018;封闭用正常山羊血清原
液:北京中衫金桥生物技术有限公司，批号 121118;胰蛋白
85 中国民族医药杂志 2014 年 12 月第 12 期