全 文 ：· 136 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (1): 136−141



广枣总黄酮对体外培养大鼠心脏成纤维细胞 I, III 型
胶原 mRNA 及蛋白表达的影响
包俊萍 1, 金 明 2, 杨雨民 1*, 高晓慧 1, 舒 亮 3, 邢慧慧 3, 贾 磊 3
(1. 内蒙古自治区中医医院心内科, 内蒙古 呼和浩特 010020;
2. 内蒙古林业总医院中医科, 内蒙古 牙克石 022150; 3. 内蒙古医科大学研究生学院, 内蒙古 呼和浩特 010050)
关键词: 广枣总黄酮; I型胶原; III型胶原; 心脏成纤维细胞; 血管紧张素 II
中图分类号: R285 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 01-0136-06
In vitro effect of total flavones of Fructus Chorspondiatis on
expression of collagen type I and type III mRNA and protein
of cultured rat cardiac fibroblasts
BAO Jun-ping1, JIN Ming2, YANG Yu-min1*, GAO Xiao-hui1, SHU Liang3, XING Hui-hui3, JIA Lei3
(1. Department of Cardiovascular Disease, Traditional Chinese Medicine Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region,
Hohhot 010020, China; 2. Department of Traditional Chinese Medicine of Inner Mongolia Forestry General Hospital,
Yakeshi 022150, China; 3. Graduate School of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, China)

Abstract: This study aims to investigate the effect of total flavones of Fructus Chorspondiatis (TFFC) on the
mRNA and protein expression of collagen type I and III of rat cardiac fibroblasts (CFs) induced by angiotensin II
(Ang II), and explore its anti-myocardial fibrosis molecular mechanism. Neonatal rat CFs were prepared from
Sprague-Dawley rats (1−3 d after birth). The expression of collagen type I and III mRNA and protein were
measured by RT-PCR and Western blotting, respectively. The study showed that stimulation of neonatal rat CFs
with 100 nmol·L−1 of Ang II for 72 h resulted in a significant increase of the expression of collagen type I and III
mRNA and protein. The changes on the expression level were blocked by TFFC. The results demonstrated
that TFFC can inhibit myocardial fibrosis induced by Ang II in rats, which is probably associated with the collagen
type I and III mRNA and protein levels up-regulated by Ang II, and TFFC was shown to decrease the expression
levels of collagen type I and III mRNA and protein.
Key words: total flavones of Fructus Chorspondiatis; collagen type I; collagen type III; cardiac fibroblasts;
angiotensin II

心肌纤维化 (myocardial fibrosis, MF) 常伴随
风湿性心脏病、高血压、心肌梗死及心力衰竭等多种
心血管疾病, 在增龄和冠状动脉粥样硬化过程中也

收稿日期: 2013-05-28; 修回日期: 2013-08-23.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81060362); 内蒙古自治区自
然科学基金资助项目 (2009BS1204).
*通讯作者 Tel: 86-471-6921592, Fax: 86-471-6929047,
E-mail: yangyumin331@126.com
会发生 MF[1]。MF 又称为心脏胶原网络重构, 以心
肌胶原浓度的显著升高或心肌胶原容积分数的明显
增加为特征 , 主要表现为心脏成纤维细胞 (cardiac
fibroblasts, CFs) 数目增多、胶原合成增加而降解减
少, 从而导致心肌细胞外间质胶原过度沉积, I、III型
胶原不成比例地增多与排列紊乱[2]。I、III 型胶原表
达增加引起心肌间质胶原过度沉积是 MF 的关键环
节, 多种神经体液因素、机械牵张以及细胞内的氧化
DOI:10.16438/j.0513-4870.2014.01.011
包俊萍等: 广枣总黄酮对体外培养大鼠心脏成纤维细胞 I, III型胶原 mRNA及蛋白表达的影响 · 137 ·

应激均可调节 CFs表达 I、III型胶原[3]。心肌间质纤
维性胶原成分的增多是 MF 形成的重要原因和病理
学基础。
广枣为漆树科植物南酸枣 Choerospondias axillaries
Roxb. Burtt et Hill的干燥成熟果实, 为蒙医习用药材,
现收载于 2010版《中国药典》一部。广枣性味甘、酸、
平, 具有行气活血、养心安神之功效, 多用于气滞血
瘀、胸痹作痛、心悸气短、心神不安等心血管疾病的
治疗[4]。近年来, 从广枣分离出多种化学成分, 其中
广枣总黄酮 (total flavones of Fructus Chorspondiatis,
TFFC) 具有抗心律失常[5]、增强免疫功能[6]、抗缺氧
和改善心肌缺血[7]、抑制血小板聚集及改善血液流变
学各项指标作用[8]。但目前尚未见到 TFFC对 CFs的
胶原合成作用的研究报道, 鉴于MF参与高血压左室
肥厚、缺血性心脏病和充血性心力衰竭等许多心血管
疾病的病理过程, 而广枣对这些疾病又具有确切的
治疗作用, 其药理机制虽未阐明, 但作者认为抑制
MF很可能是 TFFC治疗这些心血管疾病的机制之一。
为此, 本研究拟通过体外实验构建 MF 细胞模型, 以
血管紧张素 II 受体阻滞剂缬沙坦 (valsartan) 为对照,
探索 TFFC 对大鼠 CFs 分泌胶原 I、III 亚型 mRNA
及蛋白表达水平的影响, 进而从基因表达和蛋白翻
译的水平探讨 TFFC抗 MF的作用机制。

材料与方法
主要仪器与试剂 PCR 仪 (Perkin-Elmer 公司);
紫外凝胶成像系统 (UVP公司); Mode l680型酶标仪
(BIO-RAD公司); TU-1810紫外可见分光光度计 (北
京普析通用仪器公司)。
胰蛋白酶、四甲基氮唑蓝 (MTT)、血管紧张素
II (angiotensin II, Ang II) (Sigma公司); DMEM高糖
培养基 (Gibco公司, DMEM干粉 13.5 g + 三蒸水约
900 mL + NaHCO3 3.7 g, 调 pH 7.2, 定容 1 L, 过滤除
菌, 分装于 250 mL瓶中); 超级小牛血清 (FCS, 杭州
四季青生物研究所); 小鼠纤维连接蛋白 (fibronectin,
Fn) 单克隆抗体及小鼠平滑肌肌动蛋白 (α-actinin) 单
克隆抗体 (武汉博士德生物工程公司); 胶原 I, III亚
型及磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 对引物 (上海赛百
胜公司); I型及 III型胶原单克隆抗体和 β-actin多克
隆抗体 (Santa Cruz公司); RNA酶抑制剂 (RNasin)、
AMV 逆转录酶、Taq 酶和 dNTP (Promega 公司);
HPD100大孔吸附树脂 (河北沧州宝恩化工有限公司);
缬沙坦 (valsartan, 北京诺华制药股份有限公司, 纯
度 99.5%); 广枣药材由内蒙古国际蒙医医院提供,
TFFC (主要黄酮成分为槲皮素的葡萄糖苷和金丝桃
苷, 得率为 4.86%, 纯度为 53.65%) 的制备参照舒亮
等[9]研究工艺提取制备; 芦丁对照品购于中国食品药
品检定研究院。
实验动物 SPF级Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 体
重 (16 ± 1.1) g, 许可证号: SCXK (浙) 2008-0115, 由
浙江中医药大学实验动物中心提供。
CFs培养及鉴定 在无菌条件下取 SD大鼠的心
室, 剪碎, 磷酸盐缓冲液冲洗, 用 0.125% 胰蛋白酶在
37 ℃分散细胞, 每 5 min收集 1次细胞。离心 2次,
将所得全部细胞置于 100 mL培养瓶中, 加入含 10%
FCS的 DMEM培养液 8 mL, 在 5% CO2、37 ℃孵箱
中培养 60 min, 采用差速贴壁法分离 CFs[10]。待 CFs
生长接近融合时以 1∶2 传代。在倒置显微镜下, 细
胞呈梭形、多角形, 细胞质透明, 胞核椭圆形, 颜色
淡, 常含有 2～3个核。培养至第 4天时, CFs出现集
落样迅速生长, 呈放射状、螺旋状、瀑布状、编织状
排列。经免疫组化检查: 几乎所有细胞纤维粘连蛋白
(Fn) 染色阳性 (胞浆中可见棕黄色颗粒) 和平滑肌
肌动蛋白染色阴性 (未见棕黄色颗粒), 证实为所需
的 CFs, 纯度达 0.98。实验采用 2～3代细胞。
I型、III型胶原 mRNA表达测定
实验分组 取第 2～3代 CFs, 0.25% 胰酶消化制
备细胞悬液, 调细胞密度 2.5×104/mL, 每孔 200 μL,
接种在 96孔板中, 在 37 ℃ 5% CO2及饱和湿度下培
养, 24 h后换无血清 DMEM, 继续孵育 24 h, 使细胞
生长同步化, 分别加如下各种处理因素: ① 空白组
(control): 加入无血清DMEM 10 μL; ② Ang II组: 加
入无血清 DMEM 5 μL, Ang II (溶于无血清 DMEM,
终浓度为 100 nmol·L−1) 5 μL; ③ TFFC + Ang II组: 加
入Ang II (溶于无血清DMEM, 终浓度为 100 nmol·L−1)
5 μL 和 TFFC (溶于无血清 DMEM, 终浓度分别为
25、50、100 mg·L−1) 5 μL; ④ Ang II + Valsartan组: 加
入Ang II (溶于无血清DMEM, 终浓度为 100 nmol·L−1)
5 μL 和 valsartan (溶于无血清 DMEM, 终浓度为 1
μmol·L−1) 5 μL。
培养细胞总 RNA制备[11] 药物作用 72 h, 预冷
PBS洗涤后, 按 Trizol试剂说明书提取CFs的总RNA,
紫外分光光度法测定 RNA的浓度与纯度。① 收获细
胞用 3～5 mL细胞裂解液 (D液) 溶解, 移于 10 mL离
心管, 再加入 3～5 mL苯酚溶液, 0.3～0.5 mL乙酸钠,
0.6～1 mL氯仿−异戊醇 (49∶1) 混合液, 振摇 10 s,
置冰浴 15 min。4 ℃离心, 10 000×g, 20 min。② 吸上
层水相至新的离心管中 , 加等体积异戊醇 , 混匀 ,
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−20 ℃沉淀 1 h以上。4 ℃离心, 10 000×g, 20 min。③
弃上清液, 沉淀物溶解于 0.5 mL D液中, 移至 1.5 mL
Eppendorf 管中, 加等体积异戊醇, 混匀, −20 ℃, 再
次沉淀 1 h以上。4 ℃离心, 10 000×g, 20 min。④ 弃
上清液, 沉淀物用 TES 溶液 200 μL溶解, 加乙酸钠
(2 mol·L−1) 20 μL, 双倍体积 (440 μL) 无水乙醇, 摇
匀, 置 −80 ℃冰箱, 20～30 min。4 ℃离心, 10 000×g,
20 min。⑤ 弃上清液, 沉淀 (RNA) 经真空干燥, 溶
于 20～50 μL DEPC 水中, 置 −80 ℃冰箱待用。⑥
RNA浓度定量, 用分光光度法测定 260 nm和 280 nm
的吸收度 (A), 计算样品中的核酸浓度, A值为 1相当
于 40 μg·mL−1 RNA。
RT-PCR引物设计[12] 从 GenBank中检出扩增鼠
I、III型胶原及磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 基因上、
下游引物的序列, 引物序列如下: GAPDH 上游引物
5-GCTGCGGCTCACCTGAAGC-3, 下游引物 5-GG
ATGACCTrGCCCACAGCC-3; I型胶原上游引物 5-
TGGTCCTCAAGGTTTCCAAG-3, 下游引物 5-GCA
ATACCAGGAGCACCATT-3; III型胶原上游引物 5-
TGCCCACAGCCTTCTACACCT-3, 下游引物 5-CAG
CCATTCCTCCCACTCCAG-3。
RT-PCR定量 以GAPDH为内对照, 用相同mRNA
为模板, 进行RT-PCR扩增, 对扩增产物进行半定量。
RT-PCR反应 ① cDNA第 1链的合成: 反应体
积为 20 μL, 成分如下: 样品总 RNA或 mRNA 4 μg,
5×逆转录酶缓冲液4 μL, AMV逆转录酶20 U, RNasin
20 U, dNTPs 2 μL, 下游引物 50 pmol, 去离子水补至
20 μL。42 ℃反应 30～60 min, 95 ℃灭活逆转录酶 10
min。② PCR: 上述逆转录产物 20 μL, 10×PCR反应
液 5 μL, 上游引物 50 pmol, Taq酶 2.5 U, 去离子水补
至 50 μL, 在适当温度下扩增 30个循环。应用 3% 琼
脂糖凝胶电泳分离 RT-PCR 产物, 用 UVP 公司透射
扫描仪对琼脂糖凝胶电泳RT-PCR产物进行图像分析,
测得其与 GAPDH 吸收值的比值作为 mRNA 的相对
表达量。
I型、III型胶原蛋白表达测定
实验分组 取第 2～3代 CFs, 0.25% 胰酶消化制
备细胞悬液, 调细胞为 2.5×104/mL, 每孔 200 μL, 接
种在 96 孔板中, 在 37 ℃ 5% CO2及饱和湿度下培
养, 24 h后换无血清 DMEM, 继续孵育 24 h, 使细胞
生长同步化, 按实验分组 (每组重复 3 孔, n = 3), 分
别加如下各种处理因素: ① 空白组 (control): 无血清
DMEM 10 μL; ② Ang II组: 无血清 DMEM 5 μL和
Ang II (溶于无血清 DMEM, 终浓度为 100 nmol·L−1)
5 μL; ③ TFFC + Ang II组: Ang II (溶于无血清 DMEM,
终浓度为 100 nmol·L−1) 5 μL和 TFFC (溶于无血清
DMEM, 终浓度分别为 25、50、100 mg·L−1) 5 μL;
④ Ang II + Valsartan组: Ang II (溶于无血清 DMEM,
终浓度为 100 nmol·L−1) 5 μL和 valsartan (溶于无血清
DMEM, 终浓度为 1 μmol·L−1) 5 μL。
蛋白检测 采用 Western blotting 法[13]检测心脏
成纤维细胞 I 型和 III 型胶原蛋白表达, 加入各种处
理因素后的 CFs, 于 37 ℃, 5% CO2培养箱内孵育培
养 72 h。收取上清, 并检测 I 型和 III 型胶原蛋白表
达。主要步骤包括按照蛋白标准曲线测定细胞上清中
蛋白含量; SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (每个加样空孔
中蛋白上样量为 90 μg); 转膜及 I型、III型胶原蛋白
和 β-actin 蛋白 (内对照) 的印迹杂交 (其中 I 型、III
型胶原单克隆抗体和 β-actin 多克隆抗体稀释度均为
1∶200, 显色剂为 DAB)。硝酸纤维膜上 I型和 III型
胶原蛋白表达的条带用自动图像分析系统 (北航彩
色图象分析系统) 进行灰度扫描, 定量分析。
统计学分析 所有实验数据均以均数 ± SD 表
示 , 数据统计采用 SPSS13.0, 两组之间比较选用
Independent T-test 方法进行检验, 多组间比较选用
One-Way ANOVA进行检验。

结果
1 TFFC 对 Ang II 诱导的 CFs I 型、III 型胶原
mRNA表达的影响
RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分析结果显示: 采
用 Ang II刺激体外培养的 CFs, Ang II有促进心肌成
纤维细胞分泌 I 型和 III 型胶原的作用, I 和 III 型胶
原 mRNA 的表达量也显著增加, 与空白组比较有显
著性差异 (P < 0.01); TFFC 作用细胞后 I 和 III 型胶
原mRNA表达有不同程度降低, 不同剂量TFFC组中
I和 III型胶原 mRNA表达呈浓度依赖性下降 (图 1、
图 2)。
2 TFFC对 Ang II诱导的 CFs I型、III型胶原蛋白
表达的影响
Western blotting 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果
显示: 采用 Ang II刺激体外培养的 CFs, Ang II有促
进心肌成纤维细胞分泌 I 型和 III 型胶原蛋白表达的
作用, I和 III型胶原蛋白表达量也显著增加, 与空白
组比较有显著性差异 (P < 0.01); TFFC作用细胞后 I
和 III 型胶原蛋白表达量有不同程度降低, 不同剂量
TFFC组 I和 III型胶原蛋白表达量呈浓度依赖性下降
(图 3和 4)。
包俊萍等: 广枣总黄酮对体外培养大鼠心脏成纤维细胞 I, III型胶原 mRNA及蛋白表达的影响 · 139 ·



Figure 1 Effect of TFFC on mRNA expression of collagen type I in cardiac fibroblasts (A). RT-PCR was performed using total RNA
from cardiac fibroblasts. Lane 1: DNA marker; 2: Control; 3: Valsartan + angiotensin II; 4: TFFC 100 mg + angiotensin II; 5: TFFC
50 mg + angiotensin II; 6: TFFC 25 mg + angiotensin II; 7: Angiotensin II. Effect of TFFC on relative mRNA expression of collagen
type I (B). The results of collagen type I mRNA expression were expressed as relative to the corresponding densities of GAPDH bands.
Values were expressed as mean ± SD (n = 3). **P < 0.01 vs angiotensin II group. 100 nmol·L−1 angiotensin II increased mRNA
expression of collagen type I in cardiac fibroblasts after 72 h incubation. TFFC inhibited collagen type I mRNA expression in a dose-
dependent manner


Figure 2 Effect of TFFC on mRNA expression of collagen type III in cardiac fibroblasts (A). RT-PCR was performed using total
RNA from cardiac fibroblasts. Lane 1: DNA marker; 2: Control; 3: Valsartan + angiotensin II; 4: TFFC 100 mg + angiotensin II;
5: TFFC 50 mg + angiotensin II; 6: TFFC 25 mg + angiotensin II; 7: Angiotensin II. Effect of TFFC on relative mRNA expression of
collagen type III (B). The results of collagen type III mRNA expression were expressed as relative to the corresponding densities of
GAPDH bands. Values were expressed as mean ± SD (n = 3). **P < 0.01 vs angiotensin II group. 100 nmol·L−1 angiotensin II
increased mRNA expression of collagen type III in cardiac fibroblasts after 72 h incubation. TFFC inhibited collagen type III mRNA
expression in a dose-dependent manner

讨论
CFs 的主要功能是产生和分泌大多数的细胞外
基质蛋白及一些重要的调节因子, 对于维持正常的
心脏组织结构及功能具有重要意义[14]。近年来的研
究表明, CFs增殖和/或胶原蛋白 (主要是 I、III型胶
原) 合成分泌过度增加是 MF的细胞生物学基础, 多
种促纤维化因素均可促进离体培养的 CFs 增殖和/或
表达 I、III型胶原, 并且 MF可能是心肌重塑过程中
心功能由代偿转变为失代偿的关键环节[14, 15]。
I 型和 III 型胶原是 CFs 分泌的心肌间质的主要
部分。正常条件下, 胶原能够维持心脏的几何构型,
保证心肌舒缩协调并参与心肌损伤的修复, 胶原的
张力、含量, 是决定心肌顺应性的主要因素。在心肌
肥大和心肌纤维化等病理状态下, 由于心肌成纤维
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Figure 3 Effect of TFFC on collagen type I protein level.
Collagen type I protein level was detected by Western blotting
(A). Lane 1: Control; 2: Valsartan + angiotensin II; 3: TFFC
100 mg + angiotensin II; 4: TFFC 50 mg + angiotensin II; 5: TFFC
25 mg + angiotensin II; 6: Angiotensin II. Effect of TFFC
on relative protein level of collagen type I (B). The results of
collagen type I protein level were expressed as relative to the
corresponding densities of β-actin bands. Values were expressed
as mean ± SD (n = 3). *P < 0.01 vs angiotensin II group. 100
nmol·L−1 angiotensin II increased protein level of collagen type I
in cardiac fibroblasts after 72 h incubation. TFFC inhibited
collagen type I protein level in a dose-dependent manner

细胞异常增殖、过多的分泌胶原以及胶原降解能力的
下降, 从而导致心肌僵硬度增加, 心肌顺应性下降,
心脏舒张功能及收缩功能皆受损。
目前研究表明肾素−血管紧张素−醛固酮系统在
MF的形成和发展中起到至关重要的作用[16], Ang II具
有较强的致MF作用, 它可以通过血管紧张素 II-1型
受体 (angiotensin II type 1 receptor, AT1R) 的介导直
接作用于 CFs, 引起胶原合成的增加[17]。现已证实:
CFs 表面存在着 Ang II 的受体[18], 在大鼠 CFs 表面
AT1R是最主要的亚型, 而且 Ang II的绝大部分生物
学效应 (包括刺激胶原合成) 也是由 AT1R 介导完成
的[19]。因此, 本实验用 Ang II 刺激体外培养的 CFs,
观察 TFFC及 Ang II对其胶原合成的影响, RT-PCR
产物和Western blotting结果显示: Ang II显著地促进
CFs 的增殖及胶原合成, 具有明显的促纤维化作用;
TFFC能明显抑制 Ang II的这些作用, 降低 I型和 III
型胶原mRNA及蛋白的表达水平, 其作用呈浓度依赖

Figure 4 Effect of TFFC on collagen type III protein level (A).
Collagen type III protein level was detected by Western blotting.
Lane 1: Control; 2: Valsartan + angiotensin II; 3: TFFC 100 mg +
angiotensin II; 4: TFFC 50 mg + angiotensin II; 5: TFFC 25 mg +
angiotensin II; 6: Angiotensin II. Effect of TFFC on relative
protein level of collagen type III (B). The results of collagen
type III protein level were expressed as relative to the corresponding
densities of β-actin bands. Values were expressed as mean ± SD
(n = 3). **P < 0.01 vs angiotensin II group. 100 nmol·L−1
angiotensin II increased protein level of collagen type III in
cardiac fibroblasts after 72 h incubation. TFFC inhibited collagen
type III protein level in a dose-dependent manner

性。从本实验结果可以看出, TFFC对 Ang II诱导的
心肌纤维化大鼠模型具有防治作用, 其机制可能与
TFFC 可抑制 CFs 胶原 I 型、III 型 mRNA 及蛋白的
表达有关。但 TFFC对将来应用于临床心肌纤维化治
疗的确切药理学机制及作用途径仍有待进一步研究。
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