全 文 ：第 44 卷第 5 期
2016 年 3 月
广 州 化 工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 44 No. 5
Mar. 2016
响应面法优化野生蛤蒌多糖提取工艺*
巫宝霞，杨桂珍，温智幸，姚小珍，林楚婷，钟 慧
(岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048)
摘 要:采用 3，5 －二硝基水杨酸法(DNS法)测定野生蛤蒌中多糖的含量及采用响应面设计法(ＲSM)优化野生蛤蒌多糖的
提取条件。超声波辅助提取野生蛤蒌多糖，利用单因素试验和响应面法相结合的方法，确定最佳条件。通过试验，最佳测试波长
为 510 nm、显色剂用量为 1. 5 mL、显色时间 5 min、HCl溶液的用量为 0. 15 mL，水解时间为 20 min;在单因素试验基础上，结合
响应面法优化确定提取野生蛤蒌多糖的最佳工艺条件如下:超声功率 160 W，超声时间 15 min，超声温度 60 ℃，料液比 1∶16。
此条件下蛤蒌的提取率为 12. 20%。
关键词:响应面法;蛤蒌;多糖;超声波提取;DNS法
中图分类号:TS201. 1 文献标志码:B 文章编号:1001 － 9677(2016)05 － 0089 － 05
* 基金项目:大学生创新训练项目 (201310579004)资助。
第一作者:巫宝霞 (1992 －) ，女，本科，在读学生。
通讯作者:杨桂珍。
Optimization of Extraction of Polysaccharide from Piper Sarmentosum
Ｒoxb by Ｒesponse Surface Methodology*
WU Bao － xia，YANG Gui － zhen，WEN Zhi － xing，YAO Xiao － zhen，LIN Chu － ting，ZHONG Hui
(Chemistry and Chemical Engineering，Lingnan Normal University，Guangdong Zhanjiang 524048，China)
Abstract:The determination of polysaccharide in piper sarmentosum roxb with 3，5 － Dinitrosalicylic acid colorimitry
and the improvement of measuring conditions for polysaccharide in piper sarmentosum roxb with ＲSM were studied. In this
experiment，with the assitant of the ultrasonic，we can draw a conlusion of the optimum conditions for the determination
with the combination of single factor test and ＲSM. Acoording to the experiment，the perfact wavelength，the dosage of
chromogeric，the coloring time，the dosage of saline solution and the hydrolysis time were determined as 510 nm，1. 5
mL，5 min，0. 15 mL and 20 min. On the basic of single factor test，when the optimal technical conditions including
ultrasonic power，ultrasound time，tempereture of ultrasonic and the ratio of material liquid can individually reach 160 W，
15 min，60 ℃ and 1∶16，it can get the highest extraction rate of polysaccharide in wild clams with ＲSM. The highest
extraction ratio can reach 12. 20%.
Key words:the response surface method;piper sarmentosum roxb;polysaccharide ultrasonic extraction;DNS
colorimetry
蛤蒌，为胡椒科胡椒属植物，别名假蒌、大柄蒌、山蒌、
毕拔子，为野生匍匐或攀援藤本，叶子有一种特异的香味［1］。
另因其具有医疗保健功效，目前有将其制成美味菜肴［2］，其实
可以作现代副食品作料以及添加剂，如作为保健品开发，或作
为特殊人群的保健食品 (即作为营养强化剂直接加入食品
中)［3］。另外，目前国内外对蛤蒌的提取物活性和其挥发油的
提取进行了研究［4 － 7］，近年来，随着生活水平提高，人们逐渐
注重健康保健，随之多糖作为保健食品［8 － 10］的成分已悄然兴
起。本研究通过采用响应面设计法［11 － 14］对蛤蒌提取物中多糖
的研究，从而为蛤蒌的食药两用及进一步开发提供科学的依
据。
1 实 验
1. 1 试验材料
蛤蒌(供试)采摘于湛江市;由中国食品药品检定研究所提
供芦丁标准样品;供试试剂:盐酸、无水乙醇、氢氧化钠均为
分析纯。
DNS显色试剂的配制:参考文献［12］，加以修改。具体配
制方法为:称取 10. 5 g NaOH 固体配成浓溶液，再准确称取
DNS 3. 15 g溶于约 200 mL水中，在温度为 45 ℃水浴条件下边
搅拌边依次加入 91 g酒石酸钾钠，完全溶解后依次加入 NaOH
浓溶液，2. 5 g苯酚及 2. 5 g无水亚硫酸钠，待完全溶解后，将
溶液冷却至室温，然后转移至 500 mL 容量瓶中，定容，摇匀
后转移至棕色瓶中，室温放置一周后使用。
供试仪器:UV － 1100 型紫外可见分光光度计，上海美普
达仪器有限公司;AUY120 型电子分析天平，日本岛津天平有
90 广 州 化 工 2016 年 3 月
限公司;GZX － 9070MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有
限公司医疗设备厂;FW －200 型高速万能粉碎机，北京中兴伟
业仪器有限公司;SB － 3200DTDN 超声波清洗机，宁波新芝生
物科技股份有限公司;SHZ － D 循环水式真空泵，河南巩义市
英峪豫华仪器厂。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 材料预处理
将当地采摘的精心挑选出叶子完好、绿色的蛤蒌叶，用自
来水洗 3 次，再用蒸馏水重复洗 3 次。置于烘箱中 80 ℃恒温烘
干至恒重，用粉碎机粉碎过筛，贮于玻璃瓶(干燥带塞) ，置于
干燥器中待用。
1. 2. 2 提取剂的筛选
准确称取 6 份已处理好的蛤蒌粉 1. 000 g 于洁净圆底烧瓶
中，加入 16 mL的无水乙醇以去除有色物质、单糖、低聚糖和
小分子物质［10］，置于恒温 80 ℃的恒温水浴锅中回流 1 h 后抽
滤，取滤渣分别加入用蒸馏水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙
醇、50%乙醇、60% 乙醇等 6 种不同提取剂各 16 mL，在
60 ℃，功率为 250 W，时间为 15 min下超声。抽滤，各吸取滤
液 0. 5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入 0. 15 mL 6 mol /L 盐
酸于一支，20 min 沸水浴，快速冷却加入 4 mol /L NaOH 调节
pH至 9，两支各加入 1. 5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷
却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为 510 nm) ，重复
三次。
1. 2. 3 液料比对多糖提取效果的影响
准确称取待用的蛤蒌粉 1. 000 g 5 份于 250 mL洁净圆底烧
瓶中，分别加入 12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL的无水
乙醇，置于恒温 80 ℃的恒温水浴锅中回流 1 h后抽滤，取滤渣
分别加入蒸馏水 12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL，在
60 ℃、功率为 250 W、时间为 15 min下超声。抽滤，各吸取滤
液 0. 5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入 0. 15 mL 6 mol /L 盐
酸于一支，20 min 沸水浴，快速冷却加入 4 mol /L NaOH 调节
pH至 9，两支各加入 1. 5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷
却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为 510 nm) ，重复
三次。
1. 2. 4 超声温度对多糖提取效果的影响
准确称取待用的蛤蒌粉 1. 000 g 5 份于 250 mL洁净圆底烧
瓶中，加入 16 mL 的无水乙醇，置于恒温 80 ℃的恒温水浴锅
中回流 1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水 16 mL，分别在 25 ℃、
40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，功率为 250 W，时间为 15 min下
超声。抽滤，各吸取滤液 0. 5 mL 于两支比色管 (25 mL)中，
加入 0. 15 mL 6 mol /L 盐酸于一支，20 min 沸水浴，快速冷却
加入 4 mol /L NaOH 调节 pH 至 9，两支各加入 1. 5 mL DNS 试
剂，5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸
光度(波长为 510 nm) ，重复三次。
1. 2. 5 超声时间对多糖提取效果的影响
准确称取 5 份已处理好的蛤蒌粉 1. 000 g 于洁净圆底烧瓶
中，加入 16 mL的无水乙醇，置于恒温 80 ℃的恒温水浴锅中
回流 1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水 16 mL、在 25 ℃、功率为
250 W，时间为 10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 下超
声。抽滤，各吸取滤液 0. 5 mL于两支比色管 (25 mL)中，加
入 0. 15 mL 6 mol /L 盐酸于一支，20 min 沸水浴，快速冷却加
入 4 mol /L NaOH调节 pH至 9，两支各加入 1. 5 mL DNS 试剂，
5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度
(波长为 510 nm) ，重复三次。
1. 2. 6 超声功率对多糖提取效果的影响
准确称取 5 份已处理好的蛤蒌粉 1. 000 g 于洁净圆底烧瓶
中，加入 16 mL的无水乙醇，置于恒温 80 ℃的恒温水浴锅中
回流 1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水 16 mL，在 25 ℃，功率为
100 W、130 W、160 W、190 W、220 W，时间为 10 min 下超
声。抽滤，各吸取滤液 0. 5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入
0. 15 mL 6 mol /L 盐酸于一支，20 min 沸水浴，快速冷却加入
4 mol /L NaOH 调节 pH 至 9，两支各加入 1. 5 mL DNS 试剂，
5 min 沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度
(波长为 510 nm) ，重复三次。采用 DNS 法分别测定样品提取
液中还原糖和总糖的单糖含量，总糖与还原糖吸光度值的差就
是样品中多糖水解为还原糖部分的吸光度值(A多糖 = A总糖 －
A还原糖)。
多糖提取率 =
A多糖
m ×100%
式中:m———蛤蒌质量
1. 2. 7 响应面优化设计试验
在单因素试验的基础上，以蛤蒌多糖提取率(Y)为响应值，
用 Box － Behnken 试验设计原理，选取液料比、超声温度、超声
时间及超声功率为响应变量，用四因素三水平的响应面分析方
法对蛤蒌叶多糖提取工艺进行优化。响应面分析因素与水平表
见表 1。
表 1 Box － Behnken 设计方案 (BBD)
实验水平
(A)料液
比 /(g /mL)
(B)超声
时间 /min
(C)超声
温度 /℃
(D)超声
功率 /W
1 1∶14 10 50 36
2 1∶16 15 60 44
3 1∶18 20 70 50
2 结果与分析
2. 1 提取剂的筛选
由表 2 可知在 6 种提取剂中，吸光度最高是蒸馏水提取剂，
吸光度达到 0. 035，而其他 5 种提取剂时的吸光度均在 0. 024 ～
0. 033 内，均比蒸馏水提取剂低。故以下试验中都采用蒸馏水
为提取剂。
表 2 蛤蒌多糖在不同溶剂中的溶解性
提取溶剂 吸光度 提取率
蒸馏水 0. 035 0. 035
20%乙醇 0. 03 0. 03
30%乙醇 0. 026 0. 026
40%乙醇 0. 024 0. 024
50%乙醇 0. 032 0. 032
60%乙醇 0. 033 0. 033
2. 2 不同液料比的选择
从图 1 可知，当提取剂体积小于 16 mL 时，随体积的增
大，其吸光度不断增大，随之逐渐变小。当提取剂体积为
16 mL，即液料比为 1∶16 (g∶mL)时的吸光度值为最大，达到
0. 067，其多糖提取效果最佳。当提取剂体积大于 16 mL 时，吸光
度则随提取剂体积的增大而不断下降，这可能由于达到最高提取
率后再提高液料比，浓度被稀释，吸光度又会下降。当提取剂体
积为 18 mL时，多糖提取液吸光值下降到最小值，为 0. 049。
第 44 卷第 5 期 巫宝霞，等:响应面法优化野生蛤蒌多糖提取工艺 91
图 1 提取剂的影响
2. 3 不同超声时间的选择
从图 2 可知，在 10 ～ 15 min时，随超声时间增长，吸光度
增大，在 15 min 达到最高，此时吸光度最大，为 0. 093 而在
20 ～ 35 min 间，随超声时间增长，吸光度反而下降，从 0. 078
下降到 0. 042，这主要是多糖随提取时间延长而发生分解致使
其吸光度下降。
图 2 超声功率的影响
2. 4 不同超声温度的选择
从图 3 可知，随温度升高，吸光度不断增加，当温度达到
60 ℃时吸光度达到最大值，为 0. 068。此后，吸光度值随温度
的升高而不断下降。在 70 ℃和 80 ℃时的吸光值分别为 0. 054、
0. 053，基本达到一个平衡值。因此，当其他条件一定时，蛤
蒌多糖提取的最适温度为 60 ℃。
图 3 超声提取时间的影响
2. 5 不同超声功率的选择
从图 4 可知，随功率的增大，吸光度不断增加，当功率达
到 160 W时吸光度达到最大值，为 0. 074。此后，吸光度值随
功率的增大而不断下降。因此，当其他条件一定时，蛤蒌多糖
提取的最适功率为 160 W。
图 4 微波功率的影响
2. 6 试验结果与模型建立
表 3 BBD实验结果
实验号
(A)
料液比
(B)
超声时间
(C)
超声温度
(D)
超声功率
多糖提取
率 /%
1 － 1 － 1 0 0 4． 99
2 1 0 0 － 1 9． 1
3 1 0 － 1 0 7． 9
4 0 1 0 1 8． 7
5 0 － 1 0 － 1 6． 49
6 － 1 1 0 0 6． 89
7 0 1 0 － 1 6． 73
8 0 － 1 － 1 0 6． 92
9 0 0 0 0 12． 4
10 1 － 1 0 0 7． 29
11 0 1 1 0 7． 37
12 0 1 － 1 0 7． 11
13 0 0 1 1 8． 54
14 － 1 0 0 － 1 6． 28
15 － 1 0 － 1 0 5． 97
16 － 1 0 1 0 5． 89
17 － 1 0 0 1 6． 39
18 0 － 1 1 0 6． 38
19 0 0 1 － 1 6． 81
20 0 － 1 0 1 6． 88
21 0 0 0 0 12． 5
22 1 1 0 0 8． 71
23 0 0 0 0 12． 5
24 0 0 0 0 11． 5
25 1 0 0 1 8． 19
26 0 0 － 1 － 1 5． 78
27 0 0 － 1 1 5． 69
28 0 0 0 0 11． 1
29 1 0 1 0 5． 98
92 广 州 化 工 2016 年 3 月
依表 1 进行 4 个因素 (液料比、超声温度、超声时间、超
声功率)与多糖提取率之间的 4 因素 3 水平响应面法优化实
验，试验方案和结果详见表 3。对 4 个变量中心复合设计后所
测得的蛤蒌多糖提取率结果见表 2 所示。
用 Design Expert 8. 05 软件对表 3 数据进行二次多元回归
拟合，得以提取液的吸光度 Y(即多糖提取率)对编码自变量
A、B、C、和 D 的二次多项回归方程多糖提取率 = 0. 12 +
0. 011A + 5. 467E － 003B + 3. 385E － 003C + 5. 741E － 003D －
1. 225E － 003AB + 2. 303E － 003AC － 2. 550E － 003AD + 1. 975E －
003BC + 3. 950E － 003BD － 4. 622E － 003CD － 0. 024A2 － 0. 026B2
－ 0. 028C2 － 0. 025D2
式中 A、B、C、D分别为料液比、超声时间、超声温度和
超声功率的编码值。
据方差分析结果，上述回归方程描述与响应面值之间的关
系时因其模型的极显著(P≤0. 01) ，差拟项检验的 P = 0. 2759 ＞
0. 05(不显著) ，表明模型充分拟合试验数据，该方程是蛤蒌多
糖提取率与提取工艺各参数的合适数学模型，所以，可以利用
此回归方程确定蛤蒌多糖提取率的最佳提取工艺。一次项 A、
B，二次项 A2、B2、C2、D2 影响显著。即料液比，超声时间对
多糖提取率的影响最为显著。
表 4 方差分析
参数 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0． 012 14 8． 87E － 04 12． 41 ＜ 0． 0001 ＊＊
A 9． 65E － 04 1 9． 65E － 04 13． 5 0． 0025 ＊＊
B 3． 59E － 04 1 3． 59E － 04 5． 02 0． 0418 *
C 2． 13E － 05 1 2． 13E － 05 0． 3 0． 5934
D 8． 53E － 05 1 8． 53E － 05 1． 19 0． 2929
AB 5． 76E － 06 1 5． 76E － 06 0． 081 0． 7806
AC 8． 46E － 05 1 8． 46E － 05 1． 18 0． 2948
AD 2． 60E － 05 1 2． 60E － 05 0． 36 0． 556
BC 1． 60E － 05 1 1． 60E － 05 0． 22 0． 6434
BD 6． 24E － 05 1 6． 24E － 05 0． 87 0． 3659
CD 8． 28E － 05 1 8． 28E － 05 1． 16 0． 2999
A2 4． 09E － 03 1 4． 09E － 03 57． 19 ＜ 0． 0001 ＊＊
B2 3． 74E － 03 1 3． 74E － 03 52． 28 ＜ 0． 0001 ＊＊
C2 5． 51E － 03 1 5． 51E － 03 77． 13 ＜ 0． 0001 ＊＊
D2 3． 31E － 03 1 3． 31E － 03 46． 36 ＜ 0． 0001 ＊＊
残差 1． 00E － 03 14 7． 15E － 05
失拟项 8． 28E － 04 10 8． 28E － 05 1． 93 0． 2759 不显著
纯误差 1． 72E － 04 4 4． 30E － 05
总离差 0． 013 28
2. 7 响应面分析
从响应面 (其是响应值对各试验因子 A、B、C 和 D 所构
成的三维空间的曲面图)分析图上可形象地看出最佳参数及各
参数之间的相互作用，依据回归方程得出不同因子的响应面分
析图及相应等值线图，结果见图 5 ～图 10。
从图 5 ～图 10 中可较直观地看出各因素交互作用对蛤蒌中
多糖得率的影响，当曲线越陡峭，表明该因素对多糖得率的影
响越大，则相应表现为响应值变化的大小。从等高线图可看出
存在极值的条件应在圆心处。从图 5 ～图 10 可以看出对多糖的
得率影响最大是料液比，其次是超声时间，表 3 回归分析结果
也正与此相吻合，料液比和超声时间二者对应的 P 值小于
0. 05，均达到了显著水平。
图 5 料液比和时间对多糖产率影响的响应面 3D图
图 6 料液比和温度对多糖产率影响的响应面 3D图
图 7 料液比和功率对多糖产率影响的响应面 3D图
图 8 时间和温度对多糖产率影响的响应面 3D图
第 44 卷第 5 期 巫宝霞，等:响应面法优化野生蛤蒌多糖提取工艺 93
图 9 功率和时间对多糖产率影响的响应面 3D图
图 10 温度和功率对多糖产率影响的响应面 3D图
2. 8 最佳工艺条件的验证
由 Design Expert 8. 05 软件得到蛤蒌多糖提取的最佳提取条
件为液料比 1∶16. 1 (g∶mL)、超声温度 61. 1 ℃、超声时间
15 min，超声功率 160W，在这条件下，蛤蒌多糖提取液的吸光
度为 0. 121。为了便于实际操作的情况，将最佳工艺条件修正
为液料比 1∶16 (g∶mL)、提取温度 61 ℃、提取时间15 min，
在这条件下进行三次平行实验，得到蛤蒌多糖提取液的平均吸
光度为 0. 122，从而说明采用响应面法得到的优化工艺结果是
可靠，具有一定的实用价值。
3 结 论
本研究采用响应面法优化蛤蒌多糖提取工艺参数，得出最
佳工艺条件如下:超声功率 160 W，超声时间 15 min，超声温
度 60 ℃，料液比 1V16，此条件下蛤蒌多糖的提取率预测值为
12. 10%，蛤蒌多糖的提取率实验值为 12. 20% ± 0. 25%，此条
件下与预测值十分接近，可说明模型比较可靠，为大规模提取
蛤蒌多糖提供了一定的参考。
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来看，当 SBS含量在 20%左右时，共混物表现出的性能最佳，
冲击强度得到很大提高，拉伸强度也没有下降很多。
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