全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(U303122);新药创制重大专项资助项目(2013ZX09103002)
作者简介:栾明，男，硕士研究生 研究方向:中药新药新剂型研究 * 通讯作者:张琳，女，副教授 研究方向:中药新药与中药生物技
术 Tel /Fax:(0571)87951301 E-mail:zhanglin@ zju. edu. cn
·论 著·
维药黑种草子中活性成分 HE-Ⅲ的大孔树脂纯化工艺研究
栾明1，2，李凌军1，高帅1，2，徐婵娟2，李锡敏3，李红亮2，张琳2* (1. 山东中医药大学药学院，济南 250014;2. 浙江大学生
物医学工程与仪器科学学院，杭州 310027;3. 常熟求是科技有限公司，江苏 常熟 215500)
摘要:目的 优选黑种草子中常春藤皂苷元-3-O-［β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基］-28-O-［α-L-
鼠李糖基(1→4)-β-D-葡糖基-(1→6)-β-D-葡糖苷］(HE-Ⅲ)的大孔树脂纯化工艺。方法 通过静态吸附和解吸实验筛选树脂
型号，采用单因素实验和正交实验考察 HE-Ⅲ的大孔树脂纯化工艺。结果 采用 AB － 8 型大孔树脂，最佳纯化工艺为上样液
质量浓度 0. 25 g药材·mL －1，上样流速 1. 5 BV·h －1，洗脱乙醇体积分数 70%，洗脱流速 3 BV·h －1。中间体 HE-Ⅲ含量达
47. 97%，收率为 76. 26%。结论 优选的工艺操作简单、稳定可行、重复性好，可推广于工业化生产应用。
关键词:黑种草子;HE-Ⅲ;正交实验;纯化工艺
doi:10. 11669 /cpj. 2014. 12. 002 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2014)12 － 1014 － 04
Purification Process of the Active Ingredient HE-Ⅲ from Nigella glandulifera Freyn et Sint by Macroporous
Ｒesin
LUAN Ming1，2，LI Ling-jun1，GAO Shuai1，2，XU Chan-juan2，LI Xi-min3，LI Hong-liang2，ZHANG Lin2* (1. College
of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China;2. College of Biomedical Engineering and In-
strument Science，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China;3. Changshu Qiushi Technology Co.，Ltd，Changshu 215500，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To optimize the purification process of 3-O-［β-D-xylopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-
α-L-arabinpyranosyl］-28-O-［α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl］-hederagenin(HE-Ⅲ)
from Nigella glandulifera Freyn et Sint by macroporous resin. METHODS Ｒesin model was screened by static adsorption and desorp-
tion test，and the purification process of HE-Ⅲ was investigated by single factor test and orthogonal test. ＲESULTS The optimum
purification process of AB － 8 macroporous resin was as follows:the concentration of sample liquid was 0. 25 g·mL －1，sample flow
rate was 1. 5 BV·h －1，the eluent was 70% ethanol，and the elution velocity was 3 BV·h －1. The content of HE-Ⅲ in the intermedi-
ate and yield rate were 47. 97% and 76. 26%，respectively. CONCLUSION The optimized process is simple and stable with good
repeatability，which is suitable for industrial production.
KEY WOＲDS:Nigella glandulifera Freyn et Sint;HE-Ⅲ;orthogonal test;purification process
黑种草子系维吾尔族习用药材，为毛茛科植物
腺毛黑种草(Nigella glandulifera Freyn et Sint. )的干
燥成熟种子，主要有补肾健脑，通经，通乳，利尿之功
效［1］。黑种草子富含挥发油和脂肪酸，尚含有黄
酮、生物碱、皂苷等化学成分［2-3］，具有抗氧化、降血
糖、抗肿瘤等其生物活性［4］，其中总皂苷具有显著
地抗肿瘤活性［5］。通过活性筛选发现，常春藤皂苷
元-3-O-［β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→
2)-α-L-阿拉伯糖基］-28-O-［α-L-鼠李糖基(1→4)-
β-D-葡糖基-(1→6)-β-D-葡糖苷］［2，6］(HE-Ⅲ)是总
皂苷抗肿瘤的主要成分，在黑种草子中含量高达
2. 75%。本实验建立了 HE-Ⅲ的 HPLC 测定方法，
采用单因素实验和正交实验对 HE-Ⅲ的大孔树脂纯
化工艺进行了研究。
1 仪器与材料
Millipore Synergy 超纯水系统(美国密理博公
司);Sartorius CP225D电子天平(德国赛多利斯有限
公司);JA2003N电子天平(上海精密科学仪器有限公
司);Shimadzu 10ATvp 高效液相色谱仪(日本岛津公
司)。AB －8、D101、HPD －100、HPD －300、X －5型大孔
吸附树脂(河北省沧州宝恩化工有限公司)。乙腈为色
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谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
黑种草子药材购于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市
(批号:20121025)，经浙江大学生物医学工程和仪器科
学学院张琳副教授鉴定为毛茛科植物腺毛黑种草(Ni-
gella glandulifera Freyn et Sint)的干燥成熟种子。
HE-Ⅲ对照品，自制，经面积归一化法计算，纯
度大于 98%。
2 HE-Ⅲ HPLC含量测定方法
2. 1 色谱条件及系统适用性实验
色谱柱:Agilent TC-C18(2)柱(4. 6 mm × 250
mm，5 μm)，流动相:乙腈-水(32 ∶ 68)，流速:1. 0
mL·min －1，检测波长:210 nm，柱温:40 ℃，进样量:
20 μL。在上述色谱条件下分析，HE-Ⅲ色谱峰与相
邻的色谱峰分离度均大于 1. 5，理论塔板数按 HE-
Ⅲ计算不低于 5 000。色谱图见图 1。
2. 2 对照品溶液的制备
精密称取 HE-Ⅲ对照品 25. 0 mg，用流动相溶解
并稀释至 25 mL 量瓶中，配成 1 mg·mL －1的储备
液，冷藏备用。
2. 3 供试品溶液的制备
精密称取榨油后的黑种草子残渣 5. 0 g，加 12 倍
量体积分数 70%乙醇回流提取 5次，每次 2 h，抽滤，合
并滤液，减压干燥，用体积分数 70%乙醇溶解并定容至
50 mL量瓶中。再取1. 0 mL至5 mL量瓶中，用体积分
数 70%乙醇定容至刻度，作为供试品溶液。
2. 4 线性关系
分别精密吸取 HE-Ⅲ对照品溶液 1. 0，2. 0，3. 0，
4. 0，5. 0 mL置 5 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，
摇匀，配成 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0 mg·mL －1系列标
准溶液，进样 20 μL 测定。以 HE-Ⅲ对照品溶液浓
图 1 维药黑种草子中活性成分 HE-Ⅲ对照品(A)及样品
(B)色谱图
Fig. 1 HPLC Chromatograms of HE-Ⅲ reference substance
(A)and sample(B)
度(μg·mL －1)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归
分析，得回归方程:Y = 2 863. 4ρ + 15 052(r2 =
0. 999 8)，线性范围 200 ～ 1 000 μg·mL －1。
2. 5 精密度实验
取 1. 0 mg·mL －1 HE-Ⅲ对照品溶液，连续进样
6 次，每次 20 μL，ＲSD为 0. 25%。
2. 6 重复性实验
精密称取同一批样品 6 份，按供试品溶液的制
备方法分别制备 6 份供试样品溶液，进样 20 μL 测
定，ＲSD为 2. 58%。
2. 7 稳定性实验
取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h进样
20 μL测定，ＲSD为 1. 63%，样品在 24 h内稳定。
2. 8 加样回收率实验
取 6 份已知含量样品，置 25 mL量瓶内，分别按
1∶ 1 加入 HE-Ⅲ对照品，用体积分数 70%乙醇稀释
至刻度。精密吸取 1. 0 mL，置 5 mL量瓶内，用体积
分数 70%乙醇稀释至刻度，进样 20 μL 测定，计算
回收 率。结 果 HE-Ⅲ 的 平 均 加 样 回 收 率 为
97. 91%，ＲSD为 2. 40%，见表 1。
3 大孔树脂纯化工艺优选
3. 1 黑种草子提取液的制备
取榨油后的黑种草子残渣适量，加 10 倍量体积
分数 70%乙醇回流提取 3 次，每次 1 h，合并滤液，
减压浓缩至无醇味，稀释成规定质量浓度。
3. 2 树脂型号筛选
3. 2. 1 树脂静态筛选［7］ 取上述 5 种经预处理的
湿树脂各 2. 0 g，分别置 100 mL具塞锥形瓶中，加入
提取液(0. 1 g生药·mL －1)45 mL，置振荡器中振荡
(振荡频率为 100 r·min －1)24 h，滤过，测定滤液中
剩余 HE-Ⅲ含量，结果 HE-Ⅲ比吸附率依次为
59. 47，60. 11，58. 90，59. 96，59. 09 mg·g －1湿树脂。
将吸附 HE-Ⅲ的树脂置 100 mL具塞锥形瓶中，加体
积分数 70% 乙醇 45 mL，振荡洗脱(振荡频率为
表 1 维药黑种草子中活性成分HE-Ⅲ加样回收率结果 . n =6
Tab. 1 Ｒesult of recovery test of HE-Ⅲ. n = 6
No.
m(Background)
/mg
m(Added)
/mg
m(Found)
/mg
Ｒecovery
/%
Average
recovery /%
ＲSD
/%
1 33. 25 33. 21 65. 93 98. 4
2 33. 25 33. 24 64. 96 95. 4
3 33. 25 33. 23 64. 73 94. 73 97. 91 2. 40
4 33. 25 33. 28 66. 58 100. 15
5 33. 25 33. 27 66. 61 100. 27
6 33. 25 33. 28 66. 04 98. 53
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中国药学杂志 2014 年 6 月第 49 卷第 12 期 Chin Pharm J，2014 June，Vol. 49 No. 12
100 r·min －1)24 h，离心，滤过，测定滤液中 HE-Ⅲ
含量，结果 HE-Ⅲ比解吸率依次为 51. 18，50. 50，
49. 75，54. 64，52. 03 mg·g －1湿树脂。综合静态饱
和比吸附率和比解吸率结果，选择 AB －8 树脂。
3. 2. 2 树脂动态饱和吸附量考察［8］ 取 AB － 8 湿
树脂 10. 0 g，取提取液(0. 1 g 生药·mL －1)220 mL
上样，测定流出液中 HE-Ⅲ的含量，结果 AB － 8 树
脂的动态饱和吸附量为 2. 77 g药材·g －1湿树脂。
3. 3 单因素实验
3. 3. 1 上样量考察 提取液(0. 25 g 药材·mL －1)
按 50%、60%、70%、80%、90%饱和吸附量上样(径
高比为 1∶ 5)，依次用 7 BV 蒸馏水和体积分数 70%
乙醇洗脱。HE-Ⅲ含量依次为 58. 05%、56. 03%、
62. 88%、55. 15%、50. 09%，得率依次为 2. 33%、
2. 29%、2. 35%、2. 24%、2. 00%，以 70%饱和吸附
量上样，HE-Ⅲ含量及得率均较高。
3. 3. 2 上样液质量浓度考察 取质量浓度分别为
0. 25、0. 5、1. 0、1. 25 g 药材·mL －1提取液，按 70%
饱和吸附量上样洗脱(径高比为 1∶ 5)，HE-Ⅲ含量依
次为 58. 45%、54. 75%、53. 20%、50. 91%，得率依次为
2. 04%、2. 02%、2. 04%、2. 00%，以质量浓度 0. 25 g 药
材·mL －1上样，HE-Ⅲ含量及得率均较高。
3. 3. 3 洗脱溶剂考察［9］ 取提取液(0. 25 g 药材·
mL －1)4份，按 70%饱和吸附量上样(径高比为1∶ 5)，
先用 7 BV蒸馏水洗脱、再分别用 7 BV 体积分数为
30%，50%，70%，90%乙醇洗脱。HE-Ⅲ含量依次
为 36. 14%、51. 65%、51. 84%、55. 76%，得率依次
为 1. 02%、1. 92%、2. 23%、2. 33%，用体积分数
70%和 90%乙醇洗脱时，HE-Ⅲ含量及得率均较高，
结合生产成本，选择体积分数 70%乙醇洗脱。
3. 3. 4 体积分数 70%乙醇洗脱量考察 取提取液
(0. 25 g药材·mL －1)，按 70%饱和吸附量上样(径
高比为 1∶ 5)，先用 7 BV蒸馏水冲洗，再用体积分数
70%乙醇冲洗，每 10 mL 收集 1 个流分，共收集 10
个流分，结果洗脱至 6 BV，HE-Ⅲ基本洗脱完全。
3. 4 正交实验
3. 4. 1 上样工艺正交实验优选 用正交实验，以
HE-Ⅲ含量及得率为评价指标，考察上样药液浓度、
上样流速、径高比对纯化工艺的影响。因素水平见
表 2。
取 9 根树脂柱，各加入 10. 0 g AB － 8 湿树脂，
按 70%饱和吸附量上样，分别用 7 BV蒸馏水，6 BV
体积分数 70%乙醇洗脱，结果见表 3、4。
方差分析结果表明，因素 A 具有显著影响，因
素 B、C无显著性影响。为节省时间，上样流速选择
B3;径高比太大不利于工业生产，径高比选择 C1。
最佳工艺为 A1B3 C1，即用 0. 25 g 药材·mL
－1药液
上样，上样流速 1. 5 BV·h －1，径高比 1∶ 3。
3. 4. 2 洗脱工艺正交实验优选 用正交实验，以
HE-Ⅲ含量及得率为评价指标，考察洗脱溶剂浓度、
溶剂用量、洗脱流速对纯化工艺的影响，因素水平见
表 5。
取 9 根树脂柱(径高比为 1∶ 3)，各加入 10. 0 g
AB － 8 湿树脂。按优选的工艺上样，用蒸馏水冲 7
BV，按照正交实验表进行洗脱，结果见表 6、7。
方差分析结果表明，因素 A 具有显著性影响，
A3 ＞ A2 ＞ A1，因 K2与 K3值比较接近，从节约成本考
虑，选择 A2;因素 B、C无显著性影响，从节约成本及
表 2 HE-Ⅲ上样吸附正交实验因素水平表
Tab. 2 Factor levels of orthogonal test for sample loading of
HE-Ⅲ
Levels
Factors
A Concentration of
sample liquid /g·mL －1
B Sample flow rate
/BV·h － 1
C Diameter
ratio
D Blank
1 0. 25 0. 5 1∶ 3 －
2 0. 5 1 1∶ 5 －
3 0. 75 1. 5 1∶ 8 －
表 3 HE-Ⅲ上样正交实验结果
Tab. 3 Ｒesult of orthogonal test for sample loading of HE-Ⅲ
No.
Factors
A B C D
Yield
/%
Content
/%
Score
1 1 1 1 1 1. 85 59. 73 96. 35
2 1 2 2 2 1. 92 53. 55 94. 34
3 1 3 3 3 1. 97 56. 46 97. 81
4 2 1 2 3 1. 83 49. 18 88. 67
5 2 2 3 1 1. 84 51. 18 90. 32
6 2 3 1 2 1. 88 50. 84 91. 31
7 3 1 3 2 1. 79 44. 57 84. 37
8 3 2 1 3 1. 87 43. 17 85. 86
9 3 3 2 1 1. 76 42. 91 82. 34
K1 96. 17 89. 80 91. 17 89. 67
K2 90. 10 90. 17 88. 45 90. 01
K3 84. 19 90. 49 90. 83 90. 78
Ｒ 11. 98 0. 69 2. 38 1. 11
表 4 HE-Ⅲ上样方差分析表
Tab. 4 ANOVA Ｒesult of sample loading test of HE-Ⅲ
Source Sum of squares df Mean square F P
A 215. 173 2 107. 587 110. 715 0. 009
B 0. 716 2 0. 358 0. 368 0. 731
C 13. 212 2 6. 606 6. 798 0. 128
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工时考虑，选择 B1、C3。最佳工艺为 A2B1C3，即用 6
BV 体 积 分 数 70% 乙 醇 洗 脱，洗 脱 流 速 为
3 BV·h －1。
3. 5 工艺放大验证实验
精密称取榨油后的黑种草子残渣 500 g(n =
3)，按“2. 2. 1”项下方法制备提取液，按优选的纯化
工艺实验，结果 HE-Ⅲ平均含量为 47. 97%，平均得
率为 1. 96%，ＲSD分别为 1. 96%、1. 32%，表明优选
出的纯化工艺合理，稳定可行。见表 8。
表 5 HE-Ⅲ洗脱正交实验因素水平表
Tab. 5 Factor levels of orthogonal test of elution of HE-Ⅲ
Levels
Factors
A Concentration of
elution /%
B Solvent
dosage /BV
C Elution velocity
/BV·h － 1
D Blank
1 50 6 1 －
2 70 7 2 －
3 90 8 3 －
表 6 HE-Ⅲ洗脱正交实验结果
Tab. 6 Ｒesult of orthogonal test of elution of HE-Ⅲ
No.
Factors
A B C D
Yield
/%
Content
/%
Score
1 1 1 1 1 1. 94 50. 04 89. 89
2 1 2 2 2 1. 91 49. 74 88. 85
3 1 3 3 3 1. 97 49. 89 90. 58
4 2 1 2 3 1. 99 51. 53 92. 35
5 2 2 3 1 2. 08 50. 06 93. 67
6 2 3 1 2 2. 12 51. 14 95. 56
7 3 1 3 2 2. 23 51. 46 98. 76
8 3 2 1 3 2. 19 52. 06 98. 13
9 3 3 2 1 2. 16 53. 11 98. 12
K1 89. 77 93. 67 94. 53 93. 89
K2 93. 86 93. 55 93. 11 94. 39
K3 98. 34 94. 75 94. 34 93. 69
Ｒ 8. 57 1. 20 1. 42 0. 70
表 7 HE-Ⅲ洗脱正交实验方差分析表
Tab. 7 ANOVA Ｒesult of elution test of HE-Ⅲ
Source Sum of squares df Mean square F P
A 110. 072 2 55. 036 140. 386 0. 007
B 2. 642 2 1. 321 3. 370 0. 229
C 3. 565 2 1. 783 4. 547 0. 180
表 8 HE-Ⅲ纯化工艺放大验证实验结果
Tab. 8 Ｒesult of validation test of the active ingredicet HE-Ⅲ
Yield
/%
Average
yield /%
ＲSD
/%
Content
/%
Average content
/%
ＲSD
/%
1 1. 96 47. 36
2 1. 92 1. 96 2. 30 48. 62 47. 97 1. 32
3 2. 01 47. 93
4 讨 论
4. 1 通过分析测定 5 种大孔树脂对 HE-Ⅲ的吸附
解吸性能，确定 AB － 8 树脂对 HE-Ⅲ的富集纯化效
果最好，AB －8 树脂为弱极性大孔树脂，相比于非极
性的 D101 树脂，对皂苷的吸附性能更佳。
4. 2 水洗除杂过程中，7 BV的水能将 97. 83%糖洗
脱下来，因此选择用水洗脱 7 BV。
4. 3 提取液 pH值影响 HE-Ⅲ得率和含量，黑种草
子提取液(0. 25 g 药材·mL －1)pH 值为 5. 84，与调
pH值至 5，7，8 提取液的 HE-Ⅲ得率和含量比较，以
不调节 pH值为佳。
4. 4 50%以下的乙醇能将 HE-Ⅲ洗出，为减少损
失，不宜采用 50%以下的乙醇预洗除杂。
4. 5 正交实验以 HE-Ⅲ得率和含量为指标，采用综
合评分法进行工艺优选。工艺优选的目的是在保证
一定得率的基础上，尽可能提高中间体中 HE-Ⅲ含
量，因此 HE-Ⅲ得率为主要评价指标，得率和含量的
权重系数分别定为 0. 6 和 0. 4。
4. 6 采用优选工艺制备的中间体 HE-Ⅲ含量达
47. 97%，收率为 76. 26%。验证结果表明，该工艺
设计合理，工艺稳定性好，适于工业化生产。
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(收稿日期:2014-03-06)
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中国药学杂志 2014 年 6 月第 49 卷第 12 期 Chin Pharm J，2014 June，Vol. 49 No. 12