全 文 ：HPLC法测定瘤果黑种草子中
常春藤皂苷元及齐墩果酸含量
史荣梅①，耿东升②，李新霞①
［摘 要］ 目的 建立 HPLC法同时测定瘤果黑种草子中常春藤皂苷元及齐墩果酸的含量。方法 色谱柱:Hypersil
ODS C18(150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(85∶ 15∶ 0． 04∶ 0． 02) ;流速:0． 5 ml /min;检测波长210 nm。
结果 TLC能检出齐墩果酸、常春藤皂苷元相应的斑点;HPLC法测定常春藤皂苷元、齐墩果酸分别在 22． 76 ～ 227． 6、40． 28 ～
201． 4 μg /ml范围内线性关系良好，r值分别为 0． 9998、0． 9997，平均回收率分别为 94． 6%、93． 8%，RSD分别为1． 8%、1． 2%。
结论 本法可用于瘤果黑种草子中皂苷的质量控制，方法简单，结果准确，灵敏度高。
［关键词］ 瘤果黑种草子;HPLC;常春藤皂苷元;齐墩果酸
［中图分类号］ R917 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-9926(2012)03-245-03
［DOI］ 10． 3969 / j． issn． 1008-9926． 2012． 03． 17
Determination of Hederagenin and Oleanic Acid
in Seed of Nigella Glandulifera by HPLC
SHI Rong-mei①，GENG Dong-sheng②，LI Xin-xia①
①School of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China;
②Institute for Drug and Instrument Control of Xinjiang Military Command，Urumqi 830063，China
［Abstract］ Objective To establish an HPLC method for determination of the content of hederagenin and oleanic
acid in seeds of Nigella glandulifera ． Methods HPLC analysis was carried out using Hypersil C18(150 mm ×4． 6 mm，
5 μm)column and acetonitrile-water-glacial acetic acid-triethylamine(85∶ 15∶ 0． 04∶ 0． 02)as the mobile phase． The flow
rate was 0． 5 ml /min and the detection wavelength was 210 nm． Results The linear range of hederagenin and oleanic acid
was respectively 22． 76-227． 6 μg /ml(r =0． 9998)and 40． 28-201． 4 μg /ml(r =0． 9997)． Their average recovery was
respectively 94． 6% and 93． 8%，and RSD was 1． 8%，1． 2%． Conclusion This method is simple，quick and accurate，
which can be used for quality control of saponins in seeds of Nigella glandulifera ．
［Key words］ Nigella glandulifera;HPLC;hederagenin;oleanic acid
瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn) ，又名
腺毛黑种草，属毛茛科金莲花亚科黑种草属植物，其
种子是常用的药材，主要有利尿、活血、解毒、通乳、
乌发、治疗支气管哮喘、延缓衰老之功效，主产地新
疆，作为维吾尔医学中一种习惯用药收入 1977 年至
今各版《中国药典》［1-5］。本试验以常春藤皂苷元、
齐墩果酸作为对照品同时测定，为进一步完善瘤果
黑种草子质量标准奠定基础。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 LZNOMAT 5 型半自动点样仪(瑞士
基金项目:国家自然科学基金项目，No． 30960512
作者简介:史荣梅，硕士研究生。研究方向:民族药研究。
作者单位:① 830054 新疆乌鲁木齐，新疆医科大学药学院;
② 830063 新疆乌鲁木齐，新疆军区联勤部药品仪器检验所
通讯作者:耿东升，Tel:(0991)4980635;E-mail:dongsheng811@ sina． com
CAMAG) ;硅胶 G 预制板(100 mm × 200 mm，
Merk) ;ACQUITY高效液相色谱仪(Waters 公司) ;
PDA紫外检测器(Waters 公司) ;AB-135S 型电子天
平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ;微孔滤膜(水
膜、F膜，均为 0． 22 μm，上海半岛实业有限公司净
化器材厂) ;DK-S24 型恒温水浴锅 (上海精宏实验
设备有限公司) ;SK2510HP 型超声仪(上海科导超
声仪器有限公司) ;DZF-6090 型真空干燥箱(上海一
恒科学仪器有限公司) ;FW-177 摇摆式粉碎机(上
海隆拓仪器设备有限公司)。
1． 2 试药 常春藤皂苷元对照品、齐墩果酸对照品
(纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司，批
号:201005)。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析
纯，瘤果黑种草子药材〔购自新疆和田墨玉县，经新
疆中药民族药研究所研究员李晓瑾鉴定为 Nigella
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Glandulifera Freyn的种子〕。
2 方法与结果
2． 1 溶液的制备 (1)对照品溶液 分别精密称取
常春藤皂苷元对照品及齐墩果酸对照品 5． 69、10． 07
mg，以色谱甲醇溶解并定容至 10 ml 量瓶中，制成浓
度分别为 0． 569、1． 007 mg /ml 的溶液，即得。(2)供
试品溶液 瘤果黑种草子药材粉碎(过 60 目筛) ，精
密称取 5． 0102 g，装入索氏提取器中，用150 ml石油醚
(60 ～90)脱脂 2 h，取出挥尽石油醚并蒸干。脱脂后
干粉加 95%乙醇 100 ml，超声处理30 min(80%，59
kHz) ，补足失重，滤过，残渣用乙醇适量洗涤，合并滤
液与洗液，挥干溶剂，残渣加水 10 ml 溶解，用水饱和
的正丁醇萃取 3次，每次 20 ml，合并萃取液，蒸干，残
渣加甲醇 20 ml，盐酸 2 ml，加热回流 2 h，水解物加水
10 ml，用三氯甲烷萃取3次，每次20 ml，合并萃取液，
溶剂蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至 100 ml 量瓶中，
摇匀，0． 22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2． 2 TLC 鉴别 照 TLC 试验，分别吸取上述常春
藤皂苷元对照品溶液 6 μl、齐墩果酸对照品溶液
4 μl及样品溶液 12 μl，点于同一硅胶 G 薄层板上，
以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(6∶ 4∶ 0． 25)为展开剂，
饱和 15 min后展开，取出，晾干，以 10%硫酸乙醇溶
液浸润，在 105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光
和紫外灯光(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与
对照品色谱相应的位置上，显示清晰的斑点。结果
见图 1。
A:日光检视;B:波长365nm检视;1:齐墩果酸;2:常春藤皂苷元;3:样品
图 1 瘤果黑种草子 TLC图
2． 3 含量测定
2． 3． 1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18
(150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;色谱峰采集范围:190 ～
400 nm;流动相:乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(85∶ 15∶
0． 04∶ 0． 02) ;流速:0． 5 ml /min;柱温:25 ℃;进样
量:10 μl;检测波长:210 nm。理论塔板数以常春藤
皂苷元峰计算应不低于 3000。
2． 3． 2 方法专属性与系统适用性试验 在拟定的
色谱条件下，分别取上述对照品溶液和供试品溶液
进样测定，得到特征峰，结果表明，常春藤皂苷元、齐
墩果酸与其他杂峰质分离良好，分离度 ＞ 1． 5，且无
干扰，拖尾因子在 0． 95 ～ 1． 05。采用三点法检测
PDA图中主峰的纯度，峰前、峰尖、峰尾提取的紫外
图一致，表明主峰为单一色谱峰。常春藤皂苷元及
齐墩果酸对照品溶液、瘤果黑种草子供试品溶液的
HPLC见图 2。
1:常春藤皂苷元;2:齐墩果酸
图 2 常春藤皂苷元及齐墩果酸的 HPLC图
2． 3． 3 线性关系考察 分别精密量取上述对照品
溶液适量，用甲醇分别稀释成常春藤皂苷元浓度为
22． 76、56． 90、91． 04、136． 6、170． 1、227． 6 μg /ml;齐
墩果酸浓度为 40． 28、80． 56、120． 84、161． 12、201． 4
μg /ml的标准溶液，过 0． 22 μm滤膜后，按色谱条件
分析，以浓度为横坐标(X)、峰面积(A)为纵坐标
进行线性回归，得常春藤皂苷元及齐墩果酸回归方
程分别为:
A = 10 347 X － 104 701，r = 0． 9998
A = 11 966 X － 104 530，r = 0． 9997
线性范围分别为 22． 76 ～ 227． 6、40． 28 ～ 201． 4
μg / ml。
2． 3． 4 精密度试验 取 2． 3． 3 项下低、中、高 3 个
浓度的对照品溶液，按 2． 3． 1 项下色谱条件，分别在
1、4、8、12、24 h内及 1、2、3、4、5 d 进样，测定平均峰
面积，计算常春藤皂苷元、齐墩果酸的日内 RSD 为
0． 6%、2． 3%，日间 RSD为 1． 5%、1． 9%。
2． 3． 5 稳定性试验 取上述瘤果黑种草子供试品
溶液在 0、2、4、8、12、24 h分别测定常春藤皂苷元及
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齐墩果酸的峰面积，计算其 RSD 分别为 0． 4%、
1． 5%。结果表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2． 3． 6 重复性试验 取同一批样品，按供试品溶液
制备方法平行制备 5 份，按色谱条件测定常春藤皂
苷元及齐墩果酸的峰面积后分别计算其含量为
3． 5%、1． 13%，RSD 值分别为 1． 2%、3． 8%(n =
5) ，结果表明重复性良好。
2． 3． 7 加样回收率试验 精密称取已知含量的样
品 9 份，每份约 2． 5 g，分别精密加入常春藤皂苷元
对照品各 7． 00、8． 75、10． 50 mg，齐墩果酸对照品
2． 20、2． 75、3． 30 mg，按供试品溶液制备方法制备，
以色谱条件测定峰面积，计算常春藤皂苷元及齐墩
果酸的平均回收率。结果见表 1。
表 1 常春藤皂苷元和齐墩果酸回收率试验结果
成分
取样量
(g)
样品量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
珋x
(%)
RSD
(%)
齐墩 2． 5012 8． 75 7． 04 14． 27 90． 4 94． 6 1． 8
果酸 2． 5274 8． 85 7． 03 15． 02 94． 6
2． 5107 8． 79 7． 11 14． 75 92． 8
2． 5085 8． 78 8． 71 16． 29 93． 1
2． 5132 8． 79 8． 77 17． 11 97． 4
2． 5215 8． 83 8． 72 16． 59 94． 5
2． 5019 8． 76 10． 55 18． 48 95． 7
2． 5161 8． 81 10． 47 18． 98 97． 9
2． 5011 8． 75 10． 52 18． 40 95． 5
常春藤2． 5012 2． 75 2． 23 4． 57 91． 8 93． 8 1． 2
皂苷元2． 5274 2． 78 2． 29 4． 69 92． 5
2． 5107 2． 76 2． 18 4． 63 93． 7
2． 5085 2． 76 2． 77 5． 16 93． 3
2． 5132 2． 76 2． 69 5． 12 93． 9
2． 5215 2． 77 2． 71 5． 09 92． 9
2． 5019 2． 75 3． 32 5． 69 93． 7
2． 5161 2． 77 3． 37 5． 89 95． 9
2． 5011 2． 75 3． 29 5． 84 96． 7
2． 3． 8 样品测定 分别精密称取瘤果黑种草子 5
份，按“供试品溶液”制备项下操作，按色谱条件进
样测定，测得上述供试品溶液中常春藤皂苷元及齐
墩果酸的含量，计算瘤果黑种草子中常春藤皂苷元
及齐墩果酸的含量分别为 3． 62%、1． 14%，总皂苷
的平均含量为 4． 76%，RSD为 1． 5%。
3 讨论
文献［4，6］报道，瘤果黑种草子中的皂苷元多
为五环三萜类的常春藤皂苷元，未见有齐墩果酸的
报道，根据常春藤皂苷元及齐墩果酸的结构式，常春
藤皂苷元只比齐墩果酸多 4 位上的醇羟基，又因为
薄层鉴别时在齐墩果酸对照品相应的位置上，瘤果
黑种草子样品溶液有较清晰的斑点，故 HPLC 法测
定总皂苷含量时，进一步加大样品溶液的浓度进样，
检出瘤果黑种草子中的齐墩果酸，并且本试验测得
的瘤果黑种草子中常春藤皂苷元的含量也比相关报
道［7］中高出 10 多倍。
含量测定方法优化时，尝试用甲醇-水(85∶ 15，
87∶ 13)、乙腈-水(85 ∶ 15，87 ∶ 13)、乙腈-5%冰醋酸
(85∶ 15)及 2010 年版《中国药典》中规定的甲醇-水-
冰醋酸-三乙胺(87∶ 13∶ 0． 04∶ 0． 02)等多种流动相，分
离效果均不理想，峰形较宽，且样品杂质峰较多。最
后，选择乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(85∶ 15∶ 0． 04∶ 0． 02)
为流动相，被测组分达到理想的分离度并且有较好
的峰形。三萜皂苷的皂苷元结构中无共轭体系，紫
外吸收较弱，为末端吸收，由溶剂色谱甲醇的色谱峰
可知甲醇对测定有一定的干扰，故选择乙腈-水体
系;三萜皂苷为酸性皂苷，冰醋酸可产生弱酸性环
境，利于样品中酸性物质的分离，又能与其他成分达
到基线分离;三乙胺既可调节流动相的 pH 值又能
较好的改善色谱峰的峰形，减少拖尾现象。
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(收稿日期:2011-07-15;修回日期:2011-12-04)
(本文编辑 孔爱英)
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