全 文 ：　　文章编号: 1001-8255( 2003) 08-0383-03
灰树花多糖硫酸酯的制备及其抗肿瘤活性
史宝军 ,　聂小华 ,　许泓渝 ,　陶文沂*
(江南大学生物工程学院生物制药研究室 ,江苏无锡 214036)
摘要: 利用碱提酸沉淀法从灰树花 (Grif ola f rondosa)发酵菌丝体中获得的碱提水不溶性多糖 GAP,经氯磺酸 -吡啶
法硫酸化修饰后 ,即制得能溶于水的硫酸化灰树花多糖。 通过 DEAE-Sepharo se F. F.离子交换柱色谱分离得到一
种相对分子量为 2. 8× 104、硫酸基含量为 16. 4%的硫酸酯化灰树花多糖 ( S-GAP)。 S-GAP红外光谱分析表明 ,在
1230 cm- 1、 810 cm- 1有硫酸酯键的特征吸收峰 ,说明多糖已形成硫酸酯。 在体外 S-GAP对 S-180肿瘤细胞无抑制
作用 ,但对人胃癌细胞 SGC-7901有直接杀伤作用。
关键词: 灰树花 ;多糖硫酸化 ;体外 ;抗肿瘤 ; S-180细胞 ; SGC-7901细胞
中图分类号: Q539　　　文献标识码: A
收稿日期: 2003-01-24
作者简介:史宝军 ( 1973) ,男 ,博士研究生 ,专业方向:生物制药。
Tel: 0510-5862938
E-mai l: sb jsss2000@ sina. com
　　灰树花 (Grifola frondosa )属担子菌亚门、多孔
菌科 ,是一种营养丰富、生物活性物质含量高的珍贵
蕈菌。 灰树花多糖具有明显的抗肿瘤、抗 HIV病毒
及改善免疫系统功能等功效 ,还具有调节血糖、血脂
及胆固醇水平、降血压等作用 ,对肥胖症、糖尿病也
有一定的疗效 ,几乎无任何毒副作用 [1 ]。一些食药两
用真菌的天然多糖可通过硫酸酯化得到用途更为广
泛的多糖衍生物 ,如硫酸酯化的香菇多糖具有良好
的抗 HIV活性 [2 ] ;硫酸酯化的虎奶菇多糖具有较强
的抗氧化作用 [3 ]。
灰树花发酵菌丝体经碱提、乙酸中和、离心 ,上
清液为碱提水溶性多糖 ,沉淀为水不溶性多糖
( GAP, 1)。1无法制成注射液 ,影响进一步的药理研
究。尚未见有关 1的化学改性研究报道。 本文通过
硫酸酯化 ,将 1制成了可溶于水的硫酸化多糖 ( S-
GAP, 2) ,同时初步研究了其抗肿瘤活性。
1　材料
灰树花菌株 GF9801(本室提供 ) ;小鼠肉瘤 S-180细胞
及人胃癌细胞 SGC-7901(中国科学院上海细胞所 )。 S-180
小鼠腹腔内连续传代 , SGC-7901体外常规传代 ;明胶和
M T T (噻唑蓝 ) ( Sigma公司 ) , RPM I-1640培养基 ( Gibco公
司 )。
2　方法
2. 1　灰树花菌丝体制备
按照文献 [4 ]方法制得灰树花菌丝体。
2. 2　 2的制备 [5 ]
灰树花发酵菌丝体用热水 ( 80°C)反复提取 ,直
至苯酚 -硫酸法检测无多糖。 剩余残渣用适量 2%
NaOH溶液于 4°C过夜提取。离心 ,上清液用冰醋酸
中和 ,产生大量白色沉淀 ,重复 3次 ,合并沉淀 ,经
水、丙酮、乙醚洗涤后真空干燥。 用 0. 05 mol /L
NaOH溶解后离心 ,上清液加入 4倍体积的 95%乙
醇用以沉淀多糖 ,过夜后离心收集白色沉淀 ,真空干
燥 ,得到 1。
酯化试剂的制备 [ 5]:无水吡啶 10 ml置于反应
瓶中 ,冰盐浴冷却 ,剧烈搅拌下缓慢滴加氯磺酸
4 ml,继续搅拌 30 min,密封后置冰箱中备用。
将 1悬浮于无水甲酰胺 35 ml中 ,缓慢加入如
上所得酯化试剂 ,于 45°C下搅拌反应 2～ 4 h,用
2. 5 mo l /L NaOH中和 ,流水透析 3 d,蒸馏水透析
1 d,浓缩 ,加无水乙醇沉淀多糖 ,得到硫酸酯化衍生
物。 转至 DEAE-Sepharose F. F.阴离子交换柱 ,先
用蒸馏水洗 ,后用 0～ 1. 5 mol /L NaCl溶液梯度洗
脱 ,用苯酚 -硫酸法检测多糖 ,仅有一个主要洗脱峰 ,
收集后充分透析 ,冷冻干燥得到 2。
2. 3　纯度鉴定及分子量测定
高效液相色谱法 [6 ]
2. 4　硫酸基含量测定
BaCl2-明胶浊度法 [6 ] ,取代度公式: D. S. =
( 1. 62× S% ) /( 32- 1. 02× S% )。 其中 , D. S.为取
代度 , S%为硫酸基的百分含量。
2. 5　红外光谱分析
溴化钾压片 ,测定范围为 4000～ 400 cm- 1。
2. 6　单糖组成分析
按文献 [6 ]制得糖乙酰化衍生物 ,进行气相色谱
分析。采用弹性石英毛细管柱 ( 0. 32 mm× 30 m ) ,担
体为 Chromoso rb WAW DMCS( 80～ 100目 ) ,固定
液为 3% OV-1701,载气 N2 ,流速 1. 5 m l /min,氢火
焰检测器 ( FID) ,气化室温度 260°C,检测温度 250°
C,程序升温: 180°C( 3 min)→ 240°C( 30 min)。根据
标准单糖与样品保留时间的比较 ,确定组成单糖的
·383·中国医药工业杂志　 Chines e Jou rnal of Pharmaceuticals 2003, 34( 8)
种类。
2. 7　体外抗肿瘤活性的测定
小鼠腹腔内传代的 S-180肿瘤细胞进行常规培
养 ,达对数生长期时使用。用含 10%小牛血清的
RPM I 1640液调整细胞浓度为 2. 5× 105个 /ml,接
种于 96孔细胞培养板中 ,每孔 100μl ,再加入不同
浓度 ( 1500、 1000、 500、 250μg /m l )的 2 100μl,以
RPM I-1640培养基为对照 ,置于 37°C、 5% CO2条件
下培养 ,分别于不同时间 ( 24、 48 h)用 MT T法 [7 ]测
定细胞存活率。
取对数生长期的人胃癌细胞 SGC-7901,经
0. 25%胰蛋白酶消化后用 10%小牛血清的 RPM I
1640液调整细胞浓度为 1× 105个 /ml,接种于 96
孔细胞培养板中 ,每孔 100μl,置于 37°C、 5% CO2条
件下培养 ,细胞贴壁后加入不同浓度 ( 500、 250、 100、
50、 20、 10μg /ml)的 2 100μl,分别于不同时间 ( 24、
48 h)用 MT T法 [7 ]测定细胞存活率。
抑制率 /% = ( 1- 给药组 A570 /对照组 A570 )×
100%。 并进行 t检验。
3　结果与讨论
3. 1　 2的分离纯化
按“ 2. 2”项下操作得到的 2经 HPLC测定呈单
一对称吸收峰 ,表明 2是一纯多糖。经 HPLC测得 2
的相对分子量为 2. 8× 104。
3. 2　 1的硫酸酯化条件及结果
多糖硫酸化的方法很多 ,氯磺酸 -吡啶法试剂简
单易得 ,反应条件相对简单 ,产物回收方便 ,是较理
想的一种方法。经预实验表明 ,高温 ( 100°C)条件下 ,
反应结束后经 3, 5-二硝基水杨酸比色法测得还原
糖含量较高 ,因此本实验将温度定在 45°C。 提高氯
磺酸的比例 ,氯磺酸-吡啶盐 (淡黄色固体 )生成增多
甚至出现板结 ,搅拌困难 ,加入无水甲酰胺可溶解 ;
高比例的磺化试剂 ,多糖易酯化 ,取代度高 ,但产率
低 ,可能是由于反应液酸度过高 ( p H< 1)引起多糖
降解。采用较温和的条件 ,取 pH4～ 5,收率和取代度
均较为理想 ,得到的 2为白色粉末 ,糖含量 52. 8% ,
硫酸基含量 16. 4% , D. S. 1. 74,得率 82. 7% 。
3. 3　 2的红外光谱结果
红外光谱 (图 1)表明 , 2除了多糖母体特征吸收
峰得以保留外 ,还增加了 1230 cm- 1左右的吸收 ,表
明为 OSO-3 的 S= O伸缩振动 , 810 cm- 1左右的吸
收表明为 C-O-S的拉伸振动 ,这些是硫酸键的特征
吸收峰 ;同时 ,还可以看出 2在 3400 cm- 1附近的羟
基吸收峰有所降低 ,表明部分羟基已被酯化 ,以上充
分说明多糖已形成硫酸酯。
图 1　 2的红外光谱
3. 4　 2单糖组成分析
2的完全酸水解产物用 NaBH4还原成糖醇 ,乙
酰化 , GC分析显示样品峰保留时间 ( 24. 017 min)
与葡萄糖对照品 ( 23. 992 min)一致 ,没有其它单糖
峰的出现 ,说明 2单糖组成只有葡萄糖 ,为均多糖。
3. 5　 2体外抗肿瘤活性
3. 5. 1　对 S-180肿瘤细胞
根据文献 [8 ] ,离体条件下 , 2 1500μg /ml条件下
作用 48 h,对 S-180肿瘤细胞无直接杀伤作用。
3. 5. 2　对人胃癌细胞 SGC-7901
表 1显示 , 2对人胃癌细胞 SGC-7901的抑制率
随多糖浓度及作用时间的增加而增加 ,呈现量效关
系。 作用时间为 24 h时抑制效果不明显 ,只有在较
高浓度下才有抑制作用 ;但作用 48 h后 ,多糖浓度
50μg /ml时抑制率 25. 35% (P < 0. 05) ,而 500μg /
ml时可达 59. 62% ( P < 0. 01) ,表明在高浓度时对
细胞增殖有直接细胞毒作用。
表 1　 2对人胃癌细胞 SGC-7901的生长抑制作用
样品浓度
/μg· ml- 1
抑制率 /%
24 h 48 h
对照 - -
10 2. 88 4. 92
20 1. 56 11. 37
50 5. 07 25. 351)
100 10. 34 36. 761)
250 18. 801) 48. 842)
500 25. 881) 59. 622)
　　注:与对照组比较 1) P < 0. 05; 2) P < 0. 01
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Preparation of Grif ola f rondosa Poly saccharide Sulfate
and Its Antitumo r Activity
SHI Bao-Jun,　 N IE Xiao-Hua,　XU Hong-Yu,　 TAO Wen-Yi*
( School of Biotechnology , Southern Yangtze Univer isty , Wux i 214036 )
ABSTRACT: Water-insoluble po lysaccharide GAP was ex t racted wi th 2% NaOH from the mycelia of
submerged fermenta tion of Gri fola f rondosa. A wa ter-so luble sulfated deriv ativ e S-GAP was obtained
from GAP w ith chloro sulfonic acid-pyridine, and purified by DEAE-Sepharose F. F. ion exchange chro-
ma tog raphy. Its sulfate content w as 16. 4% and average molecular w eigh t w as 2. 8× 104 . The IR spect rum
o f S-GAP showed the characteristic absorptions of sul fate ester bond a t 1230 cm
- 1
and 810 cm
- 1
. In vi tro
studies S-GAP had no antitumor activi ty on the Sarcoma 180 cell, but show ed inhibitory ef fect on SGC-
7901 human gastric ca rcinoma cel ls.
Key Words: Gri fola f rondosa; polysaccha ride sulfate; anti tumo r; in vitro; S-180 cells; SGC-7901
cells
　　文章编号: 1001-8255( 2003) 08-0385-04
六种金属离子对 Bacillus subt ilis肌苷产率的影响
刘国生1 ,　李学梅 1 ,　李用芳1 ,　常　亭 2 ,　王印安 1
( 1.河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453002; 2.新乡市制药厂 ,河南新乡 453000)
摘要: 通过摇瓶发酵试验测定了 Co、 Mo、 Zn、 Cu、 Mn、 Li 6种金属元素的 8种盐类对 Bacillus subtilis发酵生产肌苷
的影响。结果表明 ,添加 M nSO4、 Na2MoO4、 CoCl2对 B . subtilis JSIM 1019菌株肌苷发酵有促进作用 , Cu SO4、 Li Cl、
Zn SO4则有抑制作用 ; N a2MoO4对高产菌株 B . subtilis NT40作用不明显。 MnCl2和 M nSO4对 3株供试菌株的肌
苷发酵有促进作用 ,但 K2MnO4则无效。MnSO4增产效果优于 MnCl2。随菌株本身生产能力的提高 , M nSO4和 Mn-
Cl2的促进生产肌苷作用会相应降低。
关键词: 金属离子 ;肌苷发酵 ;产苷率 ;影响
中图分类号: TQ464　　　文献标识码: A
收稿日期: 2002-07-04
作者简介:刘国生 ( 1964) ,男 ,讲师 ,从事微生物学教学及研究。
Tel: 0373-3326340
Emai l: hnlgs@ ho tmail. com
　　肌苷是临床上治疗肝脏、心脏、血液等疾病的药
物 [1～ 3 ] ,同时又是制造强力味精的原料 [4, 5 ]。 以往筛
选变异菌株时常在平板培养基中加入一些微量元
素 ,能够提高正变菌株的检出率 [5 ] ,但某些金属元素
可能会在肌苷发酵过程中影响产苷率。已有 Mg2+ 、
Ca
2+ 、 Zn2+ 等金属离子在发酵生产中应用的报
道 [6～ 8 ]。本文选取 Co、 Mo、 Zn、 Cu、 Mn、 Li 6种金属
元素的 8种盐类并考察其在肌苷发酵过程中的作
用。
1　材料和方法
1. 1　菌种及仪器
枯草芽孢 杆菌 ( Bacillus subtilis ) JSIM1019、 NT40、
HSD116。 其中 N T40菌株由 JSIM1019菌株选育而来 ,
HSD116菌株是由 N T40菌株经多重诱变处理选育的高产
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