全 文 ：· 1872· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.24 中国药房 2009年第 20卷第 24期
*硕士研究生。研究方向:中药制剂。电话:0833-5196104。E-
mail:xinxiu 315@126.com
#通讯作者:副教授 , 博士 , 硕士研究生导师。研究方向:中药制
剂。电话:0833-5196104。E-mail:wshing@263.net
星点设计-效应面法优化赶黄草提取工艺
辛 秀 1* ,袁 琳 1 ,雷 磊 1 ,王敏智 1 ,王 萍 1 ,王 兴 1 , 2#(1.西南交通大学药学院 ,峨眉山市 614202;2.江
西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 ,南昌市 330004)
中图分类号 R283;R284.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1872-04
摘 要 目的:建立赶黄草中槲皮素的含量测定方法;揭示乙醇浓度和提取温度与赶黄草中槲皮素含量之间的函数关系 ,优化出最
佳赶黄草提取工艺 。方法:采用高效液相色谱法测定槲皮素含量;以槲皮素含量为效应变量 ,以乙醇浓度和提取温度为考察因素 ,应
用星点设计-效应面法优选出最佳提取工艺 。结果:槲皮素进样量在 0.054 ～ 1.08μg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系
(r =0.999 9),平均回收率为 98.54%, RSD =1.62%(n =6);赶黄草最佳提取工艺为乙醇浓度 82.2%、提取温度 84.5 ℃。结论:
所建赶黄草中槲皮素含量测定方法的准确度 、精密度和重现性均良好;所建数学模型能很好地预测槲皮素的提取效果 ,且准确度和
重现性良好 。
关键词 星点设计-效应面法;赶黄草;槲皮素;含量测定;提取工艺
Optimization of Extraction Technology of Penthorum chinense by Central Composite Design -response
Surface Methodology
XIN Xiu ,YUAN Lin , LEI Lei ,WANG M in_zhi ,WANG Ping ,WANG Xing(School of Pha rmacy , Southw est
Jiaotong U nive rsi ty , Emeishan 614202 ,China)
WANG Xing(Jiangxi Univ ersity of TCM , Key Labo rato ry of M odern Preparation of TCM , Minist ry o f Ed-
ucation , Nanchang 330004 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To establish a method fo r de te rmining the content of quercetin in Penthorum chi nense and to
study the functional relation be tw een the ex traction tem pera ture and the ethano l concentra tion and the ex traction efficiency of
the quercetin in P.chinense so as to obtain the optimal ex traction technology.M ETHODS:The content of querce tin in P.ch_
i nense w as de termined by HPLC.The optimal ex tracting technology w as optimized by central com posite design -response
surf ace m ethodo logy w ith the content of quercetin as variable and with ethano l concentra tion and ex tracting tem perature as
facto rs.RESULTS:A good linearity w as obtained from 0.054 ～ 1.08μg(r =0.999 9)fo r quercetin.The average recovery w as
98.54%(R SD =1.62%, n=6).The optimal technical paramete rs w ere as fo llow s:the e thanol concent ration w as 82.2%and
the ex trac tion tem pera ture w as 84.5 ℃.CONCLUSION :This established m ethod is accurate , precise and reproducible;the
ex tracting efficacy can be accura tely and rep roducibly predicted by the established mathematical model.
KEY WORDS Central composite design-response surface methodo logy ;Penthorum chi nense ;Quercetin;Content de te rmi-
nation;Ex trac tion technology
物以水分散体包衣液包衣时 , 也需包一层隔离衣 , 以防止包衣
过程中药物向包衣层转移扩散 。
综上所述 , 所选方法可制备出体外释放良好的 OM T 肠溶
包衣微丸 。
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(收稿日期:2008-09-03 修回日期:2009-03-09)
中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1873·
表 1 因素水平
Tab 1 Leve ls of factors
水平 因素
X 1/ ℃ X 2/%-1.414 21(-α) 50 40
-1 55.857 9 48.786 8
0 70 70
1 84.142 1 91.213 2
1.414 21(+α) 90 100
赶黄草 Penthorum chinense Pursh , 又名扯根菜 , 为虎耳
草科扯根菜属多年生草本植物 , 分布于华北 、华东 、中南及陕
西 、四川和贵州等地 。其具有保肝降酶 、抗肝炎病毒 [1 ]和良好的
预防醉酒以及解酒的作用 [ 2 ] , 对吲哚美辛和 CCl4造成的肝损
伤具有良好的保护作用 , 并在十二指肠给药 30 min后明显增
加胆汁的分泌 ,恢复肝脏的功能 [3 ] 。研究表明 ,其抗病毒和抵抗
肝损伤的主要活性成分为槲皮素[ 4 ]。
为进一步推进本药材的生产应用 , 笔者对其提取工艺进行
了系统研究 。传统提取多采用水作为溶媒 , 本研究的预试验采
用乙醇提取 , 其结果远优于水提取 。通常影响醇提工艺的关键
因素是乙醇浓度和提取温度 ,而它们相互依赖 ,并非孤立 ,因此
本研究将采用能处理多因素交互作用的星点设计法揭示乙醇
浓度和提取温度与赶黄草中槲皮素含量之间的函数关系 , 优化
出最佳槲皮素提取工艺 。
1 材料
1.1 仪器
LC-20AT 型高效液相色谱(HPLC)仪 ,包括 SPD -20A
型紫外可见检测器 、Chromato So lution Light 色谱工作站(日
本岛津公司);BP211D型分析天平(德国 Sarto rius公司);G＆
G T -200型电子天平(美国双杰兄弟集团公司);AS5150A 型
超声机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
1.2 试药
槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所 ,批号:100081-
200406);赶黄草药材购自成都市五块石中药材市场 ,经西南交
通大学药学院宋良科副教授鉴定为虎耳草科 (Saxifragaceae)
扯根菜属(Penthor um G ronv.ex L.)植物赶黄草的地上部分;
甲醇为色谱纯 ,磷酸为优级纯 ,水为三蒸水 ,其余试剂均为分析
纯 。
1.3 软件
St atistica 7.0统计软件(美国 S tat-Sof t公司);Design-
expert 7.1.3软件(美国 S tat-Ease公司)。
2 方法与结果
2.1 槲皮素含量测定
2.1.1 色谱条件 :色谱柱为 Phenomenence Luna C 18(250
mm×4.6 mm , 5μm), 流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(取
浓度为 36.5%的磷酸 0.4 mL 与 100 mL 水混合)=50∶50
(V/V)[5 ] , 检测波长为 360 nm , 柱温为 30 ℃, 流速为 1.0
mL ·min -1 ,进样量为 10 μL 。槲皮素保留时间约为 15 min 。色
谱见图 1。
2.1.2 对照品溶液的制备:精密称取于 105 ℃烘干过夜的槲
皮素对照品 2.7 mg , 加适量甲醇溶解于 25 mL 容量瓶中 , 摇
匀 ,继续加甲醇至刻度 ,再充分摇匀 。
2.1.3 供试品溶液的制备 :按 Design -exper t 软 件
(Rel.7.1.3)进行星点试验安排的试验设计编码进行试验 。精
密称取赶黄草粉末 25 g , 加 250 mL 相应溶媒 , 按对应的温度
提取 2 h , 立即冷却至室温 , 用滤纸抽滤 , 将滤液定容至 250
mL ,即得提取液 。分别将得到的 14份提取液定容至 250 mL ,
得到 14份样品贮备液 , 精密量取各样品贮备液 10 mL 至 100
mL 圆底烧瓶中 , 精密加入 36%的 HCl溶液 1 mL , 在 90 ℃水
浴中回流(水解)60min ,取出 ,立即冷却 ,转移至 25 mL 容量瓶
中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液 ,即得 。
2.1.4 线性关系考察:分别精密吸取过 0.45μm微孔滤膜的对
照品溶液 0.5 、1 、3 、5 、8、10μL进样 ,测定峰面积积分值 。以槲皮素
进样量(X , μg)为自变量 ,峰面积积分值(Y)为因变量 ,按最小二
乘法计算线性回归方程为 Y =1.318 92×106X +3 383.845 19
(r =0.999 9 , n =6 , P<0.000 1)。结果表明 ,槲皮素进样量在
0.054 ～ 1.08μg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系 。
2.1.5 精密度试验:取过 0.45μm微孔滤膜的对照品溶液 10
μL ,按上述色谱条件分别进样 6次测定 。结果 , RSD =1.57%
(n =6),表明仪器精密度良好 。
2.1.6 稳定性试验:取星点试验下 5号样品贮备液 , 过 0.45
μm 微孔滤膜 ,在 0 ～ 12 h内 ,每 2 h进样 1次 ,按上述色谱条件
测定 。结果 , RSD =1.12%(n=7),表明供试品溶液在 12 h内
稳定 。
2.1.7 重现性试验:取同一样品贮备液 ,按“2.1.3”项下方法
自 “精密量取各样品贮备液 10 mL 至 100 mL 圆底烧瓶中”起
依法配制 6份样品溶液 , 过 0.45μm 微孔滤膜 , 按上述色谱条
件进样测定 。结果 , RSD =1.76%(n =6),表明方法重现性良
好 。
2.1.8 加样回收率试验:精密量取星点试验下 5号样品贮备
液 ,加入同等待测组分含量的对照品 ,按“2.1.3”项下方法制备
供试品溶液 ,按上述色谱条件测定 ,计算加样回收率 。结果 ,平
均回收率为 98.54%, RSD =1.62%(n=6)。
2.1.9 样品含量测定:取供试品溶液 , 过 0.45 μm微孔滤膜 ,
精密吸取 10μL 注入液相色谱仪 ,并按上述色谱条件测定 。
2.2 星点设计
2.2.1 试验设计及安排:本研究首先用水作为溶媒考察其煎
煮提取效果(即 ,取 25 g 赶黄草粉末 ,加 250 mL 水煎煮提取 2
h),再用 70%乙醇在 70 ℃条件下提取 2 h ,比较两者的槲皮素
含量 。结果 ,醇提方法可使槲皮素含量提高 6倍多 ,浸膏收率约
降低 1/3 。通常 , 影响醇提工艺的关键因素是乙醇浓度和提取
温度 , 溶剂用量和提取时间是与提取效果成正比关系而非关键
因素 ,因此 ,将提取温度(X 1)和乙醇浓度(X 2)这两者设为考察
因素 ,并根据预试验结果设置其范围分别为 50 ～ 90 ℃(即以 70
℃为中心点)和 40%～ 100%(即以 70%为中心点), 槲皮素含
量(Y)为效应变量。使用 Design-expert 软件(Rel.7.1.3)进
行星点试验安排 , 共计 14次试验(为巩固试验模型 , 中心点重
复进行 6次),将其分成 2组 ,每组随机分布。因素水平见表 1;
星点试验结果见表 2。
· 1874· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.24 中国药房 2009年第 20卷第 24期
表 2 星点试验结果
Tab 2 Results of central composite design
组号 试验号 因素 Y /mg· g -1
X 1 X 2
2 1 1 -1 1.118 931
1 2 -1 -1 1.183 569
3 3 -1 1 1.182 923
5 4 0 0 1.773 454
7 5 0 0 1.713 344
4 6 1 1 2.033 876
6 7 0 0 1.820 473
10 8 0 -1.414 21 1.134 923
12 9 0 0 1.876 266
13 10 0 0 1.893 452
9 11 +1.414 21 0 1.654 184
8 12 -1.414 21 0 1.497 975
11 13 0 +1.414 21 1.237 028
14 14 0 0 1.879 090
2.2.2 模型拟合及预测:使用 S tatistica 7.0软件对以上因素
和效应值数据进行多元线性拟合(Y =b 0+b1X 1+b2X 2)和二
次多项式方程拟合 (Y =b 0+b1X 1+b 2X 2+b 3X 12+b 4X 22+
b 5X 1X 2),将效应值(Y)以多项式方程的形式表达 ,并同时考察
每个因子及其交互作用对效应变量的影响 。多元线性和多项式
方程拟合结果见表 3 。
由表 3可知 , 槲皮素含量(Y)以二次方程模型进行拟合的r
值比多元线性拟合的 r 值更接近 1 , 拟合效果更佳 , 且拟合方程
的置信度高 。故采用二次方程描述 X 1 、X 2两因素和效应值 Y
之间的关系 , 拟合结果如下:Y =—2.052 2+0.043 181 X +
0.052 484X 2 —0.63 ×10 -3 X 12 —0.71×10 -3 X 22+0.763×10 -3
X 1X 2。
2.2.3 方差分析:对以上拟合的二次方程函数的各项系数进行
方差分析 ,结果见表 4。槲皮素含量的相关系数的估计值见表 5。
2.2.4 效应面分析:为了更为直观地展示 X 1和 X 2两因素与
效应值 Y 之间的变化关系 , 笔者绘制了 3个变量组成的二次
方程函数在 X 1和 X 2取值范围内的三维效应图和二维等高线
图 ,并以此预测出最佳效应值点(即槲皮素最高含量点)及其对
应参数 X 1和 X 2值 ,即得最佳醇提工艺的温度和乙醇浓度 。槲
皮素含量的三维效应图和二维等高图分别见图 2 、图 3。
由图 2 、图 3可知 , X 1在由小变大的过程中 , Y 值是先增
大后减小;X 2在由小变大的过程中 , Y 值也是先增大后减小 ,
整个效应面呈圆顶状 ,可以直观地找出 Y 值最大点 。
2.2.5 效应值优化:对以上拟合函数按公式( Y/ X 1)X 2=
0 、( Y / X 2)X 1=0进行数学微分 , 计算出拟合函数 Y 在 X 1
和 X 2的取值范围内的最大值为 1.928 6 , 该点对应 X 1和 X 2
值分别为 84.5和 82.2 , 即赶黄草中槲皮素的最佳乙醇提取工
表 3 多元线性和多项式方程拟合结果
Tab 3 Fitting results of multiple linearity and polynomial equations
模型结构 回归方程 r F P
多元线性 Y =0.511 511+0.008 903X 1+0.062 38X 2 0.429 218 3 108.073 2 <0.000 1二次多项式 Y =-2.052 2+0.043 181X 1+0.052 484X 2-0.63×10-3X 1-0.71×10-3X 2+
0.763×10-3X 1X 2 0.950 663 91 343.093 5 <0.000 1
22
表 4 方差分析结果
Tab 4 Analysis of variance
平方和 自由度 均数 F P
回归 35.879 23 6.000 00 5.979 872 343.093 5 0.000 000残差 0.139 43 8.000 00 0.01 742 9
总和 36.018 67 14.000 00
校正总和 1.448 85 13.000 00
表 5 槲皮素含量的相关系数估计值
Tab 5 Est imated value of the coef ficient of correlation of
the content of quercitrin
项目 估计值 标准误 T(df=8) P
常数 -2.052 18 1.712 622 -1.198 27 0.265 103
X 1 0.043 18 0.037 478 1.152 14 0.282 526
X 2 0.052 48 0.021 691 2.419 57 0.041 878
X 1 -0.000 63 0.000 243 -2.578 47 0.032 694
X 2 -0.000 71 0.000 108 -6.593 37 0.000 171
X 1X 2 0.000 76 0.000 220 3.467 62 0.008 472
2
2
艺参数为温度 84.5 ℃,乙醇浓度 82.2%。
2.2.6 验证试验:精密称取 3份赶黄草粉末 , 各 25 g , 按以上
优化结果 ,即加 250 mL 浓度 82.2%乙醇 ,按 84.5 ℃回流提取
2 h , 立即冷却至室温 , 滤纸抽滤 , 将滤液定容至 250 mL , 即得
提取液 , 再按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液 ,照“2.1.4”项
下方法进行含量测定 。验证试验结果见表 6。
结果表明 , 所建立的二次多项式模型具有良好的预测性 ,
以上最优醇提工艺准确性良好 。
3 讨论
本文建立了赶黄草中槲皮素的 HPLC 含量测定方法 , 按
本法测定所得的图谱峰形和分离度良好 , 方法的精密度和重现
性良好 。
本研究首先用水作为溶媒考察其煎煮提取效果(即 , 取 25
g 赶黄草粉末 , 加 250 mL水煎煮提取 2 h), 又以 70%乙醇在
70 ℃条件下提取 2 h ,比较二者的槲皮素含量 。结果发现 ,醇提
方法可以使槲皮素含量提高 6倍多 ,同时浸膏收率降低约 1/3 。试
分析 , 醇提工艺可以有效地溶出醇溶活性成分槲皮素 , 同时去
除大量的高分子杂质 。
本研究采用星点设计来进行试验 , 从而避免了均匀设计和
正交试验不能预测出该因素在一个区间范围内连续取值的最
佳值的缺陷 , 且较好地保证了试验精度(可以分析各因素之间
的相互作用), 预测性良好 。根据预测模型的三维图可见 , 乙醇
浓度对 Y 影响的作用是先增大后减小 ,由此分析 , Y 可能与其
中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1875·
*副教授。研究方向:药用植物开发与分析。E-mail:zhenhua@
scfc.edu
正交试验优选朱砂根中朱砂根皂苷提取工艺
甄 铧* ,范益军 ,张学毅(四川农业大学 ,都江堰市 611831)
中图分类号 R283;R284.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1875-03
摘 要 目的:优选朱砂根中朱砂根皂苷的提取工艺 。方法:用反相高效液相色谱法测定朱砂根皂苷的含量;以朱砂根皂苷提取质
量分数为评价指标 ,以乙醇体积分数 、提取温度 、提取时间和提取次数为考察因素 ,通过正交试验选取最佳提取工艺 。结果:最佳提
取工艺:80%乙醇为溶剂 、提取温度 80 ℃、提取时间 20 min 、提取次数 3次;朱砂根皂苷的提取质量分数为 6.04%。结论:所选工艺
可行 、重现性好 ,可为大批量提取朱砂根皂苷提供理论依据 。
关键词 朱砂根;朱砂根皂苷;反相高效液相色谱法;正交试验;提取工艺
Optimization of the Extraction Technology of Ardicrenin from Ardisia crenata by Orthogonal Experiment
ZHEN Hua , FAN Yi_jun ,ZHANG Xue_y i(Sichuan Ag riculture Universi ty , Dujiangyan 611831 ,China)
ABSTRACT OBJECTIV E:To optimize the ex traction tech no logy of ardicrenin from Ardisia crenata.M ETHODS:The
content o f ardicrenin w as determined by RP -HPLC.The ex traction technology w as optimized by ort hogonal experim ent wit h
the ex t raction rate o f a rdic renin as evalua tion index and w ith t he vo lume fraction of e thanol , the ex t raction temperature , ex-
traction time and ex traction tim es as facto rs.RESULTS:The optimum extraction technology w as de te rmined as fo llow s:80%
e thanol w as used as so lvent;the ex t raction temperature w as 80 ℃;the ex traction tim e w as 20 min and the ex traction w as
conduc ted f or 3 times.The ex traction rate o f ardicrenin w as 6.04%.CONCLUS ION :T he optimized ex t raction technology is
feasible and reproducible , and it provides theoretical basis fo r mass ex traction of the ardicrenin from A.crenata.
KEY WORDS Ard isia crenata;Ardic renin;RP -HPLC ;Ort hogonal experim ent;Extraction technology
朱砂根为紫金牛科紫金牛属植物 ,又名红铜盘 、大罗伞 、富贵
籽等 ,是中医及民间的常用药物 [1] 。近年研究表明 ,朱砂根中所含
三萜皂苷具有明显抑制癌细胞增殖和直接杀伤癌细胞 [2～4 ]以及抗
H IV 活性 [ 5 ]等作用 。目前 ,关于从朱砂根中提取、纯化三萜皂苷
的研究有报道 [6 ] , 但朱砂根中朱砂根皂苷的提取工艺少见报
道 。本文研究了从朱砂根中提取朱砂根皂苷(cyclamiretin A-3-
O- [ a lpha-L -rhamnopyranosyl-(1※4)-beta-D-g lu-
copyranosyl-(1※4)] [ bet a-D -g lucopyranosyl-(1※2)] -
表 6 验证试验结果(n=3)
Tab 6 Results of verif icat ion test(n=3)
编号 Y /mg· g -1 方差/ %实测值 预测值
1 2.048 7 1.928 4 6.24
2 1.982 4 1.928 4 2.80
3 1.974 3 1.928 4 2.38
在特定醇水比例中的溶解度有很大关系 , 过高和过低的乙醇浓
度都不能最好地提取出槲皮素;而 Y 与提取温度的关系是随
着温度的上升而上升 ,在 84.5 ℃左右上升缓慢 ,然后呈下降趋
势 , 表明随温度升高 ,分子振动加强 , 促进了槲皮素的溶出 , 但
是过高的温度也会导致药材颗粒破碎 , 大量大分子杂质溶出对
槲皮素成分产生包合黏附作用而影响其提取效果 。
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(收稿日期:2008-09-18 修回日期:2009-01-18)