全 文 ：·动物药研究 ·
黑海参酸性粘多糖的分离纯化
中山医科大学 ( 51 0 89) 唐孝礼 邱鹏新 黎明涛 苏兴文 颜光美
摘要 采用酶法和碱法消化 、 醋酸钾和 乙醇分级沉淀 , 从新鲜黑海参体壁中分离得到酸性粘多
糖 , 分子量为 10253 D a , 经琼脂糖电泳证实为纯一成分 , 多糖组成中氨基半乳糖 、 葡萄糖醛酸 、 岩藻
糖 、 硫酸基含量分别为 16 . 12 % 、 1 7 . 88% 、 1 1 . 6 % 、 2 3 . 52 % 。
关键词 黑海参 酸性粘多糖 分离纯化 理化性质
黑海参 oH 勿ht ~ at ar aJ e ge r 又名黑 怪海参 、 黑狗参 、 黑怪参 , 在我国南海海域的潮间
带和珊瑚礁的砂底常成群出现 , 其 口中流出的
白色线状粘液可用于治外伤出血 、 止痛 , 去 内
脏后的全体可作滋补品用于妇女补奶 〔` 〕 , 但其
体壁薄 , 且品质远不如刺参 , 是最次的食用海
参 。 近年来的许多研究表明 , 海参酸性粘多糖
具有抗凝血 、 增强免疫功 能等药理作 用以 3〕 。
从食用价值不高而资源丰富的海参品种中提取
酸性粘多糖 , 进行药理作用及其机理研究 , 对
于充分利用丰富的生物资源 , 开发研制新型海
洋药物 , 具有重要的理论和应用价值 。
1 材料和仪器
1
.
1 材料 海参采集于 广东省惠州市大辣椒
岛水域 , 经中国科学院南海海洋研究所鉴定为
黑海参 oH lot h iur a at ar Jae ge or
1
.
2 试剂 葡葡糖醛酸 (美 国 51 9爪a 公 司 ) ;
地衣酚 (美国 A ld ir hc 公司 ) ; 盐酸氨基葡萄糖
(浙江玉环红星生化制品厂 ) ; 甲苯胺蓝 (上海
化学试剂站分装厂 ) ; D 一 岩藻糖 (瑞典 lF u ka
公司 ) ; 肝素 (上海化学试剂公司 ) ; 对二甲氨
基苯甲醛 (上海试剂三厂 ) 。
,
.
3 仪器 高速冷冻离心机 (德国 H e~
s公
司 ) ; LKB 电泳仪 ( B or ~ 公司 )
; SDX 傅利
叶变换光谱仪 (美国 iN co l et 公司 ) ; RE 凡王 XMT
皿基体辅 助激光解 吸飞行时间质谱仪 (德 国
B川 ke: 公司 ;) 7 5 50 紫外 一 可见光分光光度计
(惠普上海仪器有限公司 )。
2 方法和结果
2
.
1 黑海参酸性粘 多糖的分 离纯化 新鲜黑
中药材第 2 卷第 5期 199 年 5月
海参去内脏 、 洗净 、 称重 、 剪碎 , 加 2 倍重量
的双蒸水 , 加 0 . 4 % 海 参重量 的木 瓜蛋 白酶 ,
60 ℃水解 Z h , 加氢氧化钠溶液使 N a O H 终浓
度为 0 . smo F L , 4 ℃冰箱中过夜 。 用冰醋酸中
和 , 加 乙 醇使终 浓度 为 40 % , 4 ℃ 冰 箱 中过
夜 。 7仪旧 甲m 离心 10 m in (所有离心均在 4℃
进行 , 下同 ) , 弃上清液 , 沉淀分别用 95 % 乙
醇 、 10 % 乙醇 、 丙酮洗 涤 , 真空干燥 。 将 干
燥粉末溶于 50 倍体积 的双蒸 水中 , 3以x 〕 rP m
离心 巧 m in 去除不溶性沉淀 , 上清液 中加醋
酸钾 (KA 。 ) 使 KA 。 终浓度为 Zmo l/ L , 4℃ 冰
箱 中过夜 。 7( xX〕 rp m 离心 巧 ha n , 弃上 清液 ,
沉淀用双蒸水溶解 , 3。以〕 rp m 离心 巧 而 n , 弃
沉淀 , 上 清液用 Nao H 调 p Hg , 加 姚 0 : 使其
终浓度为 4 . 5% , 60 ℃脱色 Z h , 冷却后加 K A e
使其终浓度为 Z m o F L , 7以卫〕甲m 离心 巧 而 n ,
弃上清液 , 沉淀依次用 80 % 、 95 % 、 10 % 乙
醇及丙酮洗涤 , 真空 干燥 , 得 白色无定形 粉
末 , 此即为纯化的黑海参酸性粘多糖 , 提得率
为 0 . 12 % 。
2
.
2 琼 脂 糖 电泳 测 定 纯度 参照 iD e itr hc
法闭 , 以 0 . 8% 琼脂糖溶液制成 8 x 4 c m 胶板 ,
采用 0 . 5 mo F L 硼砂缓冲液 ( p gH . 0) , l o V 电
泳 20 m in , 0 . 1% 十 六 烷 基 三 甲 基 澳 化 按
( CTA B ) 中固定 30 而 n , 胶板用预先经 0 . 1%
C TAB 湿润的 Wh at ~ 滤纸覆盖
, 电吹风暖风
吹干 (不可用热风 ) , 0 . 1% 甲苯胺蓝溶液 (用
醋酸 : 乙醇 : 水 = 0 . 1 : 5 : 5 配制 ) 染色 巧 m in ,
用脱色液 (醋酸 : 乙醇 : 水 = 0 . 1 : 5 : 5 , v/ v) 冲
洗 3 一 5 次脱色 , 拍 照 。 从 电泳图可 以看 出 ,
.
2 23
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 1999. 05. 003
黑海参酸性粘多糖集 中于 比较狭窄的一条带 ,
表明分离得到的多糖为均一成分 。
2
.
3 分子量测定 采用基体辅助激光解 吸飞
行时间质谱仪测定黑海参酸性粘多糖的分子量
为 10 2 5 3 D a (图 2 ) 。
2
.
4 红外光谱鉴定 将黑海参酸性粘多糖与
嗅化钾压 片 , 用傅利 叶变换红外光 谱 仪进行
扫描 , 得红外光谱图 ( 图 3 ) 。 该 图谱表明黑海
参酸性粘多糖具有典型硫酸粘多糖红外吸收特
征 。 3今14 c m 一 ’ 、 10 5 3 e m 一 ` (强 ) , 表明样品 中
含较多 经基 ; 16 57 e m 一 ’ 、 15 6 7 e m 一 ` (强 ) , 表
示样品中含较多的硫酸基或梭基 , 如果叛基多
则表明蛋 白质含量可能比较高 ; 16 50 一 161 c0 m
(强 ) , 14 O5 e m 一 ’ ( 中 ) , 12 5 0 Cm , 一 (强 ) , 表
明本品是一种粘多糖的硫酸醋 。
2
.
5 蛋白质含量测定 样品中蛋 白质含量测
定采用考马斯亮蓝法囚 。 结果 未测 出蛋 白质 ,
表明样品中几乎不含蛋白质 。
2
.
6 硫酸基含量测定 将 黑海参酸性粘多糖
用浓盐 酸在 10 0℃ 水解 14 h , 取多糖水解液 ,
滴加 5 % B a CI : 溶液 , 产生 白色沉淀 , 表 明有
s氏 2 一存在 。 s仇 2 一 含量测定采用重量法闹 。 测
定结果表明 , 黑海参 酸性粘多糖 中 s氏 2 一 含量
为 2 3 . 5 2% 。
2
.
7 氨基半乳糖含量测 定 黑海参酸性粘多
糖的盐酸 水解液 呈 E l s o n 一 M o l艺a n 反应 阳性 ,
表明含氨基己糖川 ; 用 uL do w i eg 法鉴定 , 表 明
所含氨 基 己糖为氨 基半乳糖阁 。 将本 品 以 4
mo F L 盐酸溶解 (8 m扩而 ) , 于密封状态下 10
℃水解 14 1飞 , 将 水解液释成 0 . 6 111留而 , 取稀
释液 0 . 5 耐 , 加 乙酞丙酮试液 1耐 , 沸水浴 25
m in
, 冰水浴迅速冷却 , 加无水 乙醇 3耐 及对
二甲氨基苯甲醛 l ml , 强力振摇后 , 60 ℃水浴
l
.
s h
, 空 白管 以双蒸水代替本品 , 其余操作
相同 。 于分光光度 计上测 s or n m 处 的光吸收
值 A510 1u .1。 以纯的盐酸氨基半乳糖按 同样操作
制备标准曲线 , 从标准曲线求得氨基半乳糖含
量为 16 . 12% 。
2
.
8 己糖醛 酸含量侧 定及 C / 。 比值计算 黑
海参酸性粘多糖对硫酸 一 咔哇反应阳性 , 表明
2 2 4
, 嘟热
1 2 3
图 1 黑海参酸性粘多糖的琼脂糖电泳图谱
1
.黑海参酸性粘多糖 5滩 2 . 黑 海参酸性拈 多糖 l{
: 9 3 肝素 10 2唱
图 2 黑海参酸性粘多糖分子量测定的
激光飞 行时间质谱图
/一节丫~ 一~ 、 )万 (……一
澳 { 经
叻 肚 、 川川 自 4m u 、闹“ O 一酬琳 0 12阴 以 月渤 阳
图 3 黑海参酸性粘多糖的红外吸收光谱图
含有 己糖醛酸回 。 以纯 的葡萄糖醛酸 为标准 ,
用咔 哇法〔’ 0〕测得黑海参酸性粘多糖中己糖醛
酸含量为 20 . 34 % , 用地衣酚法 〔` 。〕测得 己糖醛
酸含 量为 17 . 8 8% , c / o = 2 0 . 34 % / 17 . 8 8% 二
1
.
13 58 4 > 1
, 因此黑海参酸性粘多糖 中的己糖
醛酸为葡萄糖醛酸 l[ 〕。
2
.
9 岩藻糖含量测定 黑海参酸性粘多糖与
硫酸 一 半 胧 氨 酸反 应 阳性 , 表 明含 有 岩藻
糖〔`2〕。 取 0 . 5 间 黑海参酸性粘多糖 ( o . 4 m留
而 ) , 加 4 . 5 耐 硫 酸溶液 (浓硫酸 : 水 = 6 : l ,
v八 ) , 摇匀后静置 15 m i n , 沸水浴 10 m i n , 室
温冷却 , 加 0 . 1 m l 3% 盐酸 半胧 氨酸 , 摇匀 ,
静置 l h , 以空 白管调零 , 于分光光度计上测
中药材第 2 卷第 5 期 19 9 年 5 月
45 6 mn 处的光吸收值 与肠 n n l , 空 白管 以双蒸水
代替黑海参酸性粘多糖 , 其余操作相同 。 用纯
的 D 一 岩藻糖为标准 , 按相同操作制备标 准曲
线 , 由标准曲线求得黑海参酸性粘多糖 中岩藻
糖含量 1 . 6 % 。
3 讨论
粘多糖是动物体内蛋白多糖分子中的糖链
部分 , 为动物界所特有 , 主要存 在于细 胞 间
质 , 是结缔组 织无 定形基 质的重要 成分 。 粘
多糖在维持组织及机体的整体结构 , 保持细胞
外液的稳定等方面起着重要的作用 。 外源性粘
多糖的生物作用成为粘多糖药用的基础 , 许多
实验研究发现粘多糖可能具有多种药理用途 ,
因此 , 粘多糖这类生物大分子越来越受到生命
科学工作者青睐 。
黑海参是我国南海海域产量丰富而食用价
值不高的一种海参 , 目前仍未被深人研究和开
发利用 。 我们采用木瓜蛋白酶和稀碱消化 , 醋
酸钾和乙醇分级沉淀的方法 , 从黑海参体壁中
分离纯化获得高纯度的酸性粘多糖 , 其组成与
文献报道 的刺 参 、 玉 足 海 参 酸 性 粘多糖类
似 〔` 3, `4〕 , 但各组 成成分 的含量有 所不同 , 分
子量也较低 , 只有 10 2 53 D a , 表明这是一种新
的酸性粘多糖 , 提示其药理作用 可能有所 不
同。 我们采用原代培养的皮质神经元模型研究
表明 , 黑海参酸性粘 多糖对皮质神经元损 伤
具有明显的保护作用 , 提示黑海参酸性粘多糖
对于防治中枢神经系统退行性疾病可能有一定
的应用前景 。
参 考 文 献
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( 19 9 8
一 1 1 一 3 0 收稿 )本研究系国家杰出青年基金 (肠 . 3% 25 以犯 2 )和 广东省自
然科学基金 ( No . 9以 )125 )资助项 目
xE t拍 c d朋 a n d P u对6 ca it on of A ic 山c M u c o po 】y阳 e c h a ir ds fr o n l 王lo 勿ht “血 ` 介u
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二 u co 浏 y s a c c h面 d e ~ 16 . 12 % , 17 · 8 8% , 1 1 . 6 % an d 23 . 5 2 % er s J翔〕ivt el y .
众y w o找卜 少为之。动~ 口之m Ja e g e r ; M uc o l洲〕ly 、 hc iar de ; xtE , it on a dn uP山 c iat on ; P ll y s ie al an d hc e而 c al orP pe irt se中药材第 2 卷第 5期 199 年 5月 · 2 25 ·