全 文 ：第 32 卷
2004年 6 月　　　　　　　　　　　
分析化学(FENXI HUAXUE)　研究报告
Chinese Journal of Analy tical Chemistry
　　　　　　　　　　　 第 6 期
710～ 714
高效液相色谱法研究红芪指纹图谱
封士兰　胡芳弟　赵健雄＊　徐静汶 陈立仁
(兰州医学院 , 兰州 730000) (中国科学院兰州化学物理研究所 ,兰州 730000)
摘　要　研究了 10 个红芪样品的指纹图谱 , 采用高效液相色谱法 ,乙腈-水梯度洗脱 , 流速 1.0 mL/ min , 柱温
25℃,色谱图光谱采集范围:190 ～ 400 nm , 以武都米仓山红芪药材作为对照品 , 用指标成分毛蕊异黄酮和芒
柄花素进行了定位 ,并测定了它们的含量 , 找出了 23个共有峰 , 其中 10 号峰和 14 号峰分别为毛蕊异黄酮和
芒柄花素。10 个样品平均相似度为 97.3%以上 ,结果表明:红芪样品指纹图谱及指标成分含量测定可用于全
面控制红芪药材的质量。
关键词　红芪 ,指纹图谱 , 高效液相色谱
2003-05-28收稿;2003-12-26接受
本文系甘肃省省长基金资助项目(No.GS015-A45-007 , GS024-A43-018)
1　引　　言
中药发挥药效的物质基础是存在于其中的各种化学成分 。由于中药所含化学成分的复杂性 ,在目
前的技术条件下 ,要想测定中药所含的所有化学成分是非常困难的。不同种中药之间的区别 、同种中药
(产地 、采收期不同)的差异 ,归根结底在于其化学成分的种类和含量存在差异 ,这种差异可以通过现代
分析手段 ———中药指纹图谱特征反映出来。
红芪为豆科植物多序岩黄芪(hedysarum polybotrys Hand.-Mazz .)的干燥根[ 1] 。具有补气固表 、
利尿排毒 、排脓和敛疮生肌等多种功效[ 2] 。现代药理研究表明 ,红芪具有抑制金黄色葡萄球菌 、结核杆
菌及降压 、提高免疫功能等作用。红芪主要生长在甘肃省陇南地区 ,甘肃省以红芪作为黄芪的代用品已
有悠久的历史 ,红芪与黄芪均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能 ,且红芪副作用较黄芪小[ 3] 。
关于红芪的质量控制目前只有一些常规的鉴别 ,未见红芪中黄酮的含量测定和指纹图谱研究的报道。
本实验采用高效液相色谱法研究了甘肃不同产地 10个红芪样品的指纹图谱 ,分析了 23个共有峰 ,平
均相似度为 97.297%;用指标成分毛蕊异黄酮(formononetin , 7 ,3′-dihydroxy-4′-methoxyisoflavone)、芒柄花
素(calycosin , 7-hydroxy-4′-methoxyisoflavone)进行了定位 ,并测定了含量 ,为红芪的质量控制提供了依据。
2　实验部分
2.1　仪器和试剂
2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);2996二极管阵列检测器;M 32色谱管理站 。乙腈和甲
醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂),冰醋酸为分析纯(北京化工厂),超纯水(兰州医学院
第一附属医院);红芪采自甘肃省武都县 、陇西县 、漳县 、岷县 ,由兰州医学院生药学教研室赵汝能教授和
马志刚教授鉴定 。芒柄花素 、毛蕊异黄酮由上海中药研究所提供 。
2.2　色谱条件
大连依利特 C18柱(4.6 mm×250 mm , 5 μm , i.d.)。水-乙腈为梯度流动相(见表 1);温度 25℃;
色谱图光谱采集范围:190 ～ 400 nm;以黄酮为参照物检测波长 254 nm 。
2.3　对照品溶液的制备
分别精密称取毛蕊异黄酮 、芒柄花素对照品 ,用甲醇溶解定容。制成浓度为毛蕊异黄酮 2.350 g/
L ,芒柄花素 2.325 g/L 的对照品溶液。
2.4　供试品溶液的制备
2.4.1　正丁醇法　用四分法称取药材 2.500 g ,用甲醇超声提取 3次(各 30 、30 、30 mL),每次 30 min ,
蒸干甲醇 。残渣用 40 mL水溶解 ,再用正丁醇萃取 4次(40 、40 、20和 20 mL),分取正丁醇层 ,减压回收
正丁醇至干 ,残渣用甲醇超声溶解 ,定容于 5 mL 容量瓶中。用 0.45 μm 膜过滤 ,进样量 10 μL ,测定波
长 254 nm ,流动相见表 1。
2.4.2　甲醇法　用四分法称取药材 2.500 g ,用甲醇超声提取 3次 ,过滤提取液 ,滤液定容于 25 mL 容
量瓶中 ,用 0.45 μm 膜过滤 ,进样量 30 μL ,测定波长 254 nm ,流动相见表 1。
表 1　测定红芪指纹图谱的流动相
Table 1　Mobile phase for the determination of chromatographic fingerprint of hongqi
时间 Time(min) 流速 Flow rate(mL/min) 水 Water(%) 乙腈 Acetonit ri le(%)
0 1.0 96 4
20 1.0 75 25
40 1.0 55 45
60 1.0 30 70
70 1.0 20 80
80 1.0 0 100
120 1.0 0 100
3　结果与讨论
3.1　检测波长的选择　
对 190 ～ 400 nm 扫描的各波长下的色谱图进行分析比较 ,结果 254 nm 各峰分离良好 ,峰数目也比
较多 ,而且参照物毛蕊异黄酮和芒柄花素在此波长都有最大吸收 。因此 ,选择 254 nm作为检测波长。
3.2　供试品溶液制备方法的选择　
用 2种方法制备的供试品溶液 ,按色谱条件测定红芪的指纹图谱 ,结果用甲醇法提取 ,放置 1 ～ 2 d
会析出颗粒状水溶性结晶 ,影响指纹图谱测定的稳定性 ,测定的峰数也少;用正丁醇法处理样品可以除
去水溶性的单糖和多糖 ,延长色谱柱的使用寿命 ,测定的峰数多 ,各峰分离良好 。因此 ,选择正丁醇法处
理样品。
3.3　流动相的选择　
先以常用的甲醇和水作为流动相进行检测 ,不论如何调整比例 ,都得不到比较好的色谱图 。于是将
水换为醋酸溶液 ,分别试用了 0.5%、1.0%、1.5%和 2.0%的醋酸溶液 ,结果 1.0%的醋酸溶液和甲醇
一起组成梯度流动相分离所得指纹图谱比较好。但是 ,峰数比较少。又将甲醇换为乙腈 ,以不同比例和
不同梯度的乙腈和水作为流动相 ,检测指纹图谱 ,最后选择表 1流动相 ,整个色谱图形比较好 。
3.4　参照物色谱峰的鉴定
在254 nm 波长下 ,用表 1的流动相测定参照物毛蕊异黄酮和芒柄花素 ,其保留时间分别为 28.40
和 37.38 min ,并与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较 ,发现红芪样品指纹图谱中的 10号和 14号峰
的保留时间及紫外光谱图分别与毛蕊异黄酮 、芒柄花素一致 ,故红芪样品指纹图谱中 10号和 14号特征
峰鉴定为毛蕊异黄酮和芒柄花素 ,见图 1和图 2。
3.5　指纹图谱分析 、数据处理及相似度
用 2.4.1色谱条件测定了 10批红芪药材样品指纹图谱 。由于武都米仓山是地道红芪产地 ,所以以
武都米仓山红芪为对照 ,对各个峰紫外光谱图进行对比分析 ,找到 23 个共有峰。对各个样品峰面积比
值 、保留时间比值及相似度等进行计算 。数据处理用 Waters Pat ten Mat tch相似度软件计算 ,采用的原
理是夹角余弦法 。以所有峰的峰面积计算相似度 ,10个样品的相似度为 90.0%～ 95.4%,平均相似度
为 92.8%;以共有峰的峰面积计算相似度 , 10 个样品的相似度为 92.6%～ 99.9%;平均相似度为
97.3%。两种计算方法全部符合中药注射剂指纹图谱技术指南要求(0.9 ～ 1.0),结果见表 2和表 3。
3.6　相似度的精密度与重现性
色谱指纹图谱的相似度是指图谱的整体相关性 ,它把色谱指纹图谱的重叠率和共有峰的峰强度结合
起来。其计算方法有两种 ,一种是相关系数法 ,一种是向量夹角余弦法 ,本文即采用该法。分别取武都米
711第 6 期 封士兰等:高效液相色谱法研究红芪指纹图谱 　　
　图 1　毛蕊异黄酮 、芒柄花素对照品的 HPLC 图
Fig.1　Chromatogram of fo rmononetin and caly cosin
流动相(mobile phase):见表 1 (same as table 1);检测波长
(detection wavelength):254 nm。
　图 2　a.武都米仓山 、b.岷县 、c.陇西首阳红芪指纹图
谱
Fig.2 　Typical chromatog rams fo r the de termination o f
fingerprint of Hongqi f rom Wudu M icang shan(a), Minx-
ian(b)and Longxi Shouyang(c)
正丁醇法处理样品 ,检测波长:254 nm;10号峰为毛蕊异黄酮;
14号峰为芒柄花素(sample was ext racted wi th butanol , mobile
phase:same as table 1 , detect ion w avelength:254 nm , number
10:fomononetin , number 14:calycosin)。
仓山红芪样品溶液 ,连续进样 5次 ,测定指纹图谱相
似度的日内精密度 ,结果所有峰的峰面积与对照品相
比相似度(%)分别为 91.9 、92.2 、90.7 、90.9和 92.5 ,
RSD=0.88%;每天进样一次 ,连续 3天进样 ,测定指
纹图谱相似度的日间精密度 ,结果 3次进样测定所有
峰的峰面积与对照品相比相似度(%)分别为 91.9、90.9 、93.7和 94.8 , RSD=3.29%。分别取武都米仓山
的红芪 5份 ,按供试品溶液的制备方法制备样品溶液 ,测定指纹图谱相似度的重复性 ,结果 5份样品所有
峰的峰面积与对照品相比相似度(%)分别为 92.2 、92.5 、92.5 、93.7和 94.8 ,RSD=1.16%。
表 2　10个红芪样品所有峰与武都米仓山红芪之间的相似度
Table 2　Similarity of all peaks from 10 hongqi samples between Wudu micangshan samples
样品名称
Name of
sample(co llection date)
武都
Wudu(2001-10)
岷县
Minxian(2001-10)
漳县
Zhangx ian(2001-10)
首阳镇
Shouyang
xian(2001-10)
武都米仓山
Wudu
micang shan(2002-10)
梅川镇
M eichuan(2002-7)
首阳镇
Shouyang(2002-7)
渭河镇
Weihezhen(2002-7)
首阳罗家山
Shouyang
luojiashan(2002-7)
漳县大草滩野生
Zhangxian-
dacao tan(2002-7)
相似度
Similiarit y(%) 90.9 91.5 93.6 90.0 92.8 92.6 95.4 93.2 94.8 93.1
表 3　10个红芪样品共有峰保留时间(min)及与武都米仓山红芪之间的相似度
Table 3　Retention times of common peaks and similarity of 10 hongqi samples between hongqi from Wudu M icangshan
共有峰编号
Number of
common
peaks
武都
Wudu
(2001-10)
岷县
Minxian
(2001-10)
漳县
Zhangx ian
(2001-10)
首阳镇
Shouyang
xian
(2001-10)
武都米仓山
Wudu
micang shan
(2002-10)
梅川镇
M eichuan
(2002-7)
首阳镇
Shouyang
(2002-7)
渭河镇
Weihezhen
(2002-7)
首阳罗家山
Shouyang luo-
jiashan
(2002-7)
漳县大草
滩野生
Zhangxian-
dacao tan
(wild)(2002-7)
1 7.51 7.43 7.39 7.48 7.44 7.30 7.43 7.39 7.39 7.69
2 9.23 9.46 8.84 9.03 9.15 8.88 8.93 8.73 9.49 9.60
3 10.90 10.89 10.90 10.87 10.84 10.87 10.87 10.82 11.09 10.83
4 11.63 11.68 11.51 11.72 11.64 11.70 11.42 11.53 11.67 11.46
5 16.45 16.34 15.17 16.21 16.47 16.51 16.45 16.43 15.01 16.39
6 18.70 18.61 18.65 18.72 18.73 18.70 18.77 18.63 18.63 18.56
7 19.15 19.22 19.08 19.17 19.17 19.13 19.19 19.07 19.08 19.00
8 19.44 19.52 19.41 19.47 19.46 19.48 19.49 19.35 19.41 19.31
9 25.94 25.72 25.89 25.95 25.97 25.88 25.91 25.84 25.89 25.76
10 28.71 28.76 28.41 28.71 28.73 28.45 28.32 28.56 28.55 28.49
11 30.44 30.47 30.42 30.44 30.47 30.43 30.19 30.12 30.22 30.29
12 31.24 31.29 31.22 31.24 31.28 31.21 31.23 31.16 31.21 31.08
13 31.98 32.03 31.96 31.98 32.02 31.92 31.91 31.86 31.93 31.80
712　　 分 析 化 学 第 32 卷
续表 3(continued table 3)
共有峰编号
Number of
common
peaks
武都
Wudu
(2001-10)
岷县
Minxian
(2001-10)
漳县
Zhangx ian
(2001-10)
首阳镇
Shouyangxian
(2001-10)
武都米仓山
Wudu
micang shan
(2002-10)
梅川镇
M eichuan
(2002-7)
首阳镇
Shouyang
(2002-7)
渭河镇
Weihezhen
(2002-7)
首阳罗家山
Shouyang luo-
jiashan
(2002-7)
漳县大草
滩野生
Zhangxian-
dacao tan
(Wild)
(2002-7)
14 37.78 37.85 37.44 37.76 37.82 37.50 37.65 37.59 37.38 37.53
15 39.88 39.87 39.68 39.77 39.85 39.84 39.60 39.92 39.78 39.57
16 41.76 41.76 41.76 41.76 41.90 41.69 41.74 41.69 41.66 41.63
17 42.47 42.52 42.25 42.30 42.50 42.38 42.31 42.26 42.24 42.20
18 44.50 44.73 44.51 44.50 44.69 44.57 44.56 44.49 44.51 44.37
19 49.40 49.51 49.32 49.39 49.47 49.42 49.33 49.29 49.38 49.43
20 52.33 52.38 52.26 52.33 52.36 52.27 52.13 52.13 52.25 52.14
21 59.37 59.45 59.27 59.36 59.43 59.29 59.21 59.22 59.31 59.19
22 61.24 61.32 61.08 61.22 61.30 61.13 61.04 61.01 61.05 60.99
23 62.66 62.74 62.46 62.64 62.72 62.54 62.46 62.42 62.45 62.41
相似度(%)
Similarit y
95.20 99.38 92.99 99.44 99.99 99.99 92.62 99.16 99.14 95.06
3.7　红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量测定
色谱条件为 Kromasil C18(5μm ,4.6 mm×250 mm)色谱柱(天津琛航科学仪器有限公司);流动相
为甲醇-水 ,梯度洗脱(见表 4),λ:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃。毛蕊异黄酮和芒柄花素回归
方程和相关系数分别为:A =1.12×105C-7.70×104 , r=0.9992和 A =1.09×105C-9.19×104 , r=
0.9962;线性范围分别为 2.4 ～ 47.0 ng 和 2.3 ～ 46.5 ng 。样品处理方法同 2.4.1 ,结果见表 5。色谱图
见图 3和图 4。
表 4　测定毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的流动相
Table 4　Mobile phase for the determination of fo rmononetin and caly cosin
时间
Time(min)
水
Water(%)
甲醇
M ethanol(%)
时间
Time(min)
水
Water(%)
甲醇
Methanol(%)
0 40 60 10 50 50
30 60 40 50 60 40
表 5　红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量
Table 5　Content of formononetin and calycosin from hongqi
序号
No. 样品来源(采集时间)Name of sample(collect ion date) 毛蕊异黄酮含量(μg/ g)Formononet in 芒柄花素含量(μg/ g)Calycosin
1 岷县 Minxian(2001-10) 0.68 6.78
2 梅川镇 Meichuan(2002-07) 1.01 17.74
4 首阳镇 Shouyang(2001-10) 0.55 6.25
5 渭河镇 Weihezhen(2002-07) 0.86 7.96
6 首阳罗家山 Shouyangluojiashan(2002-07) 0.66 16.88
7 漳县 Zhangxian(2001-10) 1.04 11.92
8 漳县大草滩野生 Zhangxiandacaotan wi ld(2002-07) 4.10 16.34
9 武都 Wudu(2001-10) 0.82 6.09
10 武都米仓山 2～ 3年生 Wudu micangshan(2002-10) 0.70 6.70
3.8　讨论
(1)所研究的红芪指纹图谱具有比较好的稳定性和重复性。10个红芪样品的指纹图谱的相似度都
在90%以上 ,符合国家药典委员会颁发的“中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南”的要求。而
且 ,7月份未成熟期的样品与 10月份成熟期的样品之间没有大的差别 。用指纹图谱峰面积计算相似
度 ,既考虑了各个组分的含量 ,又考虑了各个组分峰的保留时间 ,这样的指纹图谱有定性和定量双重意
义;(2)文献[ 4]报道 ,红芪与黄芪的一个显著的差别是红芪不含黄芪甲苷 ,本研究也证实了这一点 。红
芪和黄芪都含毛蕊异黄酮和芒柄花素。但是红芪中芒柄花素的含量高于毛蕊异黄酮 ,而黄芪中芒柄花
素的含量低于毛蕊异黄酮;(3)通过测定 ,10个红芪样品指纹图谱的特征性及专属性很强。23个共有峰
713第 6 期 封士兰等:高效液相色谱法研究红芪指纹图谱 　　
　图 3　红芪样品的 HPLC 图
Fig.3　Chromatogram of hongqi sample
　图 4　毛蕊异黄酮和芒柄花素的 HPLC 图
Fig.4　Chromatog ram of formononetin and calycosin
稳定性很好 ,其中 10号峰和14号峰为毛蕊异黄酮和芒柄花素 ,毛蕊异黄酮的含量为 0.5 ～ 2.0 μg/g ,芒
柄花素的含量为6.0 ～ 20.0μg/g 。将红芪的指纹图谱与毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量测定结合起来可
全面控制红芪药材的质量 。
References
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Studies on Fingerprint of Hongqi by
High Performance Liquid Chromatography
Feng Shilan1 , Hu Fangdi1 , Zhao Jianxiong＊1 , Xu Jingw en1 , Chen Liren2
1(Lanz hou Medical College , Lanzhou 730000)
2(Lanzhou Institute of Chemical Physics , Chinese Academy of Sciences , Lanz hou 730000)
Abstract　Fingerprints of 10 samples of hongqi were studied by high-perfo rmance liquid chromatog raphy
w ith acetonit rilefo r-water g radient elution , flow-rate of 1.0 mL/min , column temperature of 25℃, ac-
quisiition wave range w as 190 ～ 400 nm , wudumicangshan Hongqi regard as standard , f ingerprints w ere
posit ioned w ith index composition such as 7 , 3′-dihydroxy-4′-methoxy isof lavone , 7-hydroxy-4′methoxy-
isoflavone and then the xontent was determined.23 common peaks w ere analysed , 10th and 14th peaks
w ere respectively 7 ,3′-dihydroxy-4′methoxyisof lavone and 7-hydro xy-4′-methoxyisoflavone , avg rage simi-
larity of 10th samples w as 97.3%.The result showed that the f ingerprints of 10 samples of Hongqi can be
used to control the quality of Hongqi combined w ith content determination.
Keywords　Hongqi , fingerprint , high-performance liquid chromatography
(Received 28 May 2003;accepted 26 December 2003)
714　　 分 析 化 学 第 32 卷