全 文 ：黄瓜子不同提取部位对体外培养大鼠成骨细胞的影响
裴启洋， 佟 鑫， 贾天柱*
(辽宁中医药大学，辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2013-05-05
基金项目:中药饮片炮制技术研究平台项目基金 (2010ZX09401-304-105A)
作者简介:裴启洋 (1988—)，男，硕士生，从事中药炮制方向研究。Tel:18604078716，E-mail:qypeitx@ 163． com
* 通信作者:贾天柱 (1951—)，男，教授，博士生导师。Tel:(0411)87586499，E-mail:jiatz@ lnutcm． edu． cn
摘要:目的 比较黄瓜子不同提取部位对大鼠体外成骨细胞增殖、骨钙素水平及碱性磷酸酶活性的影响。方法 采用
酶消化法分离大鼠成骨细胞，与黄瓜子不同提取溶剂 (石油醚、正丁醇及乙酸乙酯)提取液和大鼠含药血清共同培
养。用 CCK-8 法测定细胞增殖，双抗体夹心酶联免疫法和微量酶标法分别测定细胞骨钙素水平以及细胞碱性磷酸酶活
性。结果 黄瓜子各提取部位的含药培养液及含药血清对成骨细胞均有一定的增殖作用，其中正丁醇及乙酸乙酯提取
部位对成骨细胞骨钙素的合成及碱性磷酸酶活性作用明显。结论 结合资料分析，对成骨细胞有增殖作用的有效成分
存在于黄瓜子正丁醇提取部位中。
关键词:黄瓜子;成骨细胞;增殖;骨钙素;碱性磷酸酶
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)04-0680-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 04. 004
Effect of extracts from cucumber-seed on rat osteoblasts in vitro
PEI Qi-yang， TONG Xin， JIA Tian-zhu*
(Liaoning University of TCM，Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province，Dalian 116600，China)
ABSTＲACT:AIM To compare the effect of different extracting solvents for cucumber-seed (the seed from Cu-
cumber sativus)on the proliferation of rat osteoblasts，the osteocalcin level and the activity of alkaline phosphatase．
METHODS Enzyme digestion was used to separate osteoblasts from rats． The osteoblasts were incubated with
solvent (ethyl ether，ethyl acetate，and norma butanol)extracts from cucumber-seed and the rat’s setm containing
them． CCK-8 was employed to measure the proliferation，a double-antibody sandwich method to assess the osteocal-
cin level，and ELISA kit were used to analyze the activity of alkaline phosphatase． ＲESULTS All of the solvent
extracts，especially normal butanol and ethyl acetate fractions，assisted in promoting the proliferation of osteoblasts．
CONCLUSIONS In combination of data analysis，effective constituents from cucumber-seed may exist in normal
butanol fractions．
KEY WOＲDS:cucumber-seed;osteoblasts;proliferation;osteocalcin;alkaline phosphatase
黄瓜子为葫芦科植物黄瓜 Cucumber sativus L．
的干燥成熟种子。《中华本草》中记载黄瓜子具有
续筋接骨、祛风、消痰的功效，主治骨折筋伤、风
湿痹痛、老年痰喘［1］，在民间多用于接骨疗伤，
近年收载于《辽宁省中药材标准》［2］。黄瓜子在许
多复方中有应用且作用明显，如骨折挫伤散等。但
其接骨作用机制及在骨代谢过程中的细胞生物学作
用尚未见报道，因此为了研究其药理药效作用，本
实验选取细胞增殖、骨钙素水平及碱性磷酸酶活性
为指标，观察了生制黄瓜子不同提取部位及含药血
清对成骨细胞增殖、分化的影响，以此来评价黄瓜
子对成骨细胞的作用，并为探讨黄瓜子接骨作用机
理及临床应用提供科学依据。
1 材料
1. 1 药材 生品黄瓜子购于安徽亳州，经辽宁中
医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为葫芦科植
物黄瓜 Cucumber sativus L． 的干燥成熟种子;制品
黄瓜子:以温度计测量锅底温度，待温度上升至
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120 ℃时，取生品黄瓜子置于锅内，保持锅温条件
下炒制 2 min至深黄色，取出放凉备用。
1. 2 主要试剂 DMEM 液体培养基 (赛默飞世尔
生物化学制品有限公司);胎牛血清 (Gibco) ;胰
酶 (Gibco) ;Ⅱ型胶原酶 (Gibco) ;CCK-8 (上海
生博生物医药科技有限公司) ;骨钙素放免试剂盒
(南京建成生物工程研究所);碱性磷酸酶酶免试
剂盒 (南京建成生物工程研究所)。
1. 3 主要仪器 倒置显微镜 (Olympus，日本) ;
CO2 培养箱 (sanyo，日本) ;Multuskan Mk3 型酶
标仪 (赛默飞世尔仪器有限公司)。
1. 4 动物 1 d 龄 SD 新生大鼠及 SD 雌性大鼠均
购自大连医科大学动物实验中心，许可证号:
SCXK (辽)2008-0002。
2 方法
2. 1 新生大鼠颅骨成骨细胞的培养［3-5］ 取 1 d 龄
SD大鼠用 75%乙醇消毒 5 min 后置于培养皿中，
取出颅骨，置 PBS 液内清除骨膜、血管及结缔组
织等，剪成 1 mm2 的碎片;将骨片移入 0. 25%胰
酶中，于 5%CO2 培养箱中 37 ℃消化 20 min;弃去
消化液，加入 0. 1%Ⅱ型胶原酶，于 CO2 培养箱中
37 ℃消化 2 h;用 100 目筛网将消化液滤过至离心
管，加入培养液终止消化，1 000 r /min离心10 min
后弃去上清液，向离心管中加入 15%胎牛血清的
DMEM培养基 (以下简称血清培养液)，用细胞计
数板调整细胞密度为 5 × 105 /mL，接种于培养瓶，
于 5%CO2 培养箱中 37 ℃培养，24 h 后换液，以
后每两日换液一次;待原代细胞 (见图 1)80%铺
满瓶底时以 1 ∶ 2 的比例进行传代培养，并依上法
加血清培养液继续培养、传代，取第 3 代成骨细胞
进行实验。
图 1 原代成骨细胞 (20x)
Fig. 1 Primary osteoblasts of rats (20x)
2. 2 黄瓜子的提取及含药血清的制备 取黄瓜子
生、制品粗粉，70%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，
合并提取液经浓缩后，分别用石油醚、乙酸乙酯、
正丁醇萃取。收集各萃取液，蒸干后加纯净水配成
相当于饮片生药量为 1 g /mL 的药液，分别为:生
品石油醚层、生品乙酸乙酯层、生品正丁醇层、生
品水层、制品石油醚层、制品乙酸乙酯层、制品正
丁醇层、制品水层。取 SD 雌性大鼠随机分为 9
组，每组 6 只，其中 8 组分别为生品石油醚层、生
品乙酸乙酯层、生品正丁醇层、生品水层、制品石
油醚层、制品乙酸乙酯层、制品正丁醇层、制品水
层，用药剂量根据黄瓜子临床成人一日用量［2］与
人和动物体积表面折算和等效剂量比率表［6］进行
折算后，按 1 mL /100 g 给药量灌胃上述提取的相
应药液，剩余一组灌胃生理盐水，记为空白对照
组，每日 1 次，连续 7 d，最后一次给药后 2 h，用
3%的水合氯醛腹腔注射麻醉 (1 mL /100 g)，腹主
动脉取血，离心得血清， － 20 ℃保存备用。
2. 3 细胞培养试药的制备 在预实验中根据黄瓜
子临床成人一日用量［2］与人和动物体积表面折算
和等效剂量比率表［6］进行了严谨的量效关系考察，
最终确定两种培养液的配制方法与给药剂量如下。
2. 3. 1 含药培养液 将 “2. 2”项下提取的黄瓜
子生、制品各提取部位蒸干称定质量，溶于 DMSO
中，配成相当于饮片含黄瓜子提取物为 50 mg /mL
的药液，再加无血清培养液将其稀释至 5 × 10 －2
mg /mL，0. 22 μm 过滤除菌，得含药培养液，
－ 20 ℃保存备用。
2. 3. 2 含药血清培养液 将 “2. 2”项下所得血
清室温融化，再加无血清培养液将其稀释至含
15%含药血清的培养液，0. 22 μm过滤除菌，得含
药血清培养液， － 20 ℃保存备用。
2. 4 细胞加药培养及检测［7-8］
2. 4. 1 黄瓜子不同提取部位对成骨细胞增殖的影
响 选择第 3 代成骨细胞，用血清培养液调配细胞
密度为 0. 5 × 105 /mL，铺入 96 孔板，每孔 200 μL，
培养 24 h后换无血清培养液继续培养 24 h 后，弃
去培养液;向 96 空孔板中加入 “2. 3”项下制备
的培养液，每药重复 4 孔，每孔 200 μL，培养48 h
后弃去培养液 (以制品正丁醇组为例，加药培养
前后见图 2，图 3)，每孔加入 CCK-8 试剂 50 μL，
培养 4 h后，用酶标仪于 405 nm 处测定其吸光度
值，所得吸光度值用 SPSS 统计学软件进行处理，
计算公式如下:细胞增殖率 = ［(A加药 － A对照) /
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A对照］ × 100%
图 2 加药培养前的成骨细胞 (10 ×)
Fig. 2 Osteoblasts before being cultured with the
medium (10 ×)
图 3 加药培养后的成骨细胞 (10 ×)
Fig. 3 Osteoblasts after being cultured with the
medium (10 ×)
2. 4. 2 黄瓜子不同提取部位对成骨细胞内骨钙素
水平及碱性磷酸酶活性的影响 参照 “2. 4. 1”项
下加药培养细胞的方法，加药培养 48 h 后弃去培
养液，加入 0. 25%胰酶消化细胞，吸出细胞悬液
至 EP管中，反复冻融以使细胞破碎，其上清液以
双抗体夹心酶联免疫法测定骨钙素水平，以微量酶
标法测定碱性磷酸酶活性。
3 结果
3. 1 黄瓜子对成骨细胞增殖的影响 生、制黄瓜
子不同提取部位的含药培养液及含药血清对成骨细
胞的增殖均有明显的促进作用，结果见表 1 ～ 2。
3. 2 黄瓜子对成骨细胞骨钙素水平的影响 生、
制黄瓜子正丁醇及乙酸乙酯提取部位的含药培养液
及含药血清对成骨细胞骨钙素的合成有一定促进作
用，结果见表 3 ～ 4。
3. 3 黄瓜子对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
生、制黄瓜子正丁醇及乙酸乙酯提取部位的含药培
养液及含药血清对成骨细胞碱性磷酸酶活性有一定
促进作用，结果见表 5 ～ 6。
表 1 含药培养液对成骨细胞增殖的影响 (x ± s，n =10)
Tab. 1 In vitro effects of medicated culture medium on pro-
liferation of osteoblasts of rats (x ± s，n =10)
组 别 细胞增殖 细胞增殖率 /%
生品石油醚层 1. 230 ± 0. 083＊＊＊ 60. 6
生品乙酸乙酯层 1. 642 ± 0. 061＊＊＊ 114. 4
生品正丁醇层 1. 689 ± 0. 020＊＊＊ 120. 1
生品水层 1. 399 ± 0. 045＊＊＊ 82. 7
制品石油醚层 1. 093 ± 0. 088＊＊＊ 42. 7
制品乙酸乙酯层 1. 654 ± 0. 051＊＊＊ 116. 1
制品正丁醇层 1. 708 ± 0. 018＊＊＊ 123. 1
制品水层 1. 354 ± 0. 134＊＊＊ 76. 8
无血清培养液对照组 0. 766 ± 0. 037 —
注:与无血清培养液对照组比较，＊＊＊P ＜ 0. 001
表 2 含药血清培养液对成骨细胞增殖的影响 (x ± s，n =10)
Tab. 2 In vitro effects of medicated serum culture medium
on proliferation of osteoblasts of rats (x ± s，n =
10)
组 别 细胞增殖 细胞增殖率 /%
生品石油醚层 1. 398 ± 0. 023 —
生品乙酸乙酯层 1. 991 ± 0. 092＊＊＊ 41. 8
生品正丁醇层 1. 900 ± 0. 309＊＊＊ 35. 2
生品水层 1. 441 ± 0. 044 2. 6
制品石油醚层 1. 096 ± 0. 074 —
制品乙酸乙酯层 2. 141 ± 0. 117＊＊＊ 53. 3
制品正丁醇层 1. 914 ± 0. 595＊＊＊ 50. 6
制品水层 1. 492 ± 0. 119 6. 3
空白血清对照组 1. 404 ± 0. 020 —
注:与空白血清对照组比较，＊＊＊P ＜0. 001
表 3 含药培养液对成骨细胞骨钙素水平的影响 (x ± s，
n =10)
Tab. 3 In vitro effects of medicated culture medium on os-
teocalcin of osteoblasts of rats (x ± s，n =10)
组 别 骨钙素 /(ng·mL －1)
生品石油醚层 4. 610 ± 0. 945
生品乙酸乙酯层 5. 370 ± 0. 033＊＊＊
生品正丁醇层 5. 377 ± 0. 036＊＊＊
生品水层 4. 926 ± 0. 059*
制品石油醚层 4. 705 ± 0. 133
制品乙酸乙酯层 5. 445 ± 0. 070＊＊＊
制品正丁醇层 5. 398 ± 0. 053＊＊＊
制品水层 4. 941 ± 0. 078＊＊
无血清培养液对照组 4. 777 ± 0. 116
注:与无血清培养液对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01，
＊＊＊P ＜ 0. 001
4 讨论
成骨细胞是骨代谢过程中的主要功能细胞，负
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责骨基质的合成、分泌和矿化，并在骨修复过程
表 4 含药血清培养液对成骨细胞骨钙素水平的影
响(x ± s，n =10)
Tab. 4 In vitro effects of medicated serum culture medium
on osteocalcin of osteoblasts of rats (x ± s，n =10)
组 别 骨钙素 /(ng·mL －1)
生品石油醚层 4. 890 ± 0. 092
生品乙酸乙酯层 5. 259 ± 0. 173＊＊＊
生品正丁醇层 5. 242 ± 0. 160＊＊＊
生品水层 4. 948 ± 0. 115*
制品石油醚层 4. 913 ± 0. 215
制品乙酸乙酯层 5. 241 ± 0. 248＊＊＊
制品正丁醇层 5. 232 ± 0. 218＊＊＊
制品水层 5. 058 ± 0. 105＊＊
空白血清对照组 4. 749 ± 0. 175
注:与空白血清对照组比较，* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01，＊＊＊P ＜0. 001
表 5 含药培养液对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
(x ± s，n =10)
Tab. 5 In vitro effects of medicated culture medium on al-
kaline phosphatase activety of osteoblasts of rats
(x ± s，n =10)
组 别 金氏单位 /U
生品石油醚层 21. 4 ± 3. 1
生品乙酸乙酯层 26. 7 ± 2. 1＊＊＊
生品正丁醇层 27. 1 ± 2. 5＊＊＊
生品水层 23. 2 ± 1. 9
制品石油醚层 21. 7 ± 2. 2
制品乙酸乙酯层 26. 9 ± 1. 7＊＊＊
制品正丁醇层 27. 5 ± 2. 0＊＊＊
制品水层 23. 5 ± 1. 1*
无血清培养液对照组 21. 0 ± 2. 5
注:与无血清培养液对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊＊P ＜ 0. 001
表 6 含药血清培养液对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
(x ± s，n =10)
Tab. 6 In vitro effects of medicated serum culture medium
on alkaline phosphatase activety of osteoblasts of
rats (x ± s，n =10)
组 别 金氏单位 /U
生品石油醚层 24. 1 ± 2. 1
生品乙酸乙酯层 27. 1 ± 1. 7＊＊
生品正丁醇层 27. 4 ± 2. 6＊＊
生品水层 25. 5 ± 2. 3
制品石油醚层 24. 3 ± 1. 1
制品乙酸乙酯层 27. 2 ± 2. 7＊＊
制品正丁醇层 28. 2 ± 2. 5＊＊＊
制品水层 25. 9 ± 1. 9
空白血清对照组 23. 9 ± 1. 6
注:与空白血清对照组比较，＊＊P ＜ 0. 01，＊＊＊P ＜ 0. 001
中与破骨细胞相互协调，参与破骨细胞骨吸收功能
的调节，在骨代谢过程中有极为重要的作用。成骨
细胞数量不足或功能减退都会影响骨的修复过程，
并可能引发骨质疏松症等骨疾病，因此提高成骨细
胞的增殖和分化水平是防治此类疾病的关键［9］。所
以本实验选取成骨细胞增殖、骨钙素水平及碱性磷
酸酶活性为指标，观察生制黄瓜子不同提取部位及
其含药血清对体外培养成骨细胞增殖及分化的影响，
来评价黄瓜子在骨代谢过程中对成骨细胞的作用。
成骨细胞在体内外均可增殖，而成骨细胞数量
的增加会生成更丰富的胶原，促使生成更多的骨组
织;反之，成骨细胞过度凋亡导致骨形成量不足，
就会引发骨折和骨质疏松等疾病［10］。本实验结果显
示黄瓜子各提取部位对成骨细胞增殖均具有促进作
用，说明黄瓜子的接骨作用是通过加快成骨细胞的
生长，达到促进骨形成和修复的目的。
骨钙素又称骨 γ －羧基谷氨酸蛋白，是由成骨
细胞和成牙骨质细胞特异合成和分泌的一种非胶原
蛋白，是构成骨基质的成分之一，为骨基质中含量
最多的非胶原蛋白，其功能是保证骨的正常矿
化［11］，是成骨细胞分化的标志之一。碱性磷酸酶
由成骨细胞分泌，它既可做为成骨细胞的功能标记
物，又可反映其分化成熟程度，是成骨细胞分化的
特异性标志［12］。本实验结果显示生制黄瓜子正丁
醇及乙酸乙酯提取部位能促进成骨细胞的骨钙素分
泌及提高碱性磷酸酶活性，说明该提取部位的化学
成分能促进成骨细胞的分化与成熟，生成更多的骨
基质来实现接骨作用。
另外实验结果显示炮制品作用普遍优于生品，
这可能是因为黄瓜子经炮制后其有效化学成分的溶
出度增加，或者炮制过程中发生了化学成分的转化
致使有效成分总量增加，有待进一步研究。
目前，在研究中药对体外细胞的作用时，多采
用将中药提取液直接与细胞共同培养的模式。本实
验为尽量模拟体内环境，在采用中药提取液直接与
细胞共同培养模式的同时，还进行了含药血清与细
胞培养液共同培养，以分析药物进入体内经代谢后
对成骨细胞的影响。对促成骨细胞生长与分化过程
中起主要作用的乙酸乙酯层及正丁醇层，其相应含
药血清组与原含药培养液组相比，在实验结果上并
未体现出明显差别，说明黄瓜子中促进成骨细胞生
长与分化的化学成分受胃肠道及血液代谢的影响很
小;空白血清组相较无血清组其成骨细胞骨钙素水
平与碱性磷酸酶活性也有一定提高，提示大鼠血清
中也含有可以促进成骨细胞分化与成熟的成分。
黄瓜子正丁醇提取部位在成骨细胞增殖、骨钙
素水平及碱性磷酸酶活性实验中均体现了比其他提
取部位更强的促进作用，提示黄瓜子提高成骨细胞
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增殖和分化水平进而促进骨形成及修复过程的物质
基础主要存在于正丁醇提取部位。另外巴戟天［13］、
狗脊［5］等药物作用于成骨细胞的提取部位同为正
丁醇层，提示各中药对成骨细胞起促进作用的成分
可能主要集中在正丁醇提取部位，有可能为一类具
有相似结构或性质相近的化合物，这为继续研究该
类药物对成骨细胞的作用机制提供了新思路。
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沙苑子总黄酮和百草酸的体内外抗肿瘤作用
白 勇1，2， 孙安盛1， 吴 芹1
(1． 贵州遵义医学院药理教研室，贵州 遵义 563003;2． 郑州市卫生学校药理教研室，河南 郑州 450005)
收稿日期:2013-03-08
作者简介:白 勇 (1978—) ，男，讲师，硕士，研究方向:肿瘤和免疫药理。Tel: (0371)68980527，E-mail:baiyong3@ sina． com
摘要:目的 观察沙苑子总黄酮和百草酸的体内外的抗肿瘤作用。方法 110 只接种 S180 肉瘤腹水昆明鼠随机分为模
型组、环磷酰胺组、羟基喜树碱组、沙苑子总黄酮组和百草酸组，MTT 法观察沙苑子总黄酮和熊果酸对 S180 肉瘤和
人结肠癌细胞 SW620 的体外抑制作用，ＲT-PCＲ法测定百草酸对凋亡基因 Bax、Bcl-2 及 P53 的 mＲNA表达。结果 沙
苑子总黄酮和百草酸对 S180 肉瘤小鼠均有抑制作用，百草酸的抑制作用更加明显。两者对胸腺和脾脏均无明显抑制
作用;沙苑子总黄酮对人结肠癌细胞 SW620 无明显抑制作用，而熊果酸却能明显的抑制该肿瘤细胞;熊果酸显著上
调促凋亡基因 P53 和 Bax的表达，下调抑凋亡基因 Bcl-2 的表达。结论 百草酸在体内和体外均有抗肿瘤作用，沙苑
子总黄酮的抗肿瘤作用尚需进一步研究。
关键词:沙苑子;百草酸;熊果酸;S180 肉瘤;抗肿瘤;筛选
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)04-0684-06
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 04. 005
Anti-tumor effect in vitro and in vivo of total flavonoids from Astragali complana-
ti Semen and ursolic acid
BAI Yong 1，2， SUN An-sheng1， WU Qin1
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