全 文 ：[中药指纹图谱 ]
广金钱草 HPLC指纹图谱的研究
陈思妮 , 　张振秋＊
(辽宁中医药大学药学院 ,辽宁 大连 116600)
收稿日期:2007-05-10
作者简介:陈思妮(1983-),女 ,硕士生 ,主要从事中药药物分析的研究。 E-mail:cc 83131@ 163.com
＊通讯作者:张振秋 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事中药药物分析研究。电话:0411-87586058
关键词:广金钱草;指纹图谱;高效液相色谱法
摘要:目的:采用高效液相色谱法对来自 11个地区广金钱草药材进行指纹图谱研究 , 为广金钱草药材质量控制提供依
据。方法:采用 PhenomsilC18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),以乙腈-甲醇-水为流动相进行梯度洗脱 , 流速 1.0 mL/
min,柱温 25℃, 检测波长 272 nm。结果:以 11个共有峰为评价指标 , 精密度和重复性试验中各共有峰相对保留时间和
相对峰面积的 RSD均小于 3%, 11批样品相似度大于 0.9。结论:此方法精密度 、稳定性和重复性良好 , 有助于广金钱草
药材的质量控制。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)09-1249-04
FingerprintofDesmodiumstyracifoliumbyHPLC
CHENSi-ni, 　ZHANGZhen-qiu
(PharmacologySchool, LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, Dalian116600 , China)
KEYWORDS:Desmodiumstyracifolium;fingerprint;HPLC
ABSTRACT:AIM:ThefingerprintchromatogramswereestablishedforqualityevaluationofDesmodiumstyracifo-
liumcolectedfrom 11 areasbyHPLC.METHODS:TheanalysiswasperformedonaPhenomsilC18 column
(4.6 mm×250 mm, 5 μm)withacetonitrile-carbinol-waterasmobilephaseinagradientmodeataflowrateof
1.0 mL/min, andatacolumntemperatureof25℃.Thedetectionofwavelengthwasat272 nm.RESULTS:11
peakswereselectedasthecommonfingerprintpeaks.Therelativestandarddeviationsforrelativeretentionvalues
andrelativepeakareaswerelessthan3%intheprecisionandrepeatedtest, thesimilarityof11 batchesofsamples
werenolessthan0.9.CONCLUSION:ThemethodisreliableandcanbehelpfulonthequalitycontrolofDesmo-
diumstyracifolium.
　　广金钱草为豆科植物广金钱草 Desmodium styracifolium
(Osb.)Merr.的干燥地上部分。始载于《岭南草药志 》, 为常
用中药。主产于我国广东省 , 具有清热除湿 , 利尿通淋之功
效。用于治疗各种淋证 , 水肿等疾病历史悠久。含黄酮类 ,
生物碱类 , 皂苷类 ,酚类等成分。 《中华人民共和国药典》只
收载了广金钱草中黄酮 , 生物碱的检查方法 , 且其混用品种
数量繁多 , 为其制定质量可控的标准带来了困难。本试验采
用反相高效液相色谱法 , 建立广金钱草药材的指纹图谱 , 并
对不同来源的广金钱草药材进行比较研究 ,为其鉴别与质量
控制提供了参考。
1　仪器与试药
1.1　仪器　美国 Agilent1100高效液相色谱仪 , Phenomsil
C18(4.6mm×250mm, 5 μm)色谱分析柱。 UV-3050型紫外
可见分光光度计 , AR2140电子分析天平 , AS3120A超声波清
洗器。
1.2　药品与试药　芦丁对照品(批号 100080-200306)、连钱
草 、积雪草和金钱草对照药材均购于中国药品生物制品检定
所。乙腈 、甲醇为色谱纯 , 水为重蒸馏水 ,其它试剂均为分析
纯。实验中所用广金钱草购自我国十一个地区 , 经辽宁中医
药大学李峰教授鉴定均为豆科山蚂蝗属植物广金钱草
Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分。来源
见表 1。
2　方法与结果
2.1　色谱条件及系统适用性　色谱柱 PhenomsilC18(4.6
mm×250 mm, 5μm);乙腈(A)-水(B)-甲醇(C)为流动相梯
度洗脱:0 ～ 10 min(10%A-85%B-5%C), 20 min(10%A-
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82%B-8%C), 30 min(12%A-80%B-8%C), 60 min(17%A-
75%B-8%C)。流速 1.0 mL/min, 柱温 25℃, 检测波长 272
nm, 进样量 20 μL。
表 1　 不同产地广金钱草来源
Table1　 SourcesofDesmodiumstyracifolium
序号 来源 收集时间 备注
1 北京 2006.01 茎叶混杂
2 杭州 2006.01 茎叶混杂
3 哈尔滨 2006.01 茎叶混杂
4 天津 2006.01 茎叶混杂
5 安国 2006.01 茎叶混杂
6 广州 2006.01 茎叶混杂
7 温州 2006.03 茎叶混杂
8 沈阳 2006.03 茎叶混杂
9 大连 2007.03 茎叶混杂
10 深圳 2007.03 茎叶混杂
11 南宁 2007.03 茎叶混杂
2.2　内标物溶液的制备　取芦丁对照品适量 , 用 60%甲醇
制成每 1 mL含 1.252 4 mg的溶液。
2.3　供试品溶液的制备　取各批广金钱草药材粉末和连钱
草 、积雪草 、金钱草粉末(过 2号筛)约 1.0 g,精密称定 , 置于
锥形瓶中 , 精密加入 60%甲醇溶液 20 mL, 超声处理 30 min,
放冷 , 再称定重量 ,用 60%甲醇溶液补足减失的重量 , 摇匀 ,
滤过 , 取续滤液 3 mL于 5 mL量瓶中 , 精密加入内标物溶液
1 mL,加 60%的甲醇至刻度 ,即得。
2.4　测定方法　分别精密吸取供试品溶液 20 μL, 注入液
相色谱仪 , 记录 60 min色谱图即得。内标物及广金钱草药
材 HPLC指纹图谱见图 1, 图 2。
图 1　芦丁内标物色谱图
Fig.1　HPLCchromatogramofrutin
图 2　广金钱草对照指纹图谱
Fig.2　ReferencefingerprintofDesmodiumstyracifolium
2.5　精密度试验　取 1号药材制备的同一供试品溶液 , 连
续进样 5次。结果表明 ,色谱图中各色谱峰的相对保留时间
的 RSD小于 2%;相对峰面积的 RSD小于 5%, 符合指纹图
谱要求 ,表明仪器精密度良好。
2.6　稳定性试验　取 1号药材制备的同一供试品溶液 , 分
别在 0、 1、2、6、12、 24 h进样测定 , 结果表明 , 各主要色谱峰
的相对保留时间的 RSD小于 2%, 相对峰面积的 RSD小于
3%, 表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2.7　重复性试验　取 1号药材 5份 , 每份约 1.0 g, 精密称
定 ,照供试品溶液制备方法制备 ,进样检测 , 结果表明各色谱
峰的相对保留时间的 RSD小于 2%;相对峰面积的RSD小于
4%, 表明方法的重复性良好。
2.8　指纹图谱的建立及分析
2.8.1　广金钱草药材 HPLC指纹图谱中共有峰的标定　将
11批广金钱草药材的指纹图谱进行匹配(见图 3), 结果表
明 1 ～ 11号峰在 11批样品的色谱图中均出现。因此标定此
11个峰为共有指纹峰 ,并据此建立广金钱草药材的 HPLC指
纹图谱。
图 3　11批不同来源广金钱草药材的指纹图谱
Fig.3　HPLCFingerprintof11 batchesofsamples
图 4　广金钱草叶指纹图谱
Fig.4　HPLCFingerprintofleaf
2.8.2　共有指纹峰保留时间和峰面积与参照物保留时间和
峰面积的比值　以芦丁色谱峰的保留时间和峰面积为 1,计
算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间
的 RSD小于 3.0%(n=11, 结果见表 2)。相对峰面积结果
见表 3。由表 3和图 4可见 , 各批供试品指纹图谱的重现性
较好 ,但各批样品间共有指纹峰的相对峰面积有一定差异。
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表 2　 11批广金钱草药材共有特征指纹峰的相对保留时间
Table2　 RelativeretentiontimeofcommonpeaksinsamplesfingerprintsofDesmodiumstyracifolium
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 均值 RSD%
1 0.38 0.38 0.38 0.36 0.38 0.38 0.37 0.37 0.37 0.37 0.37 0.37 1.9
2 0.41 0.40 0.41 0.39 0.41 0.41 0.40 0.40 0.39 0.40 0.39 0.40 2.1
3 0.42 0.42 0.43 0.41 0.42 0.43 0.42 0.42 0.41 0.42 0.41 0.42 1.9
4 0.48 0.48 0.48 0.46 0.48 0.48 0.47 0.47 0.47 0.47 0.47 0.47 1.5
5 0.52 0.52 0.55 0.50 0.52 0.52 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 2.5
6 0.58 0.58 0.58 0.57 0.58 0.58 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 1.0
7 0.69 0.68 0.69 0.68 0.69 0.69 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.8
8 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.73 0.0
9 0.83 0.83 0.83 0.82 0.83 0.83 0.83 0.82 0.82 0.82 0.82 0.83 0.7
10 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.0
11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.0
表 3　 11批广金钱草药材共有指纹图谱峰的相对峰面积
Table3　 RelativeareaofcommonpeaksinsamplesfingerprintsofDesmodiumstyracifolium
峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 0.14 0.12 0.09 0.08 0.11 0.08 0.10 0.10 0.11 0.13 0.11
2 0.33 0.26 0.28 0.26 0.28 0.18 0.26 0.19 0.23 0.30 0.26
3 0.46 0.36 0.19 0.33 0.33 0.26 0.32 0.27 0.34 0.44 0.39
4 0.31 0.24 0.19 0.22 0.22 0.18 0.21 0.18 0.23 0.30 0.26
5 0.56 0.47 0.43 0.51 0.44 0.36 0.43 0.36 0.45 0.56 0.48
6 1.45 1.13 1.18 1.43 1.05 0.81 1.04 0.82 1.07 1.42 1.26
7 1.19 1.01 0.91 1.12 0.94 0.73 0.93 0.74 0.97 1.17 1.06
8 0.44 0.36 0.36 0.45 0.33 0.26 0.32 0.26 0.35 0.43 0.37
9 0.09 0.09 0.09 0.09 0.08 0.06 0.07 0.07 0.09 0.09 0.08
10 0.31 0.29 0.23 0.27 0.29 0.23 0.28 0.24 0.29 0.32 0.28
11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
图 5　广金钱草茎指纹图谱
Fig.5　HPLCFingerprintofcaudex
2.9　数据处理
2.9.1　系统聚类分析　本研究以形态学鉴定的 11个不同
产地的广金钱草样品为研究对象进行指纹图谱研究 , 获得
11个共有峰 , 将其峰面积相当于内参照物峰的峰面积量化
得到 11＊11阶原始数据矩阵 , 运用 spss软件对其进行聚类
分析。
　　各批次样品相对峰面积聚类分析结果显示 , 样 2、样 3、
样 5、样 7、样 9、样 11相似程度较高 ,聚为一类;样 1、样 4、样
10聚为一类 , 样 6、样 8聚为一类。见图 7。
图 6　广金钱草易混品指纹图谱(由上至下分别为广金钱
草 , 连钱草 ,积雪草 ,金钱草)
Fig.6　HPLCFingerprintofthesampleofmixeasy
图 7　聚类分析图
Fig.7　Clusteranalysis
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2.9.2　相似度分析　采用 EXCEL软件进行相似度计算 , 以
相关系数来进行相似度评价 ,结果见表 4, 表明不同产地的
广金钱草相似度较高 。
表 4　 广金钱草指纹图谱相似度结果
Table4　 SimilarityofHPLCFingerprintof
Desmodiumstyracifolium
编号 相似度 编号 相似度
样 1 0.988 样 7 0.998
样 2 0.999 样 8 0.973
样 3 0.992 样 9 0.999
样 4 0.990 样 10 0.990
样 5 0.998 样 11 0.998
样 6 0.972
　　两种方法处理结果基本一致 ,但由于分析方法不完全相
同 , 在某些结果上还有所不同。本实验的相似度计算采用了
EXCEL表进行了相关系数的计算 , 补充聚类分析以更加精
确地判断 11批广金钱草间的相似关系与分类状况。
3　讨论
3.1　色谱条件及系统适用性考察　取广金钱草药材供试品
溶液进行紫外扫描 , 结果表明在 272nm和 340 nm有较强的
吸收且在 272 nm有最大吸收。检测波长在 272 nm时 , 色谱
峰较多 , 基线平稳 ,各峰分离度较好。 试验过程中选择了多
种流动相系统:甲醇-水 ,乙腈 -水 ,乙腈-1%冰醋酸水溶液 , 乙
腈-甲醇-水梯度洗脱几种方式 , 并对梯度洗脱程序进行优
化 , 结果表明以乙腈-水-甲醇为流动相梯度洗脱为最佳 , 各
色谱峰分离度较好 , 峰型尖锐 , 保留时间适中。试验中分别
考察了 0.8 mL/min和 1.0 mL/min两种流速 , 结果表明以
1.0 mL/min为流速各色谱峰分离度较好 ,保留时间适中 。
3.2　提取溶剂的选择　实验中比较了 30%甲醇 , 60%甲醇
和甲醇超声提取样品 , 结果以 60%甲醇超声提取的样品杂
质少 , 含量高。
3.3　内标物的选择　广金钱草的主要成分为黄酮 , 目前其
含有的黄酮类化合物已知的有 5种:异牡荆苷 、vicenin-1、
vicenin-2、夏佛塔苷和异荭草苷 , 均属于黄酮类衍生物。本
实验选择了槲皮素 、芹菜素 、木犀草素 、牡荆素 、芦丁等与其
成分相似的对照品 ,考察了供试品不加内标与加入内标的对
比图谱 ,发现芦丁在共有峰出峰处无干扰 , 结果采用以芦丁
为内标物 ,并以其色谱峰为参照峰进行谱图分析。
3.4　不同用药部位的考察　广金钱草为地上部分入药 , 本
试验对其茎和叶分别制备供试品溶液 , 检测指纹图谱 , 结果
茎和叶均有 11个共有峰 , 但叶的含量明显高于茎(见图 4,
图 5),为药典中提出的 “叶多色绿者佳”提供了理论依据。
3.5　易混品的指纹图谱比较　广金钱草混淆品种繁多 , 本
试验首次采用指纹图谱对广金钱草 , 连钱草 , 积雪草和金钱
草进行鉴别(见图 6), 用整体图形的形式直观的对其进行了
鉴别。
实验结果表明 ,通过指纹图谱整体图形 、共有特征峰 、相
对保留时间等参数可对药材进行鉴定 , 通过各共有峰相对峰
面积可对药材的内在质量进行评价。 11批广金钱草药材指
纹相似度结果可以看出 ,不同来源的广金钱草指纹图谱相似
度较高 ,均大于 0.9。但是 ,各峰相对峰面积有一定的差异 ,
说明药材之间的内在质量是有差异的 , 提示药材应在定产地
的前提下才能保证药品内在质量的一致性。同时说明单以
一个或几个成分含量为主的质量控制方法已不能真正反映
中药材质量 ,而利用指纹图谱对药材进行综合 、宏观的评价
可获得全面反映药材特性的色谱分离图 ,制定出系统性 、特
征性和稳定性均较好的药材指纹图谱 , 为中药材的质量评价
提供了全面的分析方法。
参考文献:
[ 1] 　中国药典 2005年版一部 [ S] .2005.
[ 2] 　曹　进 ,叶兆波 , 车镇涛.广金钱草与金钱草指纹图谱比较
[ J] .药物分析杂志, 2006, 26(9):1248-1250.
[ 3] 　李小燕 ,潘洪平.广西粉葛药材高效液相色谱指纹图谱的研究
[ J] .中成药 , 2006, 28(9):1249-1253.
河南蒲公英 RP-HPLC指纹图谱研究
李喜凤 1 , 　师绘敏 2 , 　万　焱1
(1.河南中医学院药学院 ,河南 郑州 450008;2.河南商业高等专科学校营销系 ,河南 郑州 450008)
收稿日期:2007-09-14
基金项目:河南省科技厅重点科技攻关项目(课题编号:062306100)。
作者简介:李喜凤(1952-),女 ,教授 ,硕士生导师。研究方向:中药新药及质量标准。电话:0371-65575823。
关键词:蒲公英;RP-HPLC;指纹图谱
摘要:目的:建立河南蒲公英药材的高效液相标准指纹图谱。方法:采用 RP-HPLC法 , 测定了 40个不同蒲公英样品。流
动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钠缓冲盐溶液(pH=3.8),梯度洗脱 , 记录色谱图 80 min, 流速 1.0 mL/min,检测波长
323nm, 柱温 35℃。结果:标示出 9个共有指纹峰。结论:该方法简便 、可靠 、重现性好 , 可用于蒲公英药材的鉴定与评
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