全 文 ：顾华杰 ,黄金汇 ,金　琎 ,等.4种灰树花多糖测定方法的比较 [ J].江苏农业科学 , 2011, 39(4):400-402.
4种灰树花多糖测定方法的比较
顾华杰 1 , 黄金汇 1 , 金　琎1 , 胡翠英 1 , 王桃云 1 , 陈家长 2
(1.苏州科技学院化学与生物工程学院 ,江苏苏州 215009;2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 ,江苏无锡 214081)
　　摘要:采用苯酚 -硫酸法 、蒽酮 -硫酸法 、3, 5-二硝基水杨酸法 、费林滴定法等 4种方法测定了液体发酵法培养
的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多糖 , 测定了每种方法的最佳吸收波长 、标准曲线 ,比较了仪器精密度 、重现性 、稳
定性及加样回收率。结果表明:苯酚 -硫酸法测定胞内多糖较好 , 最佳吸收波长为 485 nm;3, 5 -二硝基水杨酸法测
定胞外多糖较好 ,最佳吸收波长为 490 nm。
　　关键词:灰树花;多糖;苯酚 -硫酸法;蒽酮 -硫酸法;3, 5-二硝基水杨酸法;费林滴定法
　　中图分类号:R284.2　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)04-0400-03
(上接第 399页)
3　结论
料液比 、超声波辅助提取时间 、提取温度均会影响马齿苋
粗多糖提取量 ,其中提取温度影响最大 ,其次是固液比 ,提取
时间的影响最小 。通过单因素试验和 L9(33 )正交试验得出
马齿苋粗多糖的最佳提取工艺条件为:固液比 1 g∶30mL,温
度 70 ℃,浸提时间 30 min。在最佳工艺条件下 ,开花期野生
马齿苋草粉中粗多糖提取量为(10.191 9±0.040 3)%(风干
基础)。
开花期野生马齿苋草粉中粗多糖相对常规饲料而言其含
量较高 ,预计将马齿苋草粉添加到动物饲料中可以起到类似
中草药饲料添加剂的某些功能 ,在提高动物免疫力方面能起
到一定作用 ,但是作用程度还需通过动物试验进行深入研究
和验证 。
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　　灰树花(Grifolafrondosa)是多孔菌属的一种大型真菌 ,别
称贝叶多孔菌 、栗子蘑、佛菌 、重菇等 [ 1 ] 。经过大量的化学和
药理分析发现 ,灰树花多糖具有明显的抗肿瘤 ,抗 HIV病毒 ,
改善免疫系统 ,调节血糖 、血脂及胆固醇水平 ,降血压等作用 ,
可防止癌细胞的生成和转移 ,对艾滋病 、高血压 、肥胖症 、糖尿
病以及免疫系统功能的紊乱都有一定的疗效 ,且无任何毒副
作用 [ 2 ] 。灰树花多糖是富含 β -1, 6-糖苷键及 β -1, 3-糖
苷键的真菌多糖 ,生理活性显著 [ 3] 。因此 ,对灰树花及其提
取物中多糖含量的测定就显得十分重要 。测定多糖的方法很
多 ,但不同方法适用的范围不同 ,对不同来源多糖测定的准确
性 、稳定性、重现性也不同 。本研究采用苯酚 -硫酸法 、蒽酮
-硫酸法 、3 , 5-二硝基水杨酸法 、费林滴定法等 4种方法测
定了液体发酵法培养的灰树花菌丝体的胞内多糖和胞外多
糖 ,并对这 4种测定方法进行了比较 ,为准确测定灰树花多糖
提供依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
收稿日期:2010-09-01
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项(编号:nycytx-48)。
作者简介:顾华杰(1981—),男 ,江苏苏州人 ,硕士 ,实验师 ,主要从事
食用菌生理生化研究。 E-mail:liongu@mail.usts.edu.cn。
灰树花菌种购自江苏省高邮市食用菌研究所 。
PDA液体培养基:马铃薯 20%,葡萄糖 2%,磷酸二氢钾
0.3%,硫酸镁 0.15%,维生素 B1 0.001%, pH值自然 。
1.2　试验方法
1.2.1　液体培养条件　500 mL锥形瓶 , 200mL液体培养基 ,
恒温振荡培养箱 27 ℃ 160r/min培养 7 d。
1.2.2　多糖提取 　胞内多糖测定采用微波辅助热水浸提
法 [ 4 -5] :将培养好的菌液经 4层纱布过滤后得菌丝体 ,蒸馏水
冲洗干净后 ,置于干燥箱中 70 ℃烘干至恒重 ,取干菌丝体粉
末 2 g,按 1 g∶40mL料液比加入蒸馏水 ,置于微波炉中 ,中
高火(750W)加热 10min,放入沸水浴中 30 min, 1 000 r/min
离心取上清液即为胞内多糖水溶液 。
胞外多糖测定采用醇沉法 [ 5 ] :取纱布过滤后的液体培养
基加入 4倍体积的 95%乙醇 ,混匀后 4 ℃下放置 24 h, 4 ℃
4 000 r/min离心 20min,沉淀中加入 80mL蒸馏水 ,沸水浴溶
解 30min, 1 000 r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液 。
还原糖测定采用酸水解法 [ 6] :取制得的胞内多糖或胞外多
糖水溶液 15 mL,加入 6 mol/L盐酸 10 mL,搅拌均匀后在沸水
浴中水解 30 min,冷却至室温后用 6mol/LNaOH中和至中性 ,
蒸馏水定容至 100mL,即得胞内或胞外的还原糖水溶液 。
1.2.3　多糖提取
1.2.3.1　苯酚 -硫酸法 [ 7 -8 ] 　最大吸收波长的选择:吸取
—400— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 4期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.04.052
0.1mg/mL葡萄糖标准品溶液 0.6 mL,加蒸馏水至 1mL,在
冰水浴中加入 5%苯酚水溶液 0.5mL、浓硫酸 5 mL,混匀 ,沸
水浴 2 min,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照 ,于 400 ～
600nm波长范围内扫描 。
标准曲线制作:分别吸取 0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液
0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL各 3份 ,按最大吸收波
长项下方法测定 ,以浓度 (C)为横坐标 ,吸光度(D)为纵坐
标 ,绘制标准曲线 。
精密度试验:精确吸取葡萄糖标准品溶液 0.4 mL,按最
大吸收波长项下方法测定 5次 D值 。
重现性试验:分别取 1 mL的胞内多糖水溶液 (稀释 100
倍)和胞外多糖水溶液(稀释 10倍)各 5份 ,按最大吸收波长
项下方法测定 D值 。
稳定性试验:分别取 1 mL的胞内多糖水溶液 (稀释 100
倍)和胞外多糖水溶液(稀释 10倍)各 1份 ,按最大吸收波长
项下方法显色后 ,分别在 10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h时测
定 D值 。
加样回收率试验:取胞内多糖水溶液 (稀释 100倍)和胞
外多糖水溶液(稀释 10倍)各 10 mL,分别加入 1 mL葡萄糖
标准品溶液后 ,各取 5份 1 mL样液 ,按最大吸收波长项下方
法测定 D值 ,计算加样回收率。
1.2.3.2　蒽酮 -硫酸法 [ 7 , 9 ] 　最大吸收波长的选择:吸取
0.1mg/mL葡萄糖标准品溶液 0.6 mL,加蒸馏水至 1 mL,在
冰水浴中加入 0.1%蒽酮 -硫酸溶液 6 mL, 混匀 , 沸水浴
10 min,冷水浴冷却;以相应溶液作为空白对照 , 于 500 ～
700nm波长范围内扫描 。按最大吸收波长项下的测定方法 ,
进行标准曲线的制作 、精密度试验 、重现性试验 、稳定性试验
和加样回收率试验 。
1.2.3.3　3, 5-二硝基水杨酸法(DNS法)[ 6, 10] 　最大吸收
波长的选择:吸取 1 mg/mL葡萄糖标准品溶液 0.6 mL,加蒸
馏水至 1 mL,加入 DNS溶液 2mL,混匀 ,沸水浴 5 min,冷水
浴冷却后 ,加入 9 mL蒸馏水;以相应溶液作为空白对照 ,于
400 ～ 600nm波长范围内扫描 。
标准曲线制作:分别吸取 1mg/mL葡萄糖标准品溶液0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0mL各 3份 ,按最大吸收波长项下方法测定 ,
以浓度(C)为横坐标 ,吸光度(D)为纵坐标 ,绘制标准曲线。
使用胞内还原糖水溶液(稀释 5倍)和胞外还原糖水溶
液 ,按最大吸收波长项下的测定方法 ,进行精密度试验 、重现
性试验 、稳定性试验和加样回收率试验 。
1.2.3.4　费林滴定法 [ 10 -11] 　空白滴定:吸取费林甲 、乙液各
5 mL于 250mL锥形瓶中 ,加入蒸馏水 10mL及 1 mg/mL葡
萄糖标准溶液 9mL,加热至沸腾 ,保持 30s,趁热以每 2s1滴
的速度滴加葡萄糖标准溶液 ,至溶液蓝色刚好褪去为终点 ,记
录消耗葡萄糖标准溶液体积(V0)。
样品滴定:吸取费林甲 、乙液各 5 mL于 250mL锥形瓶中 ,
加蒸馏水 10 mL及胞内还原糖或胞外还原糖样品稀释液5mL,
滴定管加入比预备滴定量少 0.5 mL左右的葡萄糖标准液 ,摇
匀后加热至沸腾 ,保持 30 s后匀速滴入葡萄糖标准液 ,至蓝色
刚好褪去为终点 ,记录消耗葡萄糖标准溶液体积(V)。
还原糖(mg/mL)=(V0 -V)×葡萄糖标准液浓度 /参加
反应的样液量 ×样品稀释倍数
重现性试验:分别取 5 mL胞内还原糖水溶液 (稀释 5
倍)和胞外还原糖水溶液各 5份进行滴定 ,记录每次耗用的
葡萄糖标准液的量 。
加样回收率试验:样品滴定时 ,在加入费林甲 、乙液各
5 mL及蒸馏水 10 mL后 ,再加入胞内还原糖水溶液 (稀释 5
倍)或胞外还原糖水溶液 5 mL+葡萄糖标准溶液 1 mL,然后
进行滴定操作 ,重复 5次 ,记录每次葡萄糖标准液的用量 。
1.2.4　数据处理　试验数据均采用 Excel进行处理分析 。
2　结果与分析
2.1　苯酚 -硫酸法
最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为 485 nm。
标准曲线制作:绘制标准曲线 , 得回归方程为 y=
0.008 2x+0.035 2(r2 =0.999 6),表明葡萄糖浓度在 5 ～
100μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系 。
精密度试验:测得吸光值分别为 0.376、0.375、0.377、
0.376、0.376,平均值为 0.376 , RSD=0.188%,表明仪器的精
密度良好 。
重现性试验:对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算得烘
干菌丝体中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为 0.182、0.179、
0.177、 0.174、 0.170 g/g, 平均值为 0.176 g/g, RSD=
2.743%,表明该方法重现性良好;对于胞外多糖 ,根据测得的
吸光值计算得液体培养基中多糖(以葡萄糖计)含量分别为
21.659、26.780、23.610、25.073、22.878 μg/mL, 平均值为
24.000μg/mL, RSD=8.275%,表明该方法重现性不好 。
稳定性试验:对于胞内多糖 ,测得的吸光值分别为 0.392、
0.393、0.392、0.391、0.391,平均值为 0.392 , RSD=0.214%,
表明胞内多糖溶液的测定在 2 h内基本稳定;对于胞外多糖 ,
测得的吸光值分别为 0.138、0.139、0.139、0.137、0.137,平均
值为 0.138, RSD=0.725%,表明胞外多糖溶液的测定在 2 h
内基本稳定 。
加样回收率试验:一般加样回收率在 80% ～ 120%的效
果较好 [ 12] ,利用此指标及 RSD的大小来判断加样回收率的
优劣 。对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算得加样回收率
分别为 96.439%、93.756%、88.390%、85.707%、85.707%,
平均回收率为 90.000%, RSD=5.415%,表明加样回收率良
好;对于胞外多糖 ,根据测得的吸光值计算得加样回收率分别
为 79.610%、72.902%、75.585%、68.878%、80.951%,平均
回收率为 75.585%, RSD=6.521%,表明加样回收率不好 。
2.2　蒽酮 -硫酸法
最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为 620 nm。
标准曲线制作:绘制标准曲线 , 得回归方程为 y=
0.006 6x+0.050 2(r2 =0.999 8),表明葡萄糖浓度在 5 ～
100μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系 。
精密度试验:测得吸光值分别为 0.327、0.326、0.377、
0.326、0.325,平均值为 0.326 , RSD=0.217%,表明仪器的精
密度良好 。
重现性试验:对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算得烘
干菌丝体中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为 0.129、0.116、
0.112、 0.109、 0.105 g/g, 平均值为 0.114 g/g, RSD=
7.967%,表明该方法重现性一般;对于胞外多糖 ,根据测得的
—401—顾华杰等:4种灰树花多糖测定方法的比较
吸光值计算得液体培养基中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为
72.061、60.848、68.424、77.818、57.515 μg/mL, 平均值为
67.333 μg/mL, RSD=12.245%,表明该方法重现性不好 。
稳定性试验:对于胞内多糖 ,测得的吸光值分别为 0.230、
0.230、0.231、0.231、0.231,平均值为 0.231 , RSD=0.238%,
表明胞内多糖溶液的测定在 2 h内基本稳定;对于胞外多糖 ,
测得的吸光值分别为 0.307、0.308、0.310、0.310、0.310,平均
值为 0.309, RSD=0.458%,表明胞外多糖溶液的测定在 2 h
内基本稳定 。
加样回收率试验:对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算
得加样回收率分别为 120.879%、 97.545%、 97.545%、
95.879%、94.212%, 平 均回收率为 101.212%, RSD=
10.948%,表明加样回收率不好;对于胞外多糖 ,根据测得的
吸光值计算得加样回收率分别为 93.000%、 63.000%、
121.333%、121.333%、126.333%,平均回收率为 105.000%,
RSD=25.629%,表明加样回收率不好 。
2.3　DNS法
最大吸收波长的选择:测得最大吸收波长为 490 nm。
标准曲线制作:绘制标准曲线 , 得回归方程为 y=
1.599 5x-0.003 3(r2 =0.994 8),表明葡萄糖浓度在 0.2 ～
1.0mg/mL范围内与吸光度呈较好的线性关系。
精密度试验:测得吸光值分别为 0.644、0.645、0.647、
0.648、0.650 ,平均值为 0.647 , RSD=0.369%,表明仪器的精
密度良好 。
重现性试验:对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算得烘
干菌丝体中多糖(以葡萄糖计)含量分别为 0.109、0.090、
0.104、 0.099、 0.107 g/g, 平均值为 0.102 g/g, RSD=
7.382%,表明该方法重现性一般;对于胞外多糖 ,根据测得的
吸光值计算得液体培养基中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为
98.614、93.613、96.113、86.110、90.278 μg/mL, 平均值为
92.946 μg/mL, RSD=5.283%,表明该方法重现性良好 。
稳定性试验:对于胞内多糖 ,测得的吸光值分别为 0.116、
0.117、0.118、0.118、0.118,平均值为 0.117 , RSD=0.762%,
表明胞内多糖溶液的测定在 2 h内基本稳定;对于胞外多糖 ,
测得的吸光值分别为 0.100、0.101、0.102、0.103、0.103,平均
值为 0.102, RSD=1.281%,表明胞外多糖溶液的测定在 2 h
内基本稳定 。
加样回收率试验:对于胞内多糖 ,根据测得的吸光值计算
得加样回收率分别为 100.300%、 87.921%、 83.795%、
84.920%、 92.423%, 平均 回收 率为 89.872%, RSD =
7.475%,表明加样回收率一般;对于胞外多糖 ,根据测得的吸
光值计算得加样回收率分别为 84.545%、 79.669%、
83.420%、81.919%、81.544%, 平均回收率为 82.219%,
RSD=2.267%,表明加样回收率较好 。
2.4　费林滴定法
重现性试验:对于胞内多糖 ,根据滴定量计算得烘干菌丝
体中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为 0.107、0.133、0.160、
0.160、0.133 g/g,平均值为 0.139 g/g, RSD=16.090%,表明
该方法重现性较差;对于胞外多糖 ,根据滴定量计算得液体培
养基中多糖 (以葡萄糖计)含量分别为 53.333、 26.667、
26.667、53.333、 80.000 μg/mL, 平均值为 48.000 μg/mL,
RSD=46.481%,表明该方法重现性很差 。
加样回收率试验:对于胞内多糖 ,根据滴定量计算得加样
回收率分别为 88.000%、98.000%、 88.000%、 98.000%、
98.000%,平均回收率为 94.000%, RSD=5.827%,表明加样
回收率良好;对于胞外多糖 ,根据滴定量计算得加样回收率分
别为 92.000%、87.000%、97.000%、92.000%、97.000%,平
均回收率为 93.000%, RSD=4.498%,表明加样回收率良好 。
3　讨论
苯酚 -硫酸法 、蒽酮 -硫酸法 、DNS法 、费林滴定法均可
用于测定灰树花的胞内多糖和胞外多糖 。其中 ,苯酚 -硫酸
法 、蒽酮 -硫酸法可直接测定总糖 ,而 DNS法和费林滴定法
是测定还原糖的 ,测定总糖需要先将多糖水解为还原糖后才
能测定 ,因此 ,样品的预处理相对复杂一些 。
相对于其他 3种方法 ,费林滴定法是通过观察颜色变化
判断反应终点 ,因此随机误差较大 ,而且由于其方法的限制 ,
不能进行精密度和稳定性试验 。
通过比较试验结果显示 ,苯酚 -硫酸法在测量胞内多糖
时 ,精密度试验 RSD=0.188%,重现性试验 RSD=2.743%,
稳定性试验 RSD=0.214%,加样回收率试验 RSD=5.415%,
平均加样回收率为 90.000%,这些数据都在良好范围内 ,所
以苯酚 -硫酸法测定灰树花胞内多糖比较好;DNS法在测量
胞外还原糖时 , 精密度试验 RSD=0.369%, 重现性试验
RSD=5.283%,稳定性试验 RSD=1.281%,加样回收率试验
RSD=2.267%,平均加样回收率为 82.219%,这些数据都在
良好范围内 ,所以 DNS法测定灰树花胞外还原糖比较好 。
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