全 文 ：第2 9卷 , 第6期　 　　　　　　　　　　　光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol.29 , No.6 , pp1668-1671
2 0 0 9 年 6 月　　　　　　　　　　　 　Spectro scopy and Spectr al Analy sis June , 2009 　
红色核桃仁种皮提取物紫外-可见光谱和质谱分析
王克建1 , 2 , 郝艳宾2 , 齐建勋2 , 胡小松1＊
1.中国农业大学食品科学与营养工程学院 , 北京　100083
2.北京农林科学院林业果树研究所 , 北京　100093
摘　要　采用紫外-可见光谱和高效液相色谱/电喷雾质谱(HPLC-ESI-MSn)联用技术对红色核桃仁种皮提
取物进行了初步分析。红色核桃仁种皮的盐酸乙醇提取物在 560和 591 nm 处有 2 个吸收峰 , 经过醋酸铅沉
淀和薄层层析纯化后在 340 , 370 , 552 和 585 nm 处有 4个吸收峰 , 说明红色核桃仁种皮中含有花色苷物质 ,
红色核桃仁种皮的盐酸乙醇提取物经 HPLC-ESI-MSn(负离子模式扫描)分析后获得 m/z 为 301 , 481 , 633 ,
783 , 785 和 951 等分子离子峰 , 其对应的物质为鞣花酸 、没食子酰基-鞣花酰基葡萄糖 、二鞣花酰基葡萄糖 、
二没食子酰基-鞣花酰基葡萄糖和鞣花酰基-像椀酰基葡萄糖等鞣花单宁。
关键词　红色核桃仁种皮;提取物;紫外-可见光谱;液相电喷雾质谱
中图分类号:O657.3　　文献标识码:A　　　DOI:10.3964/ j.issn.1000-0593(2009)06-1668-04
　收稿日期:2008-03-02 , 修订日期:2008-06-06
　基金项目:科技部攻关项目(2004BA502B09)资助
　作者简介:王克建 , 1972年生 , 北京农林科学院林业果树研究所副研究员　　e-mail:wangkejian7212@263.net
＊通讯联系人　　e-mai l:huxiaos@263.net
引　言
　　核桃是世界最古老的干果之一。研究表明核桃仁含有丰
富的不饱和脂肪酸 、优质蛋白质 、 少量糖类以及纤维素 、 维
生素 、钙 、 磷 、 铁等矿物元素 , 核桃仁种皮中含有多种具有
抗氧化活性的多酚类物质 , 核桃仁对人体具有降血压 、 降血
脂 、抗心血管疾病的作用[ 1-3] 。
现在世界范围内广泛栽培的核桃品种具有共同的特点 ,
即核桃仁种皮的颜色为黄色或浅黄色 , 比较单一。中国核桃
的种质资源相当丰富 , 红核桃就是其中的一种 , 它典型的生
物学形状是 1 年生和 2 年生枝条的表皮 、 韧皮部 、 嫩芽 、 叶
柄 、叶脉 、 外果皮和核桃仁种皮均为红褐色 , 它主要分布于
河南修武县 、 北京门头沟区 、 四川广源县 、 陕西城固县等
地[ 4] 。美国 McGranahan等人通过杂交方法选育出核桃仁种
皮呈现红色的“ Robe rt Livermo re”品种 , 枝条 、叶芽的颜色与
普通核桃相同为绿色[ 5] , 他们认为核桃仁种皮中呈现红色的
物质可能是花青素 , 但是没有对其进行研究分析。本文运用
紫外-可见光谱和液相质谱对红色核桃仁种皮提取物进行了
初步的分析研究。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
UV-2102 PC 型紫外-可见分光光谱仪(龙尼柯上海仪器
有限公司), LTQ 液相色谱质谱联用仪(Thermo Electr on),
RE52CS 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂), HB-Ⅱ循环水
式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司), 乙腈(色谱纯 ,
Sigma公司), 鞣花酸(色谱纯 , Sigma公司), 盐酸 、 乙醇 、乙
酸 、 正丁醇等均为分析纯 , 硅胶 G 板(100×50 mm , 青岛海
洋化工有限公司)。
1.2　实验方法
1.2.1　核桃仁种皮提取物的制备
红色种皮的核桃仁采自北京林业果树研究所核桃品种
园 , 种皮提取物的制备按文献[ 6] 的方法:人工剥取核桃仁
种皮 , 冷冻 、 干燥后 , 称取 10.00 g , 加入一定体积的 0.5%
的盐酸乙醇(70%)溶液 , 在80 ℃恒温水浴中浸提 3 次 , 每次
60 min , 合并 3 次的浸提液 , 过滤 、 浓缩 , 定容到 100 mL 。
1.2.2　紫外-可见光谱分析
对获得的红色核桃仁种皮提取液在 UV-2102 PC 型紫
外-可见分光光谱仪上进行全波长扫描分析。
1.2.3　提取物中花色苷的纯化
由本文 1.2.1 节获得粗提液 , 按文献[ 7] 的方法采用醋
酸铅沉淀进行提纯 , 得到红色溶液 , 在硅胶 G 板进行薄板层
析 , 展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=80∶20∶20。层析得到
的花色苷斑点用盐酸乙醇溶解后再进行紫外-可见光谱扫描。
1.2.4　HPLC-ESI-MSn 分析
提取物的 H PLC-ESI-MSn 分析[ 2 ,8]在清华大学分析中心
进行 , 分析仪器采用 LTQ 液相色谱质谱联用仪(Thermo E-
lectron);自动进样器 20μL;柱子:TC-C18 , (Aglilent 4.6×
50 mm , 5 μm par ticle size), 流动相:水(A)和乙腈(B)均含
有 0.1%的乙酸 , 具体洗脱条件如表 1 所示。
Table 1　Elution condition of HPLC
序号 流动相 流动相浓度/ %
流速
/(mL ·min-1)
时间
/min
1 B 5 1.2 0
2 B 5 1.2 1
3 B 75 1.2 9.5
4 B 95 1.2 18.5
5 B 95 1.2 19.5
　　经 H PLC 分离后样品送往质谱检测器检测 , 流速为 0.1
mL·min-1 ;质谱条件:解吸附温度 380 ℃, 源温度 350 ℃,
离子能力 35 eV;提取核心2 eV;解吸附气流 1 200 L· h -1 ;
毛细管温度 350 ℃, 电离源电压 5 kV , 毛细管电压33 V , 管
透镜电压 95 V , 鞘气 N2 , 流速 30 Arb , 辅助气 7 Arb。分别
作正离子和负离子模式扫描 , m/ z 扫描范围 50.00 ～
2 000.00。
2　结果与讨论
2.1　提取物及其纯化后的紫外-可见光谱分析
花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素 , 属于黄
酮类化合物 , 水果 、 蔬菜 、 花卉的颜色大都与之有关 , 在自
然状态下花青素与各种单糖形成糖苷 , 称为花色苷[ 9] 。因其
具有较强的抗氧化活性 , 已越来越受到人们的重视[ 10] 。近年
来 , 科研工作者对核桃仁种皮中多酚类物质进行了研究 , 认
为核桃仁中的多酚类物质主要为鞣花单宁类物质[ 11-13] , 而对
其中花色苷物质了解甚少。
我们利用紫外-可见光谱对红色核桃仁种皮提取物进行
了初步的分析(图 1), 其最大吸收波长在可见光区为 560 和
591 nm , 大于现有报道的花色苷的最大吸收区 500 ～ 550 nm
范围[ 14-16] , 这可能是由于提取液中花色苷与酚类物质形成复
合物 , 使花色苷稳定性提高 , 在可见光区出现明显红移[ 17] ;
提取物经过醋酸铅沉淀后 , 利用展开剂正丁醇∶冰醋酸∶水
=80∶20∶20 在硅胶 G 板上进行层析 , 获得 Rf 值为 0.55
的斑点 , 转移 , 用 0.5%的盐酸乙醇溶液溶解后再进行紫外-
可见光谱分析 , 在紫外区有 2 个吸收峰 , 波长分别为 340 和
370 nm , 在可见光区有 2 个吸收峰 , 其波长分别为 552 和
585 nm(图 2)。在 300 ～ 360 nm 附近有吸收峰说明色素中有
酰基基团存在;其盐酸乙醇溶液加入 AlCl3 后 , 发生红移(向
长波长方向移动), 说明 B 环存在游离羟基;色素溶液在紫
外光下无荧光 , 说明糖取代基不在 5 位上[ 18] 。
2.2　提取物的 HPLC-ESI-MSn 分析
电喷雾质谱是近年来发展出的一类“软电离”质谱方法 ,
它不同于传统的质谱方法 , 绝大多数样品分子在电离过程中
仅转变为分子离子 , 而不被打成碎片 , 从而大大地简化了质
谱的分析 , 具有操作简单 , 灵敏度高的优点[ 8 , 19] 。
红色核桃仁种皮提取物未经过醋酸铅沉淀 、 薄板层析纯
化前在紫外区有很强的吸收(图 2), 表明其中含有多酚类物
质。我们在负离子模式下对红色核桃仁种皮提取物进行电喷
雾质谱扫描(图 3), 获得 m/ z 为 301 , 481 , 633 , 783 , 785 和
951 等分子离子峰 , 根据其 MSn 的碎片离子信息结合有关文
献[ 2 , 12 , 13 , 20 , 21]和标样鞣花酸的特征离子峰(图 4), 推断红色
Fig.3　ESI-MS spectra(negative ion)of the extraction of the red pellicle of walnut
1669第 6 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析
Fig.4　(a)HPLC-ESI-MS of standard ellaglic acid in the negative ion mode;
(b)MS2 spectrum of standard ellaglic acid
Table 2　Compound identification of polyphenols from the red pellicle of walnut by HPLC-ESI-MSn
[ M-H] -(m/ z) MS 2 ion s(m/ z) MS3 i ons(m/ z) 组分
481 301 , 275 257 , 229 鞣花酰基葡萄糖
633 301 257 , 229 没食子酰基-鞣花酰基葡萄糖
783 301 , 481 257 , 229 二鞣花酰基葡萄糖
785 301 , 483 , 633 257 , 229 二没食子酰基-鞣花酰基葡萄糖
951 907 783 , 605 , 889 , 481 , 301 鞣花酰基-橡椀酰基葡萄糖
301 257 , 229 鞣花酸
　备注:字体加粗的碎片离子进行M S3 检测。m/ z in bold w as subjected to MS 3 analysis
核桃仁种皮中含有鞣花酸 、 鞣花酰基葡萄糖等鞣花单宁(表
2)。
　　我们也对红色核桃仁种皮的粗提物及其花色苷纯化液在
正离子扫描模式下进行了液质扫描分析 , 获得 m/ z 为 497 ,
817 , 863 等共同的分子离子峰 , 它们与树莓 、洛神葵 、 葡萄 、
红白菜 、胡萝卜 、 红瓤土豆中花色苷的种类均不相同[ 22 , 23] ,
因此对于红色核桃仁种皮中花色苷的结构还有待于进一步的
分析研究。
3　结　论
　　红色核桃仁种皮中含有鞣花酸 、 鞣花酰基葡萄糖 、 没食
子酰基-鞣花酰基葡萄糖 、 二鞣花酰基葡萄糖 、 二没食子酰
基-鞣花酰基葡萄糖和鞣花酰基-橡椀酰基葡萄糖等鞣花单
宁 , 与普通核桃仁相似 , 此外还含有花色苷物质 , 其盐酸乙
醇提取物在 340 , 370 , 552 和 585 nm 处有 4个吸收峰 , 具体
结构还有待于进一步分析研究。
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Analysis of the Extraction of Red Pellicle of Walnut(Juglans regia L.)
by Ultraviolet-Visible Spectra and HPLC-ESI-MSn
WANG Ke-jian1 , 2 , HAO Yan-bin2 , QI Jian-xun2 , HU Xiao-song1＊
1.Co llege of Food Science & Nut ritional Engineering , China Agricultural Univer sity , Beijing　100083 , China
2.Institute o f Fo restry &Pomology , Beijing Academy of Ag riculture and Fo restry Sciences , Beijing　100093 , China
Abstract　The extr action of the red pe llicle of w alnut(J uglans regia L.)w as analy zed by UV-visible spectra and HPLC-ESI-
MSn(high-perfo rmance- liquid-chromatog raphy coupled w ith elec trospray ionization mass spectrome try).The ext raction in e tha-
nol-HCl showed tw o abso rption peaks at 560 and 591 nm respectively in the UV-Vis spectrum;after purified by lead acetate and
thin-laye r-chroma to g raphy , the ex traction in ethanol-HCl show ed 4 abso rption peaks at 340 , 370 , 552 and 585 nm respective ly.
These results te stified tha t the anthocyanin was in the ex traction.Six mo lecular ion peaks (m/ z)occurred on MS:301 , 481 ,
633 , 783 , 785 and 950 , which w as identified as ellagic acid , Hexahydro xydiphenoyl(HHDP)-g luco se , Galloy l-HHDP-g lucose ,
Di-HHDP-g luco se, Di-Galloy l-HHDP-g lucose , and HHDP-Valoneoyl-gluco se respectiv ely.
Keywords　Red Pellicle of w alnut;Ex traction;Ultraviole t-v isible spectra;HPLC-ESI-MSn
(Receiv ed Ma r.2 , 2008;accepted Jun.6 , 2008)　　
＊Co rr esponding author
1671第 6 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析