全 文 ：第 1 2卷 第 2期
20 0 2年 4月
华 中 农 业 大 学 学 报
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a l o fH ua z ho n gA gr i u el tura l U n i v r e si ty
V o l
.
1 2No
.
2
AP r
.
20 0 2
,
18 6~ 188
灰树花多糖的分离 、 纯化与理化性质 ’
李小定 1) 吴谋成” 曾晓波” 荣建华 1) 王仲民“ ,
( 1’ 华中农业大学食品科学与技术系 , 武汉 4 30 7 0 ; “ ,新疆农业大学 ,鸟普木齐 8 3。。52)
摘要 灰树花子实体用热水提取 , 乙醇沉淀 , 透析冻干得灰树花多糖粗品 ,再经 S ve ag 法脱蛋白 , 1〕EA E -
eS p ha de
x A
一
25 柱层析纯化得到 4 种多糖分别为 P G F I 、 PG卜 2 、 P G R 3和 PG F一 4 。 4 种多糖经纸层析 、 S叩 h ad ex
G 20 柱层析及聚丙烯酞胺凝胶电泳分析 ,结果表明都为单一均匀组分 ; P G F一 1经纸层析及气相色谱分析证实
它是一种葡聚糖 ;凝胶渗透色谱测定其分子量为 n 万 。 红外光谱揭示 P G P I 含 汗型糖昔键 。
关键词 灰树花 ; 多糖 ; 分离 ; 纯化 ; 性质
中图法分类号 T S 201 . 2
灰树花 (Gr 或fo al 户二 n d o a ) 又名栗子蘑 、 贝叶
多孔菌 、 云覃和舞茸等 ,是亚热带至温带森林中的一
种大型真菌 。 灰树花分布于河北 、 吉林 、 广西 、 四川
和福建等地 , 是一种新近开发出来的鳝 、 药兼用的药
用真菌 , 肉质柔软 , 口味鲜美 , 营养丰富 ,具独特的香
味 ,被视为珍贵的食用菌 。 在 日本灰树花的消费量
仅次于香菇和金针菇 , 目前在我国的栽培量也成倍
增长 。 根据 A dac hi 和 N a n b a 及劳华均 的研究表
明 ,灰树花多糖具有明显的抗肿瘤 , 改善免疫系统功
能 ,调节 血糖 、 血脂及 胆 固醇水平 , 降血 压等作
用 , 一 3〕。 N an b a 认为在所有真菌生物活性物质中 ,
灰树花多糖的抗肿瘤活性最强 ,而且绝大多数真菌
多糖制剂 口服无效 ,而灰树花多糖例外 。 为了深人
研究灰树花多糖的生理及药理作用 , 探讨灰树花多
糖的构效关系 , 笔者对灰树花多糖的分离纯化及其
理化性质进行了初步研究 。
材料与方法
供试真菌
灰树花子实体 ( G F 一 5 ) 由湖北省黄冈市科委提
试 剂
多糖标准 P ul 如 l a n 为 日本东京化成公司产品 ,
D EA E
一
S e p h a d e x A
一
2弓, S e p h a d e x G 一 2 00 为 P h a r m a -
c ia 产品 ,单糖标准品为进 口或国产生化试剂 ,其它
均为国产分析纯试剂 。
1
.
3 仪 器
I K B
一
2 0 2 3 自动柱层析 , H i t a e h i 2 6 0一 1 0 红外光
谱仪 , S h im a d z u G C 一 g A 气相色谱仪 , W a t e r s 6 0 0 高
效液相色谱仪 , S hi m ad uz U V 一 2 65 紫外可见分光光
度计 。
,
.
4 提 取
灰树花子实体依次经无水 乙醇 、 乙醚回流提取
后 ,再经 10 0 ℃热水提取 3 次 ,合并水提取液 、 浓缩 、
乙醇沉淀 。 沉淀物用 乙醇洗涤 , 热水溶解 ,过滤 、 透
析 ,冷冻干燥得粗多糖 ( P G F ) 。
1
.
5 分离 、纯化
P G F 经 eS va g 法脱蛋 白 , 20 % H Z q 脱色 , 透
析 , 冻干 。 取样 品 2 0 m g 上 D E A E一 S e p h a d e x A 一 2 5
柱 ( 1 . 5 e m X 7 0 e m ) , 分别用水 、 2 m o l / I , 尿素和
Z m ol I/ 尿素 + o . Z m ol I/ 矛 N a CI 阶段洗脱 , 流速
10 m l/ h
, 分部收集洗脱液 (每管 30 im n) ,各管用硫
酸苯酚法检测多糖 。 合并多糖高峰部分 ,浓缩后透
析 ,冻干 ,得 4个多糖级分 。
,
.
6 纯度鉴定
l ) 纸 层 析仁`」。 取 新 华 l 号滤 纸 ( 3 C m 只
2 0 c m )
,距端点 1 c m 处的中部点样 。 展开剂为正丙
醇 , 氨水 , 水 (6 O , 4 , 5) 饱和 Z h , 室温展层 s h,
取出后吹干 , 用 0 . 5% 甲笨胺蓝染色 , 立即用 9 . 5%
乙醇漂洗至背景褪去 。
刁..扒,ó
1.1挂凸以
收稿 11期 : 2。 () l一 1 1一 19
* 湖北省 .` 十五 ” 重点科技攻关计划资助项 1[
李小定 , 男 . 19 6 8 年生 .讲:师 ,在职博 :l 研究件 作单位 : 华中农业大学食品科学与技术系 ,武汉 昭。。 7。
DOI : 10. 13300 /j . cnki . hnl kxb. 2002. 02. 023
第 2 期 李小定等 : 灰树花多糖的分离 、纯化与理化性质
r.L J卜1胜rwe0气0àùIù,乙一l0-
。u曰qóosV。6研到夕汽彭3 ) S e p h a d e x G 一 2 0 0 凝胶柱层析 ( 1 . 5 e m X
7 0 Cm )
。 上样量 10 m g , 洗脱液为 0 . 0 5 m o l / I-
N a C I
,流速 7 m l / h ,每管 3 0 m i n 收集 , 苯酚硫酸法
检测多糖含量 。
4) 聚丙烯酞胺凝胶电泳 。 分离胶浓度为 7 . 5% ,
p H 8
.
9
, 浓缩胶浓度 4% , p H 6 . 8 。 电泳缓冲液为
T r i s
一甘氨酸系统 , p H 8 . 3 。 样品浓度 3 m g /m l ,进
样量 10 0 川 ,管电流 2 m A , 电泳 4 h ,用阿利新蓝对
多糖染色 。
1
.
7 单糖组成分析
1) 气相色谱法困 。 色谱条件 : O V 一 1 7 0 1 石英毛
细管色谱柱 ( 0 . 3 2 m m X 3 O m ) ,柱温 2 3 5 oC ,气化室
温度 2 8 0 0C , N : 为载气 , 流速 50 m l / m i n , F ID 检测
器 。
2 )薄层层析 ( T l 了 C ) 。 取多糖样品 2 0 m g , 加
4 m o l / I
J
H Z S O
; ,
I 0 0 0C 水解 s h , 碳酸钡中和离心 ,
取上清液点样 。 标准单糖与气相色谱法相同 。 用
。 . 03 m ol I/ 才硼酸调制硅胶成糊状 , 平铺在玻璃板上
( 7
.
5 e m X l q
e m )
,
1 1 0 0C 活化 3 h 。 展开剂为正丁
醇 , 乙酸乙醋 , 异丙醇 , 乙醇 : 水 一 7 : 20 : 12 :
7 , 6
,显色剂为苯胺邻苯二 甲酸 。
1
.
8 理化性质测定
取适量样 品进行常规理化性质测定 ,包括溶解
性测定 ,硫酸咔哇反应 ,斐林试剂反应 ,双缩脉反应 ,
碘反应 。
1
.
9 分子量测定
采用 凝胶渗透色谱法 测 定困 。 多糖标准为
P u l l u l a n 系 列 , 色 谱 柱 为 T S K G 5 0 0 0 PW
( 7
.
5 m m 只 3 0 e m , 粒度 1 7 拼m ) , 流动相为 0 . 2
m o l / I
J 磷酸缓 冲液 ( p H 6 . 0 ) , 流速 1 . 0 m l / m i n ,
W
a t e r s 4 10 示差折光检测器 。
2 结果与分析
.2 , 分离与纯化
P G F分别用水 、 2 m ol I/ 尿素和 2 m ol 1/ , 尿素
+ 0
.
2 m o l / I
,
N a C I 在 D E A E 一 S e p h a d e x A 一 2 5 柱上
阶段洗脱可得到 4 种级分 ( 图 l ) , 水洗脱得到的级
分为 P G F 一 1 , 2 m ol I/ 了 尿素洗脱得到 P G F 一 2 和 P G F -
3 两种级分 , 2 m o l / I , 尿素+ Q. 2 m o l / 12 N a C I洗脱
得到 P G F一4 。 当用 2 m ol I/ , 尿素+ 0 . 5 m ol I/ 、 N a CI
和 2 m ol I/ 尿素 十 1 . O m ol I/ N a CI 洗脱时只有蛋
白质峰而无多糖峰 , 这说明虽然用 S e va g 法脱蛋白
10次以上 , 蛋 白质仍未完全脱除 。 P G F一 1一 P G F一4
10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0
管数 uT b e n u m b e r
图 1 PG「在 O EA E一 eS p ha de x A一 25 柱上的流出曲线
F 19
.
1 E lu t im 田 r ve of 户G F m DEAE 一斗 P陌de x
介 25 OC h刀Tl n
的得率分别约为 巧% 、 17 % 、 8%和 13 % 。
.2 2 纯度鉴定
4 种多糖级分经纸层析鉴定均为单一斑点 ,经
S eP h
a d e x G
一
2 0 柱层析法鉴定都为单一对称峰 , 聚
丙烯酞胺凝胶电泳显示为单一谱带 , 表明 4 种级分
都为均一多糖 。
2 3 单糖组成分析
测定 了 P G F 一 1 的单糖组成 。 P G F 一 1 水解物经
气相色谱分析只有 1个色谱峰 ,且其保留时间与标
准单糖中葡萄糖的保留时 间一致 ;在薄层层析中 ,
P G R I 水解物的 R f 与葡萄糖的 R f 相同 , 表明 PG F
一
1 是由葡萄糖组成的葡聚糖 。
.2 4 理化性质
P G F
一
1
、
P G F
一
2 和 P G F 一 3 为白色絮状 , P G F 一 4
为灰白色絮状固体 ,均溶于热水 , 不溶于高浓度的乙
醇 、 乙醚 、丙酮 、 乙 酸乙醋等有机溶剂 , p H 中性 。 4
种多糖与碘化钾反应不显色 ,硫酸咔哇反应及双缩
脉反应为阳性 、 斐林试剂反应为阴性 ,说明 4 种多糖
为非淀粉类酸性多糖 ,含糖醛酸 、 蛋白质 ,不含单糖 。
紫外吸收光谱分析证实 , 4 种多糖都具末端吸收 , 未
发现明显的核酸吸收峰 ( 2 60 一 29 0 n m )及蛋 白质吸
收峰 ( 2 50 一 3 0 n m ) 。 经考马斯亮蓝法检测 , P G F一 1
一 P G F 一 4 的蛋 白质含量分别为 1 . 13 % 、 2 . 25 % 、
4
.
7 3 % 和 8 . 8 6% 。
.2 5 红外光谱
由 P G F一 1 的红外光谱图 (图 2) 可见 ,在 3 3 0 0一
3 6 0 0 e m 一 1 (仔 H ) , 2 8 0 0一 3 0 0 0 e m 一 1 ( C 一 H ) , 1 6 2 0
一 1 6 8 0 c m 一 1 ( C = O )及 1 4 0 0一 1 4 4 0 c m 一 ` ( C一 ( ) )
处有多糖的特征吸收峰 , 1 0 20 一 1 180 c m 一 1处 的 3
个吸收峰表示 P G F 一 1 中的糖环构型为毗喃型 (吠喃
型糖环在此 区间只有 2 个强吸收峰 ) 。 8 90 c m 一` 的
吸收峰 ( p一型毗喃糖的 C 一 H 变角振动 )提示 P G F 一 1
的结构中存在 沙型糖昔键 。
1 8 8华 中 农 业 大 学 学 报 第 21 卷
生长 ,且能促进 C on A 诱导的小鼠淋巴细胞增殖反
应 , 明显增强二硝基氟苯所致小鼠迟发型超敏反应
( D T H )
,显著提高小鼠血清溶血素的活性 ,具有较
强的免疫调节功能 ; P G F 与 4 种多糖级分对经基游
离基及超氧阴离子有很强的抑制作用 , 提示它们具
抗氧化功效 ,对延缓衰老有一定的意义 。
0八Un曰nUQC乙U4,ù
山
l
岁/。u门-一日的`自讲来叼
参 考 文 献
4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 15 0 0
波数 Wa v e n u m be r/ e m 一 ’
10 0 0 6 5 0
图 2 P G F一 1 的红外光谱图
F 19
.
2 IR s Pe c t r助 o f PG F一 l
.2 6 分子最测定
经凝胶渗透色谱法测定 , P G F 一 1 的数均分子量
M n 为 1 1 7 2 6 2 ,重均分子量 M w 为 1 1 8 2 3 8 。 多分散
系数 ( M w / M n) 为 1 . 0 1 , 这也证实了 P G F 一 1 为均一
多糖 。
3 讨 论
作为生物反应调节剂 ,真菌多糖的研究 已引起
人们极大的重视 ,且 已得到丰硕 的成果 , 如香菇多
糖 、 云芝多糖已进入临床应用以治疗癌症 。 另外 ,人
们正在从真菌多糖中寻找治疗艾滋病等抗病毒药和
抗衰老药 。 本研究制备的 P G F 和 P G F一 1 经后期实
验证明 , 经 口服能显著抑制小鼠体内S 一 1 80 肉瘤的
A d a e h i Y
,
O k az
a k i M
,
O h n o N
, e t a l
.
E n h a n e e m e n t o f e y t o k in e
b y m a e r o p ha g es
s t im u la ted w i t h ( l ~ 3 )
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一 g lu ca n
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,
i s o la t e d f or m Gr ifo l
a
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fr o耐 o sa . B io lo g i e a l a nd Ph a r -
m a e e u t l e a l B u lle t i n
,
1 9 94
,
17 ( 1 2 )
:
15 5 4一 1 56 0
N a n b a H
,
H a m a g u e h i A
,
K u r o d a H
.
T h e e h e m i e a l s t r u e t u r e o f
a n t : t u m o r 即 ly s a e e h a r : d e in f r u i t b od i e s o f rG iof l a fr o n d o二
( m a 一t a k e )
. 〔二h e m i e a l a n d P h a r m a e e u t i e a l B u lle t : n , 19 8 7 , 35 ( 3 ) :
1 1 6 2~ 1 16 8
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ofI s o l a t i o n
,
P u r i if c a t i o n a n d C h a ar e t e r i z a t io n
P o l y s a c c h a r i d e s fr o m G r i fo l
a
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I
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1 X ia o d i n g
` ’
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R o n g J ia n h u a
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( 1 ) H
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刀 e r 、 i t夕 , W山h a n 4 30 0 7 0
2 ) X i彬 ia n g A g r i e u l t u ar l nU i v e r s i z夕 , W女l u m u g i 8 3 0 0 5 2
W
a n g Zh o n g m i n
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A b s t r a e t 飞’ h e p o ly s a e e h a r id e f r a e t i o n ( P G F ) f r o rn rG i f b l a f r o n d o 、 a w a s p r e p a r e d w i t h h o t w a t e r
e x t r a e t i o n
, 。 t h a n o l p r e e ip i t a t io n , d ia ly z a t i。 。 。 g a i n s t w a t e r a n d ly o p h i一i z a t i o n . F o u r k i n d s `俞 p o ly s a e e h a -
r id e s
,
P G F
一
1
,
P G F
一
2
,
P G F
一
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一
4
,
w e r e p u r i f i e d f r o rn P G F b y d e p r o t e i n w i t h S e v a g m e t h o d a n d
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一
S e p h a d e x A
一
2 5 e h r o m a t o g r a P h y
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一
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r a p h y
,
S e p h a d e x G
一
2 0 0 e h r o m a t o g r a p h y a n d p o l y a e r y l a m id e g e l e l e e t r o p h o r e s i s a n a ly s i s
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.
IR s p e e t r u m o f
p G F
一
1 r e v e a l e d t h a t i t e o n t a in e d 俘一 g l u e o s id i e b o n d s .
K ey w o川 5 G r i f b l a fr o n d o s a , p o l y s a e e h a r id e , i s o la t i o n , p u r i f i e a t io n , e h a r a e t e r i z a t io n
(责任编辑 : 陈红叶 )