全 文 ：复方黑参颗粒 HPLC指纹图谱研究
贺康洪①，张广春①，李 阳①，孙大鹏②
［摘 要］ 目的 建立复方黑参颗粒的 HPLC指纹图谱。方法 采用 DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;
流动相:乙腈与 0． 05 %三乙胺水溶液(用甲酸调 pH至 3． 0)梯度洗脱，流速:1． 0 ml·min －1;检测波长:280 nm;柱温:30 ℃。结
果 建立了复方黑参颗粒的 HPLC 指纹图谱，其精密度、重复性、稳定性试验中共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD
均小于 3%，标出了 17 个共有峰，相似度计算发现 12 批样品指纹图谱相似度均大于 0． 96。结论 该方法简便、准确，重复性
好，可用于复方黑参颗粒的质量控制。
［关键词］ 复方黑参颗粒;指纹图谱;HPLC
［中图分类号］ ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-9926(2013)3-0216-5
［DOI］ 10． 3969 / j． issn． 1008-9926． 2013． 03． 010
Study on HPLC Fingerprint of Compound Heishen Granules
HE Kang-hong①，ZHANG Guang-chun①，LI Yang①，SUN Da-peng②
①Institute for Drug and Instrument Control of Shenyang Military Region，Shenyang 110026，China;
②Out-Patient Department of Shenyang Military Region Headquarters，Shenyang 110000，China
［Abstract］ Objective To study the HPLC fingerprint of compound Heishen granules． Methods DiamonsilTM
C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm)column was adopted with the mobile phase consisting of acetonitrile and 0． 05% tri-
ethy lamine (pH was adjusted to 3． 0 with formic acid)． Gradient elution was performed at the flow-rate of 1． 0
ml·min －1 ． The detection wavelength was set at 280 nm and the column temperature at 30 ℃ ． Results An HPLC fin-
gerprint of compound Heishen granules was established． The RSD values of the relative peak area and relative reten-
tion time of common peaks in precision，repeatability and stability tests were less than 3% ． 17 characteristic peaks
were established in the fingerprint． The degree of similarity of 12 samples was more than 0． 96． Conclusion This
method is simple，practical and reliable，which can be used for quality control of compound Heisen granueles．
［Key words］ Compound Heishen granules;fingerprint;HPLC
复方黑参颗粒是沈阳军区某医院根据多年临床
实践总结的有效方剂，特别是治疗地域性上呼吸道疾
病有特殊疗效。由玄参、射干、北豆根、麦冬、天冬 5
味中药组成，以玄参、射干相伍为君药，北豆根为臣
药，麦冬、天冬为佐药。制备工艺为将五味中药加水
煎煮提取、浓缩，加入适量糊精和矫味剂制成的无糖
型颗粒剂。近年来有方中各味药材含量测定和药材
指纹图谱研究的文献［1-7］报道，但是只对其中的药
材和单一性指标成分的含量测定，难以反映制剂的整
体质量，而指纹图谱具有系统性、特征性和重现性特
点，能较全面地反映中药质量［8］。本文对该制剂进行
指纹图谱研究，旨在为系统、完整地反映药品内在质
作者简介:贺康洪，在读硕士，研究方向:药物分析。Tel: (024)
28869580;E-mail:hekanghong@ yeah． net
作者单位:① 110026，辽宁沈阳，沈阳军区联勤部药品仪器检验所;
② 110000 辽宁沈阳，沈阳军区司令部门诊部
量，全面提高该制剂质量水平提供依据和参考。
1 材料
1． 1 仪器 Agilent1100 型高效液相色谱仪(紫外
检测器，四元泵，在线脱气，自动进样) ，Chemistation
system工作站(美国安捷伦公司)。
1． 2 试药 射干苷对照品(批号:111632-200501) ，
肉桂酸对照品(批号:0786-9802) ，次野鸢尾黄素对
照品(批号:111557-200602) ，蝙蝠葛碱对照品(批
号:111867-201001)均购自中国药品生物制品检定
所;蝙蝠葛苏林碱对照品(纯度 98． 0%以上，黑龙江
省药检所实验室制) ;复方黑参颗粒(购自沈阳军区
某医院，批号见表 1) ;甲醇、乙腈为色谱纯，三乙胺、
甲酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2 ． 1 条件色谱 色谱柱:DiamonsilTM C18色谱柱
·612· 解放军药学学报 2013 年 6 月 20 日 第 29 卷 第 3 期 Pharm J Chin PLA，Vol． 29，No． 3，Jun 20，2013
表 1 复方黑参颗粒样品表
样品号 批号 样品号 批号
1 20110220 7 20111112
2 20110226 8 20111122
3 20110228 9 20111205
4 20110531 10 20111213
5 20110819 11 20111221
6 20110919 12 20111228
(250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ，流动相:乙腈(A)、
0． 05 %三乙胺水溶液用甲酸调 pH至 3． 0(B) ，梯度
洗脱，柱温:30 ℃，检测波长:280 nm，流速:1． 0
ml·min －1，分析时间:43 min，进样量:20 μl。梯度洗
脱程序见表 2。
表 2 流动相梯度洗脱程序
时间 /min A /% B /%
0 5 95
10 15 85
20 25 75
25 30 70
30 45 55
40 60 40
43 80 20
2． 2 溶液的制备 (1)供试品溶液 取复方黑参
颗粒约 2． 0 g，精密称定，置 50 ml 具塞锥形瓶中，精
密加入 70%甲醇 40 ml浸泡 30 min，称定质量，超声
处理 30 min，放冷，用 70%甲醇补足减失的质量，滤
过，取续滤液用 0． 45 μm 滤膜滤过即得。(2)对照
品溶液 精密称取肉桂酸、次野鸢尾黄素、射干苷、
蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱对照品适量，加甲醇溶解并
稀释至刻度，摇匀，得含蝙蝠葛碱 44． 24 μg·ml －1、
蝙蝠葛苏林碱 56 μg·ml －1、射干苷 660 μg·ml －1、肉
桂酸 38 μg·ml －1和次野鸢尾黄素 2． 18 μg·ml －1的
混合对照品溶液。
2． 3 指纹图谱的建立 分别取 12 批样品，按 2． 2
项下制备供试品溶液，按 2． 1 项下方法测定并记录
90 min 色谱图，结果所有色谱峰集中在 40 min 内，
比较 12 批样品色谱图，确定了 17 个共有峰，共有峰
总面积占总峰面积的 90%以上，分别见图 1、2。经
与对照品图谱比对，确认 7 号峰为蝙蝠葛苏林碱、9
号峰为蝙蝠葛碱、10 号峰为射干苷、14 号峰为肉桂
酸、17 号峰为次野鸢尾黄素。由于 10 号峰射干苷
保留时间适中，峰面积最大，又为制剂中的主要活性
成分［9］，因此选择其为内参比峰。计算各共有峰保
留时间和峰面积相当于内参比峰保留时间和峰面积
的比值，结果见表 3、4。
2． 4 精密度试验 取同一供试品溶液(批号:
20111112) ，连续进样 6 次，按 2． 1 色谱条件进行测
定，结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的
RSD均小于 3%，表明仪器的精密度良好。
2． 5 重复性试验 取同一批样品 (批号:
20111112) ，按 2． 2 法制备 6 份供试品溶液，按 2． 1
色谱条件进行测定，结果各共有峰相对保留时间的
RSD小于 3%，相对峰面积的 RSD 小于 5%，表明方
法的重复性良好。
2． 6 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号:
20111112) ，分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 进样分析
(进样间隔密封，室温保存) ，按 2． 1 色谱条件进行
测定，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的
RSD均小于 3%，表明供试品溶液在常温 24 h 内稳
定。
2． 7 样品相似度计算 将 12 批复方黑参颗粒色
谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹
图谱相似度评价系统(2009 年版)”，选取“时间
窗”宽度为 0． 1 min，经多点校正和数据匹配生成
制剂的色谱指纹图谱共有模式(见图 3)。对 12 批
样品的指纹图谱进行相似度分析，相似度计算结
果见表 5。
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表 3 12 批样品相对保留时间(min)
共有峰
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 0． 294 0． 294 0． 296 0． 294 0． 295 0． 294 0． 294 0． 295 0． 294 0． 294 0． 294 0． 294
2 0． 376 0． 375 0． 377 0． 376 0． 376 0． 375 0． 376 0． 376 0． 376 0． 376 0． 376 0． 376
3 0． 480 0． 478 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480 0． 480
4 0． 596 0． 596 0． 597 0． 597 0． 596 0． 596 0． 597 0． 596 0． 596 0． 596 0． 597 0． 596
5 0． 737 0． 737 0． 738 0． 737 0． 737 0． 737 0． 737 0． 737 0． 737 0． 737 0． 737 0． 736
6 0． 803 0． 803 0． 804 0． 803 0． 803 0． 803 0． 803 0． 803 0． 803 0． 803 0． 803 0． 802
7 0． 847 0． 847 0． 848 0． 847 0． 846 0． 847 0． 847 0． 846 0． 846 0． 846 0． 847 0． 846
8 0． 891 0． 891 0． 892 0． 891 0． 891 0． 891 0． 890 0． 890 0． 890 0． 890 0． 890 0． 890
9 0． 964 0． 964 0． 965 0． 964 0． 964 0． 964 0． 964 0． 964 0． 964 0． 964 0． 953 0． 964
10(s) 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000
11 1． 023 1． 023 1． 022 1． 022 1． 023 1． 023 1． 023 1． 023 1． 023 1． 023 1． 022 1． 022
12 1． 077 1． 077 1． 076 1． 076 1． 077 1． 077 1． 076 1． 076 1． 077 1． 076 1． 076 1． 075
13 1． 265 1． 265 1． 266 1． 265 1． 266 1． 265 1． 265 1． 266 1． 268 1． 263 1． 263 1． 263
14 1． 364 1． 363 1． 366 1． 364 1． 364 1． 363 1． 364 1． 365 1． 364 1． 362 1． 364 1． 364
15 1． 437 1． 437 1． 439 1． 438 1． 438 1． 436 1． 437 1． 439 1． 435 1． 437 1． 437 1． 437
16 1． 468 1． 469 1． 471 1． 470 1． 470 1． 469 1． 470 1． 471 1． 469 1． 469 1． 469 1． 469
17 1． 607 1． 607 1． 610 1． 608 1． 609 1． 607 1． 608 1． 609 1． 607 1． 606 1． 607 1． 607
注:s为内比参峰。
3 复方黑参颗粒药材与制剂指纹图谱相关性分析
为了体现制剂中各药材的物质响应，确认共有峰
的来源和归属，进行药材与制剂指纹图谱相关性分析。
3． 1 药材供试液的制备 按处方量 1 /10 分别称取
处方中 5 味药材，以 100 ml 水浸泡 12 h，回流提取
2 h，滤过;残渣再加入 100 ml水，继续回流提取1 h，
滤过，再依法煎煮 1 次。合并煎液，浓缩。用
0． 45 μm微孔滤膜滤过，即得药材供试品溶液。
3． 2 各药材阴性溶液的制备 按处方量 1 /10 分别
称取处方中除玄参外 4 味药材(除射干外的 4 味药
材，除北豆根外的 4 味药材，除麦冬外的 4 味药材，
除天冬外的 4 味药材) ，以 100 ml水浸泡 12 h，回流
提取 2 h，滤过;残渣再加入 100 ml 水，继续回流提
取 1 h，滤过，再依法煎煮 1 次。合并煎液，浓缩。用
0． 45 μm微孔滤膜滤过，即得玄参阴性供试品溶液
(射干阴性供试品溶液、北豆根阴性供试品溶液、麦
冬阴性供试品溶液、天冬阴性供试品溶液)。
表 4 12 批样品相对峰面积
共有峰
样品号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 0． 178 0． 173 0． 188 0． 180 0． 178 0． 157 0． 129 0． 143 0． 131 0． 128 0． 128 0． 127
2 0． 410 0． 340 0． 426 0． 408 0． 400 0． 360 0． 128 0． 299 0． 298 0． 301 0． 300 0． 301
3 0． 128 0． 129 0． 184 0． 182 0． 222 0． 094 0． 122 0． 127 0． 125 0． 124 0． 123 0． 121
4 0． 159 0． 156 0． 184 0． 157 0． 168 0． 115 0． 185 0． 199 0． 190 0． 188 0． 188 0． 180
5 0． 312 0． 312 0． 318 0． 317 0． 312 0． 286 0． 325 0． 328 0． 326 0． 326 0． 326 0． 324
6 0． 231 0． 229 0． 233 0． 231 0． 229 0． 204 0． 215 0． 217 0． 216 0． 218 0． 218 0． 217
7 0． 140 0． 140 0． 138 0． 142 0． 140 0． 126 0． 166 0． 166 0． 169 0． 170 0． 167 0． 167
8 0． 542 0． 541 0． 556 0． 548 0． 542 0． 525 0． 514 0． 523 0． 518 0． 521 0． 518 0． 517
9 0． 235 0． 236 0． 241 0． 241 0． 234 0． 181 0． 188 0． 189 0． 189 0． 194 0． 190 0． 189
10(s) 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000
11 0． 249 0． 248 0． 250 0． 248 0． 249 0． 240 0． 241 0． 247 0． 245 0． 246 0． 243 0． 242
12 0． 253 0． 253 0． 255 0． 247 0． 253 0． 248 0． 285 0． 290 0． 288 0． 290 0． 289 0． 287
13 0． 099 0． 099 0． 100 0． 100 0． 100 0． 102 0． 112 0． 116 0． 114 0． 118 0． 118 0． 118
14 0． 109 0． 120 0． 108 0． 098 0． 108 0． 120 0． 128 0． 133 0． 132 0． 134 0． 133 0． 132
15 0． 182 0． 188 0． 176 0． 183 0． 181 0． 200 0． 166 0． 169 0． 170 0． 172 0． 170 0． 169
16 0． 078 0． 082 0． 077 0． 078 0． 076 0． 107 0． 098 0． 130 0． 103 0． 111 0． 109 0． 107
17 0． 026 0． 028 0． 027 0． 029 0． 027 0． 032 0． 047 0． 059 0． 054 0． 063 0． 060 0． 058
注:s为内比参峰。
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图 3 12 批复方黑参颗粒 HPLC指纹图谱共有模式图
表 5 12 批复方黑参颗粒指纹图谱相似度计算数据
批号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 对照指纹图谱
S1 1 0． 996 0． 996 0． 996 0． 995 0． 984 0． 969 0． 969 0． 968 0． 964 0． 965 0． 969 0． 988
S2 0． 996 1 0． 992 0． 993 0． 993 0． 987 0． 975 0． 973 0． 974 0． 968 0． 969 0． 972 0． 99
S3 0． 996 0． 992 1 0． 999 0． 997 0． 979 0． 965 0． 965 0． 965 0． 96 0． 961 0． 965 0． 985
S4 0． 996 0． 993 0． 999 1 0． 998 0． 979 0． 967 0． 966 0． 966 0． 961 0． 963 0． 967 0． 986
S5 0． 995 0． 993 0． 997 0． 998 1 0． 981 0． 966 0． 964 0． 966 0． 959 0． 961 0． 965 0． 985
S6 0． 984 0． 987 0． 979 0． 979 0． 981 1 0． 97 0． 97 0． 969 0． 965 0． 967 0． 969 0． 984
S7 0． 969 0． 975 0． 965 0． 967 0． 966 0． 97 1 0． 997 0． 998 0． 993 0． 997 0． 996 0． 994
S8 0． 969 0． 973 0． 965 0． 966 0． 964 0． 97 0． 997 1 0． 997 0． 995 0． 998 0． 998 0． 994
S9 0． 968 0． 974 0． 965 0． 966 0． 966 0． 969 0． 998 0． 997 1 0． 993 0． 996 0． 997 0． 994
S10 0． 964 0． 968 0． 96 0． 961 0． 959 0． 965 0． 993 0． 995 0． 993 1 0． 996 0． 997 0． 991
S11 0． 965 0． 969 0． 961 0． 963 0． 961 0． 967 0． 997 0． 998 0． 996 0． 996 1 0． 998 0． 993
S12 0． 969 0． 972 0． 965 0． 967 0． 965 0． 969 0． 996 0． 998 0． 997 0． 997 0． 998 1 0． 994
对照指纹图谱 0． 988 0． 990 0． 985 0． 986 0． 985 0． 984 0． 994 0． 994 0． 994 0． 991 0． 993 0． 994 1
3． 3 色谱条件与测定 色谱条件均与复方黑参颗
粒指纹图谱条件保持一致。分别精密吸取药材供试
液和各阴性药材液 20 μl，注入液相色谱仪，记录 43
min的色谱图，对其数据进行积分处理，即得。
3． 4 特征峰的归属分析 通过将指纹图谱生成的
对照谱图与复方黑参颗粒、药材供试液和各阴性
药材液相关性考察图 (图 4)比较，不同供试液色
谱图存在一定的保留时间漂移，但结合各指标峰
的紫外吸收，初步认为复方黑参颗粒、药材供试液
和各阴性药材液指纹图谱特征峰存在以下的相关
关系，见表 6。
注:1:药材供试液;2:复方黑参颗粒;3:天冬阴性液;4:麦冬阴性液;
5:北豆根阴性液;6:射干阴性液;7:玄参阴性液
图 4 复方黑参颗粒 药材供试液和各药材阴性液相关性考察图
·912·解放军药学学报 2013 年 6 月 20 日 第 29 卷 第 3 期 Pharm J Chin PLA，Vol． 29，No． 3，Jun 20，2013
表 6 复方黑参颗粒 药材供试液和各药材阴性相关性分析表
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
药材供试液 + + + + + + + + + + + + + + + + +
复方黑参颗粒 + + + + + + + + + + + + + + + + +
玄参阴性液 + + + + + + + + + +
射干阴性液 + + + + + + + + + + + + +
北豆根阴性液 + + + + + + + + + + +
麦冬阴性液 + + + + + + + + + + + + + + + + +
天冬阴性液 + + + + + + + + + + + + + + + + +
注:+表示其特征峰呈阳性特征。
4 讨论
12 批复方黑参颗粒指纹图谱相似度评价结果
表明，12 批样品相似度大于 0． 96，其中 6 批样品相
似度大于 0． 99，从色谱峰的相对峰面积得知，贮存
时间超过 6 个月的样品色谱峰面积减小，6 个月后
变化不明显。
通过制剂-药材相关性分析，制剂与药材色谱有
较好的相关性，复方黑参颗粒指纹图谱中的特征峰
均存在于药材供试液中。通过各阴性液与药材和制
剂指纹图谱峰的变化情况得知 1、2、3、5、6、13、14 号
色谱峰为玄参中的成分，10、11、12、17 号色谱峰为
射干中的成分，4、7、8、9、15、16 号色谱峰为北豆根
中的成分。图谱中无麦冬和天冬的色谱峰，因为麦
冬和天冬中的主要成分为氨基酸和多糖类化合物，
单波长紫外检测器无法检测到。
4． 1 流动相的选择 考察了甲醇-水溶液、乙腈-
0． 1%甲酸水、乙腈-0． 05%甲酸水和乙腈-0． 05%
三乙胺溶液用甲酸调 pH 值至 3． 0 作为流动相。结
果显示乙腈-0． 05%三乙胺溶液用甲酸调 pH 值至
3． 0 可以使各色谱峰分离效果好，峰型佳，保留时间
合适，故选用乙腈-体积分数为 0． 05%三乙胺溶液用
甲酸调 pH值至 3． 0 作为流动相。
4． 2 检测波长的选择 考察了 210、220、230、240、
250、260、266、278、280 nm 检测波长的色谱图，结果
表明 280 nm处色谱图特征性强，信息量大，各成分
的响应值较为均匀，具有良好的代表性，因此选择
280 nm作为检测波长。
4． 3 供试品溶液制备方法的考察 以色谱峰的数
量和峰面积大小为考察指标，采用单因素循环法分
别考察了不同提取方法(回流和超声)、不同提取溶
剂(水、甲醇、乙醇)、不同比例的甲醇-水溶液(体积
分数为 30 %、50 %、70%、90%甲醇水)、不同浸泡
时间(10、20、30 min)不同超声提取时间(15、30、45
min)的提取效率，选择提取效率最佳的体积分数为
70%甲醇浸泡 30 min，超声提取 30 min。
未将玄参中的哈巴苷和哈巴俄苷作为成分指
标，是由于哈巴苷等环烯醚萜类紫外吸收较弱，在梯
度条件下易受基线飘移的影响［10］;而且哈巴俄苷不
稳定，在炮制过程中易向肉桂酸转化［11］。
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(收稿日期:2012-07-24;修回日期:2012-11-27)
(本文编辑 狄亚敏)
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