全 文 ：食用菌学报 2010.17(4):48 ～ 51
收稿日期:2010-10-22 原稿;2010-11-30 修改稿
基金项目:重庆市科技创新能力建设项目(编号:CSTC , 2009CB1010)的部分研究内容
作者简介:乔彦茹(1982-),女 , 西南大学在读硕士 ,主要从事灰树花多糖的分离纯化和免疫活性研究。
＊本文通讯作者　E-mail:zhouchangyan@saas.sh.cn
文章编号:1005-9873(2010)04-0048-04
灰树花多糖 GFP75-2-2B的分离及其对刺激
巨噬细胞释放 NO的影响
乔彦茹1 , 2 , 罗永煌1 , 周　帅2 , 杨　焱2 , 贾　薇2 , 唐庆九2 , 刘艳芳2 , 张劲松2 , 周昌艳2﹡
(1西南大学药学院 , 重庆 400716;2国家食用菌工程技术研究中心 , 农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室 ,
上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海市农业科学院食用菌研究所 ,上海 201106)
摘　要:利用 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析和Sephacryl凝胶柱层析对灰树花(Grifola frondosa)子
实体水提醇沉粗多糖进行分离纯化 , 对分离纯化到的一种多糖 GFP75-2-2B 进行了分析。紫外光谱鉴定结果
表明 , GFP75-2-2B不含蛋白质 、核酸和酚类成分;离子色谱分析表明其单糖组成为岩藻糖 、鼠李糖 、半乳糖 、葡
萄糖和甘露糖 , 摩尔比为 1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5。GFP75-2-2B对巨噬细胞株 RAW264.7 进行体外免疫活性
的研究结果表明 , GFP75-2-2B有明显刺激巨噬细胞分泌 NO 的活性。
关键词:灰树花;多糖;分离纯化;巨噬细胞;NO
　　灰树花(Gri fola f rondosa)是担子菌亚门 、
层菌纲 、无隔担子菌亚纲 、非褶菌目 、多孔菌属中
的一种大型珍稀食药用真菌 , 具有显著的抗癌 、
保肝 、降血压 、提高免疫力等诸多药理活性[ 1 ～ 4] 。
目前 ,已有多种以灰树花为原料的保健品和药品
上市销售 ,如保健品保利生胶囊 、Maiex t 、Grif ron
和药品麦特消。笔者从灰树花子实体中分离纯
化得到一种小分子量多糖 GFP75-2-2B ,运用紫
外扫描 、离子色谱等方法对该化合物的结构进行
初步鉴定 , 并研究了其在体外刺激巨噬细胞
RAW264.7分泌 NO的活性 ,以期为灰树花多糖
的开发应用提供参考。
1　材料与方法
1.1 材料
　　灰树花(G.f rondosa)子实体购于浙江方格
药业有限公司。标本存放于上海市农业科学院
食用菌研究所药用真菌研究室 。RAW264.7 巨
噬细胞株购于中科院细胞所 。
1.2 试剂
　　细菌脂多糖(lipopo lysaccharide , LPS)为
Sigma公司产品;青霉素 、链霉素为 Amresco 公
司产品;DMEM 培养基 、RPM I-1640培养基 、胎
牛血清(Fetal bovine serum , FBS)为 Gibco 公司
产品;DEA E-Sepharose Fast F low 、Sephacry l S-
400和Sephacry l S-100填料为 GE公司产品。其
它试剂均为国产分析纯 。
1.3 体外刺激 RAW264.7释放 NO试验
1.3.1 RAW264.7巨噬细胞的培养
　　用 DMEM 完全培养基在 37 ℃、含 5%CO 2
条件下传代培养后 ,用 0.05%胰酶溶液消化 ,混
悬液于 1 500 g 离心 3 min ,收集细胞 , 用无色
RPM I-1640 培养基将细胞稀释至 106个/mL
备用[ 5] 。
1.3.2 巨噬细胞释放 NO 产量的测定
　　在无菌条件下将样品用 PBS(含 0.14 mol/L
NaCl , 0.0027 mol/ L KC l , 0.004 mol/L
Na2HPO 4 , 0.002 mol/ L KH 2 PO 4 , pH 7.4)溶
解并稀释成不同浓度的溶液 。将细胞悬液加入
96孔板 ,每孔180μL ,然后加入20 μL待测样品 ,
每个样品设置 3个复孔 ,以 LPS (1μg/mL)为阳
性对照 ,PBS 为阴性对照 , 37 ℃, 5%CO2条件下
培养 24 h ,按文献[ 5] 的方法测定巨噬细胞释放
NO 的产量。
1.4 GFP75-2-2B的分离纯化
　　称取 1 kg 灰树花子实体于 30 L蒸馏水中浸
泡 1 h后 100 ℃提取 2 h ,过滤 ,滤渣重复上述操
作 2次 ,合并提取液 ,加热浓缩至 2 L ,向浓缩液
中加无水乙醇至醇浓度 50%,静置过夜 ,取上清 ,
向上清中继续加无水乙醇至浓度为 75%,静置过
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2010.04.007
第 4 期 乔彦茹 ,等:灰树花多糖 GFP75-2-2B 的分离及其对刺激巨噬细胞释放 NO 的影响
夜 ,3 450 g 离心 20 m in ,收集沉淀 ,水浴挥去乙
醇 ,冷冻干燥后得粗多糖 , 命名为 GFP75。将
GFP75上阴离子交换柱和凝胶柱层析 ,按 1.3中
的方法测定各分离组分的体外免疫活性 ,选择活
性好的组分之一进行下一步分离 , 最终得
GFP75-2-2B(图 1)。
图 1　GFP75-2-2B分离纯化流程图
Fig.1　Fractionation procedure for GFP75-2-2B
　　阴离子交换柱层析:用蒸馏水将GFP75配制
成 30 mg/mL 的溶液 , 18 000 g 离心 20 min ,取
40 mL 上清液 , Amersham Bioscience 的 KTA
prime 层析系统进行 DEAE-Sepharose Fast F low
阴离子交换柱层析(26 mm ×100 cm), 用0 ～ 2
mol/L 的 N aCl 梯度洗脱 , 流速 4 mL/min , 15
mL/管分部收集 ,苯酚-硫酸法[ 6] 检测糖峰 ,合并
收集主峰 ,减压浓缩 ,脱盐 ,冷冻干燥 。
凝胶柱层析:用蒸馏水将 GFP75-2 配成
10 mg/mL溶液 ,Amersham Bioscience 的FPLC层析
系统进行Sephacryl S-400凝胶柱层析(26 mm×100
cm),用蒸馏水洗脱 ,流速1 mL/min ,10 mL/管分部
收集 ,RID-10A 示差折光检测器检测 ,合并收集第
三 、第四主峰(GFP75-2-2),浓缩至 15 mL ,取 1 mL
进行Sephacryl S-100凝胶柱层析(16 mm×100 cm)。
合并收集第二个单峰 ,减压浓缩后冷冻干燥得
GFP75-2-2B ,GFP75-2-2B再经Sephacryl S-100凝胶
柱进行纯度检验。
1.5 GFP75-2-2B紫外光谱鉴定
　　用蒸馏水将 GFP75-2-2B配成 1 mg/mL 溶
液 ,在 200 ～ 400 nm 处进行紫外扫描(Syne rgy
H T 多功能酶标仪 ,Bio-Tek公司)。
1.6 单糖组成分析
　　称取 2 mg GFP75-2-2B 样品 , 加入 3 mL
2 mo l/L的三氟乙酸 ,于 110 ℃水解 3 h 后 ,转入
锲形瓶中 ,于旋转蒸发仪上(40 ℃)减压蒸干 ,再
加 3 mL 甲醇减压浓缩挥尽残留的三氟乙酸 ,用
1 mL去离子水溶解后进行离子色谱分析(Dionex
ICS 2500 ,Dionex 公司)。以标准单糖为参考 ,分
离柱:保护柱 CarboPacTMPA20(3 mm ×30
mm), 分析柱 CarboPacTMPA20(3 mm ×150
mm);脉冲安培检测器检测 ,流动相为 A 相:去离
子水 , B 相:0.25 mol/ L N aOH , C 相 :1 mol/L
NaAc;流速 0.45 mL/min ,洗脱程序与工作参数
见参考文献[ 7] 。
2　结果分析
2.1 GFP75-2-2B的分离纯化
　　GFP75-2-2 经 Sephacry l S-100 柱层析后得
到两个完全分离的对称峰 ,第二峰 GFP75-2-2B
再次经 Sephacry l S-100柱层析检测为一对称单
峰(图 2),该单峰位于 150 mL 处 ,在Sephacry l S-
100的有效分离范围内 , 表明 GFP75-2-2B 为相
对均匀的小分子量组分 (<8 000 Da)。
2.2 紫外光谱鉴定结果
　　200 ～ 400 nm 处进行紫外扫描 ,结果显示 ,在
280 nm 和 254 nm 附近无明显特征吸收峰 ,说明
不含蛋白质和核酸 ,也不含酚类成分 。
2.3 单糖组成
　　离子色谱分析结果表明 , GFP75-2-2B 主要
由岩藻糖 、鼠李糖 、半乳糖 、葡萄糖和甘露糖组
成 ,其摩尔比为 1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5。
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食　用　菌　学　报 第 17 卷
图 2　GFP75-2-2B的 Sephacryl S-100 凝胶柱层析
Fig.2　Sephacryl S-100 column chromatography
of fraction GFP75-2-2B
2.4 体外刺激 RAW264.7 巨噬细胞分泌 NO的
试验结果
　　将 GFP75-2 和 GFP75-2-2B 用 PBS 配成
0.2 、0.5 、1.0 mg/mL 的溶液(作用细胞的终浓度
为 20 、50 、100 μg/mL)进行体外刺激巨噬细胞分
泌 NO 的实验 ,结果表明 GFP75-2-2B具有明显
的促进巨噬细胞株RAW264.7分泌NO 的能力 ,
在低浓度 20 μg/mL 时就表现出良好的刺激作
用 ,并且随着 GFP75-2-2B浓度的增加刺激作用
逐渐升高 ,当浓度为 50 μg/mL 和阳性对照 LPS
活性相当(图 3),与相同浓度的 GFP75-2溶液相
比 ,GFP75-2-2B的免疫活性显著增强。
　　　　　PBS:磷酸缓冲液为阴性对照;LPS:细菌脂多糖为阳性对照
PBS:phosplate buff er , negativ e con tr ol;LPS:lipopolysacch ar ide , pos itive cont rol
图 3　GFP75-2-2B刺激 RAW264.7 巨噬细胞分泌 NO的活性
Fig.3　Effect of GFP75-2-2B on NO release from RAW264.7 cells
3　讨论
　　灰树花子实体中含有蛋白质 、核酸 、多糖等
多种活性成分 ,本研究利用热水提取乙醇分级沉
淀的方法去除了灰树花子实体中的小分子物质
和部分核酸 、蛋白质等大分子物质 ,经离子交换
柱和凝胶柱层析得到组分相对均匀的灰树花多
糖 GFP75-2-2B并对其结构和活性进行了初步研
究 ,分离过程中得到的其它组分将另文报道 。
在免疫系统中 ,巨噬细胞通过吞噬侵入体内
的有害物质 、提呈抗原和分泌细胞因子等途径发
挥防御和调节功能 。NO 的分泌能够增强巨噬细
胞对病原微生物 、肿瘤细胞等有害物质的作用 ,
是巨噬细胞活化的主要特征之一。有研究表明 ,
多糖的免疫调节作用和活化巨噬细胞有密切联
系[ 8] 。本研究中 ,灰树花多糖 GFP75-2-2B 能够
促进巨噬细胞株 RAW264.7分泌 NO ,在低浓度
时就表现出良好的刺激作用 ,可见活化巨噬细胞
是灰树花多糖发挥免疫调节作用的途径之一。
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[本文编辑] 　朱丽娜
Isolat ion and Purification of GFP75-2-2B , a
Polysaccharide from Grifola frondosa Fruit Bodies , and
its Effect on Nitric Oxide Release f rom Macrophages
QIAO Yanru
1 , 2 , LUO Yonghuang1 , ZHOU Shuai2 , YANG Yan2 , JIA Wei2 ,
TANG Qingj iu
2 , LIU Yanf ang2 , ZHANG Jingsong2 , ZHOU Changyan2＊
(1College of Pharmaceutical Sciences , Southwest University , Chongqing 400716;2National Engineer ing Research
Center of Edible Fungi;Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization , Ministr y of Agricultur e;
Key Laboratory of Agricultur al Genetics and Breeding of Shanghai;Institute of Edible Fungi , Shanghai Academy
of Agricultur al Sciences , Shanghai 201106 , China)
Abstract:A wa ter-soluble , crude polysacchar ide pr epar ation was obta ined from Grifola frondosa f r uit bodies
by hot water (100 ℃) extrac tion followed by ethanol (75%)precipitation.A pur if ied polysaccharide ,
GFP75-2-2B, was obta ined f rom the crude mater ial by successive fr actionation using DEAE-Sepharose Fast
Flow ion exchange chroma tography and Sephacryl S gel filtr ation chroma tography.UV spectroscopy detected
no protein or nucle ic acid in GFP75-2-2B , which consisted of fucose , r hamnose , galac tose , glucose and
mannose in the molecular r atios of 1.0∶1.3∶3.6∶4.0∶4.5.GFP75-2-2B significantly enhanced the release of
NO from RAW264.7 macrophages.
Key words:Grifola frondosa ;polysacchar ide;isolation and pur if ica tion;macrophage;NO
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