全 文 ：浙江中医药大学学报 2014年 5月第 38卷第 5期
JO
U
RN
AL
O
F
ZH
EJIAN
G
CH
IN
ESE
M
ED
ICAL
U
N
IVERSITY
VO
L.
38
N
O
.5
M
ay.
2014
实
验
研
究
山核桃(Carya Cathayensis Sarg.)属胡桃科、胡桃
属植物，主要分布在我国浙江临安、皖南山区和皖西
大别山部分地区,是浙江山区重要的经济树种，通常
人们将其作为干果和油料作物进行研究，在民间已
有较长的药用历史。据《本草纲目》和《中华本草》[1]记
载，山核桃味甘性平，温补肾肺，能补气益血，调燥化
痰，定喘作用，其叶具有清热解毒之功效。到目前为
止对山核桃叶的药理研究和开发报道甚少，目前仅
见陈红红等报道山核桃叶中总黄酮具有抗衰老作用
[2]，何志平等报道山核桃叶多酚具有抗氧化活性[3]。
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是众多心脑血
管疾病共同的病理基础，是心血管系统疾病中最常
见的疾病，严重危害着人类健康。血管新生在动脉粥
样硬化斑块形成中是重要的步骤之一[4]，而内皮细胞
的增殖为血管生成的关键步骤[5]。研究发现，miR-21
可通过负调控其靶基因 PDCD4 (程序性死亡因子)的
表达影响血管内皮细胞的增殖和凋亡，PDCD4 是
miR-21在多种肿瘤细胞中调节的重要靶基因[6]。本文
以 miR-21为靶点，研究 miR-21在山核桃叶总黄酮
抑制 HUVECs增殖作用中的表达情况，为山核桃叶
总黄酮抗 AS的作用机制研究提供实验依据。
1 试剂与仪器
1.1 试剂 RPMI1640培养基(吉诺生物医药技术有
限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；
台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(江苏碧云天生物
技术研究所)；逆转录试剂盒等(宝生物工程(大连)有
限公司)，引物均由上海生工生物技术服务有限公司
合成；Trizol(Invitrogen公司)；柱层析硅胶(青岛海洋化
工厂)；Cell Counting Kit-8 (Dojindo)。
1.2 仪器 低温高速离心机(Thermo company)；凝胶
————————
基金项目：国家自然科学基金（81303258）；浙江中医药大学科研基金资助项目（2012ZR08）
Fond Project: National Natural Science Foundation(81303258)；The Scientific Research Foundation of Zhejiang Chinese
Medical University（2012ZR08）
通讯作者：丁志山，E-mail:zjtcmdzs@163.com
miR-21在山核桃叶总黄酮抑制
人脐静脉内皮细胞增殖中的作用研究
胡旭娇 1,2 刘彩霞 1 杨仙 1 黄晶晶 1 丁滨 1 金波 1 丁志山 1
1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.宁波市鄞州人民医院
摘要：[目的]探讨山核桃叶总黄酮对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖的作用，以及 miR-21在山核桃叶总黄酮抑制 HUVECs增殖中的作用，进一
步探讨山核桃叶总黄酮抑制血管生成的作用机制。[方法]不同浓度山核桃叶总黄酮孵育 HUVECs后，采用 Cell Counting Kit (CCK-8) 法检测 HU－
VECs的生长情况；采用 SYBR定量 PCR检测miR-21的转录水平及Western blot法测定其靶基因 PDCD4的蛋白表达水平。[结果]CCK-8法检测
结果表明，山核桃叶总黄酮可以剂量依赖性地抑制HUVECs的增殖；SYBR定量 PCR结果表明山核桃叶总黄酮孵育过的 HUVECs中 miR-21的
表达量呈浓度依赖性降低，而 PDCD4蛋白的表达量呈浓度依赖性升高。[结论]miR-21可能通过 PDCD4参与了山核桃叶总黄酮抑制 HUVECs增
殖的过程。
关键词：山核桃叶总黄酮；HUVECs增殖；miR-21；PDCD4
中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2014）05-0613-04
Functional Study of miR-21 on Proliferation of HUVECs Inhibited by Total Flavone in the Leaves of Carya Cathayensis Hu Xujiao, Liu Caixia,
Yang Xian, et al 1. Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, China(310053) 2. Yinzhou Peoples Hospital of Ningbo City
Abstract: [Objective]To investigate effects of miR-21 cooperated with total flavone in the leaves of Carya Cathayensis for the proliferation of human
umbilical vein endothelial cell(HUVEC) and expression of miR-21 in the total flavone inhibiting the proliferation of HUVECs. [Methods] To detect
absorbance value of HUVECs treated by Total Flavone in the leaves of Carya Cathayensis with the CCK-8 method. Real-time PCR detects miR-21
expression. Western blot detects the expression of protein in target gene PDCD4.[Results]The result of CCK-8 method shows that total flavone in the
leaves of Carya Cathayensis distinctly inhibits the proliferation of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC). The result of real-time PCR shows that
miR-21 of HUVECs, which is treated by total flavone, is significantly reduced. Futher more, volume of miR-21 is positively correlated with the amount
of total flavonoids. [Conclusion] The miR-21 participates in the process of proliferation of HUVECs treated by total flavone in the leaves of Carya
Cathayensis by regulating expression of target gene.
Key words: total flavone in the leaves of Carya Cathayensis; the proliferation of HUVECs;miR-21; PDCD4
613
DOI:10.16466/j.issn1005-5509.2014.05.030
浙江中医药大学学报 2014年 5月第 38卷第 5期
成像仪 (BIO-RAD)；Real-time PCR 仪 (BIO-RAD)；
UR-4100型酶标仪(美国 Dynatech公司)；倒置显微镜
(日本 OLYMPUS公司)；HEPA CLASS100型细胞 CO2
培养箱(美国 Thermo公司)；超净工作台(苏州安泰空
气技术有限公司)；电泳仪(BIO-RAD)。
1.3 实验其他材料 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细
胞株：由本实验室保存；山核桃叶：于 2011年夏采自
浙江临安湍口镇，晒干后备用。
2 实验方法
2.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养 HUVECs
培养于含 10%胎牛血清（FBS）的 RPMI1640 培养基
中，置于 37℃含 5% CO2培养箱中孵育。用 0.15%胰
酶+0.02%EDTA消化后于 24孔板中培养，接种密度
为 2×104/mL，24h后倒掉旧培养液，换新的培养液，分
别收集 72h内不同时间段的 HUVECs，采用台盼蓝染
色细胞计数法计算细胞的生长密度，建立 HUVECs
生长曲线。根据 HUVECs生长曲线，取对数期的细胞
用于后续实验。
2.2 山核桃叶总黄酮的提取与分离 分别取山核桃叶
500g左右，打粉，过 60目筛，加入 25倍量的 95%乙醇
回流提取 2次，每次提取 10min，过滤，合并 2次滤液，
加入聚酰胺吸附，减压浓缩至无醇味。上柱，40%乙醇洗
脱，收集 40%的乙醇液，减压蒸干成固体，备用[7]。
2.3 CCK-8 法分析山核桃叶总黄酮对 HUVECs 抑
制作用 将对数期生长的 HUVECs以 2×104/mL的密
度接种于 24孔板，24h后换液，继续孵育 12h，待细胞
处于相对静止期后给药组分别加入 20，40，60，
80μg·mL-1的总黄酮，每组设 4个复孔，同时设置空
白组。于 12h后加入 CCK-8试剂，孵育 1h后，在酶标
仪上于 450nm测定吸光度值。
2.4 SYBR定量 PCR检测 miR-21表达情况 经处
理后的 HUVECs收集起来后，用 Trizol试剂提取细胞
总 RNA，总 RNA样品用微量核酸紫外分析仪检测总
RNA的浓度和纯度，然后在 37℃ 60min，85℃ 5S的
条件下进行 RT-PCR。采用 SYBR法检测 miR-21的
表达情况，PCR 反应参数为：预变性 95℃ 5min，变
性 95℃ 20s，退火 58℃ 20s，延伸 72℃ 15s，共 40个
循环，最后延伸 72℃ 5min，同时设 U6（miran内参引物
sn rna u6）为内参。反应完成后设定基线值（baseline）
和阈值（threshold），读取循环阈（Ct）值。根据公式
ΔCt＝[Ct 目的基因]－[Ct 内参] 和 ΔΔCt＝［ΔCt（加药
组）］－[ΔCt（空白组）]，计算 2-ΔΔCt，即为目的基因相对
表达量。
2.5 Western Blot检测 PDCD4的蛋白表达情况 细
胞总蛋白提取后经 BCA法进行蛋白定量，配制 10%
SDS-PAGE分离胶，5%的浓缩胶，上样 30 μl，进行电
泳。湿转膜 2 h后，用 5%的脱脂奶粉封闭 2 h，然后
先后将 PVDF 膜放在含兔抗 PDCD4 和山羊抗兔的
TBST缓冲液中孵育，用 ECL显影液进行显影，Image
J2x软件分析各条带灰度值，结果以目的基因蛋白条
带与 β-actin蛋白条带灰度值的相对比值表示，各组
实验重复 3次。
2.6 数据分析 所有实验数据输入 SPSS17.0 统计
软件进行统计分析，实验数据来自 3次重复的实验，
以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析
(ANOVA)进行统计处理，两组间比较采用 t检验，以
P＜0.05作为差异存在统计学意义，P<0.01为差异有
极显著统计学意义。
3 结果
3.1 不同浓度的山核桃叶总黄酮对 HUVECs的抑制
作用 不同浓度的山核桃叶总黄酮，孵育HUVECs 12h
后 450nm处测定吸光度值，与正常组比较，山核桃叶总
黄酮能明显抑制 HUVECs 的增殖（P<0.01）。IC50=
80.43±6.67μg·mL-1。结果如图 1，图 2和图 3所示。
抑制率 (%)=正常组吸光度-给药组吸光度
正常组吸光度
×100%
（公式）
正常培养条件下，不同浓度的山核桃叶总黄酮孵
育 HUVECs 24h后最低浓度的总黄酮 20μg·mL-1能
抑制 HUVECs 的增殖（P<0.05），40~80μg·mL-1 对
HUVECs的抑制作用更明显（P<0.01），总黄酮孵育
12h后，显微镜(×100)下观察 HUVECs的密度明显减
小，细胞体积皱缩变得不规则。HUVECs的存活率与
0 8 12 16 24 29 35 48 72
时间（h）
12
10
8
6
4
2
0
1.
00
E+
04
/m
L
图 1 通过细胞计数法建立的 HUVECs曲线
Fig.1 HUVECs curve established by cell counting
胡
旭
娇
，
等
：m
iR
-21
在
山
核
桃
叶
总
黄
酮
抑
制
人
脐
静
脉
内
皮
细
胞
增
殖
中
的
作
用
研
究
614
浙江中医药大学学报 2014年 5月第 38卷第 5期
正常组 20 40 60 80
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
（
%）
总黄酮浓度（μg·mL-1）
图 2 不同浓度山核桃叶总黄酮对 HUVECs生长的抑制率
Fig.2 The inhibition ratio of growih of HUVECs with incubation of different concentrations of total flavonoids
注：与正常组比较，*P<0.05, **P<0.01。
Note: Compared with normal group，**P＜0.01,*P＜0.05.
正常组 加药组（20μg·mL-1）
加药组（40μg·mL-1） 加药组（60μg·mL-1） 加药组（80μg·mL-1）
图 3 不同浓度的山核桃叶总黄酮对 HUVECs形态的影响(×100)
Fig.3 The effect of form of HUVECs with incubation of different concentrations of total flavonoids (×100)
总黄酮的浓度成反比，并具有剂量依赖性。
3.2 不同浓度总黄酮孵育下 HUVECs中 miR-21表
达情况
山核桃叶总黄酮孵育下，与正常组比较，40μg·
mL-1和 60μg·mL-1药物组的 miR-21 的相对表达量
分别降低了 66.1%和 70%(*P<0.05)，80μg·mL-1给药
组的 miR-21的相对表达量显著性降低了 92.7%(**P<
0.01)。可见，山核桃叶总黄酮处理可抑制 HUVECs中
miR-21的表达。见图 4。
3.3 不同浓度总黄酮孵育下 HUVECs中 PDCD4的
蛋白表达情况 随着总黄酮浓度的增加，HUVECs中
PDCD4的蛋白表达呈浓度依赖性增加，与正常组相
比，40μg·mL-1，60μg·mL-1和 80μg·mL-1分别为正常
组的 1.83±0.058 倍，1.97±0.086 倍及 2.16±0.051 倍
（P<0.01）。见图 5。
4 分析与讨论
斑块内血管生成是动脉粥样硬化发生的一个重
要步骤，血管新生是一个受到多种信号分子和通路精
确调控的复杂过程[8-9]。近年来研究发现，microRNAs
(miRNAs)是一类长 19-25nt的内源性非编码蛋白质的
单链小 RNA，其介导的转录后基因调控机制影响着细
胞内大部分基因的表达水平[10]。miRNAs在体内的表达
是一个普遍现象，涉及人体大多数生理和病理过程，
包括动脉粥样硬化，糖尿病视网膜病变及肿瘤等疾
病，miRNAs已成为生命科学研究领域的热点。研究表
明，包括 miR-21在内的多种 miRNA，均高表达于血
管内皮细胞[11]。miR-21可通过负调控其靶基因 PDCD4
的表达影响血管内皮细胞的增殖，对 miRNA-21的表
达干预有可能成为相关血管疾病新的有效治疗靶点。
山核桃叶总黄酮具有治疗心血管疾病，抗肿瘤作用，
胡
旭
娇
，
等
：m
iR
-21
在
山
核
桃
叶
总
黄
酮
抑
制
人
脐
静
脉
内
皮
细
胞
增
殖
中
的
作
用
研
究
615
浙江中医药大学学报 2014年 5月第 38卷第 5期
图 5 不同浓度总黄酮孵育下 HUVECs中 PDCD4的蛋白相对表达量
Fig.5 The relative expression of PDCD4 of HUVECs with incubation of different concentrations of total flavonoids
注：与正常组比较，**P＜0.01。
Note: Compared with normal group，**P＜0.01.
正常组 20 40 60 80
总黄酮（μg·mL-1）
2.5
2
1.5
1
0.5
0
PD
CD
4
的
相
对
表
达
量
正常组 20 40 60 80
总黄酮（μg·mL-1）
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
m
iR
-2
1
的
相
对
表
达
量
图 4 不同给药组处理的 HUVECs中 miR-21的相对表达量
Fig.4 The relative expression of miR-21 of HUVECs with incubation of different concentrations of total flavonoids
注：与正常组比较，*P<0.05, **P<0.01。
Note: Compared with normal group，**P＜0.01,*P＜0.05.
能够抑制内皮细胞增殖，抑制血管生成，但其作用机
制尚不明确，而 miR-21对山核桃叶总黄酮抑制内皮
细胞增殖调控作用目前还未见报道。
本研究选取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，
发现经山核桃叶总黄酮孵育过的 HUVECs密度较空
白对照组明显降低，HUVECs的生长密度与山核桃叶
总黄酮浓度呈负相关。可见山核桃叶总黄酮能有效
的抑制 HUVECs的增殖，而且 miR-21的表达水平呈
浓度依赖性降低，PDCD4的蛋白表达量呈浓度依赖
性升高，则说明山核桃叶总黄酮抑制 HUVECs增殖
很可能是通过 miR-21负调控其相关靶基因 PDCD4
的表达而发挥作用的。
综上所述，山核桃叶总黄酮抑制HUVECs增殖可
能通过 miR-21负调控其靶基因的表达，为下一步探究
山核桃叶总黄酮抑制 HUVECs迁移奠定了实验依据，
同时对 miR-21的表达干预有可能成为相关心血管疾
病新的有效治疗靶点。本实验只初步发现了山核桃叶总
黄酮抑制人脐静脉内皮细胞的增殖实验中 miR-21的
表达水平有所改变，但其具体机制有待研究。
参考文献:
References:
[1] 国家中医药管理局编委会.中华本草:1版[S].上海科学技
术出版社, 1999:369-370.
State Administration of Traditional Editorial. Chinese
（下转第 640页）
胡
旭
娇
，
等
：m
iR
-21
在
山
核
桃
叶
总
黄
酮
抑
制
人
脐
静
脉
内
皮
细
胞
增
殖
中
的
作
用
研
究
616
浙江中医药大学学报 2014年 5月第 38卷第 5期
（上接第 616页）
Materia Medica:one version. [S]. Shanghai Scientific and
Technical Publishers, 1999:369-370.
[2] 陈红红,李助乐,章健,等.山核桃叶总黄酮抗衰老作用的研
究[J].天然产物研究与开发,2008,20(5):892-895.
Chen Honghong,Li Zhule,Zang Jian, et al. Study on the
Anti -aging Effect of Flavonoids in Hickory Leaf [J].
Natural Product Research and Development, 2008,20 (5):
892-895.
[3] 何志平,庞林江,茅林春,等.山核桃叶提取物的抗氧化活性
比较[J].食品与机械,2011, 27(3):45-48.
He Zhiping,Pang Linjiang,Mao Linchun, et al. Antioxidant
activities in the extracts from Chinese hickory(carya
cathayensis sarg.) leaves[J]. Food & Machinery, 2011, 27
(3):45-48.
[4] Jiang Junlin, Yan Meiling, Jawahar L, et al. Angiogenesis
is a link between atherosclerosis and tumorigenesis: Role
of LOX-1[J]. Cardiovasc Drugs Ther 2011, 25(5):461-468.
[5] Park HJ, Zhang Y, Georgescu SP, et al. Human umbilical
vein endothelial cells and human dermal microvascular
endothelial cells offer new insights into the relationship
between lipid metabolism and angiogenesis[J]. Stem Cell Rev,
2006,2(2):93-102.
[6] Lu Z, Liu M, Stribinskis V. MicroRNA-21 promotes cell
transformation by targeting the programmed cell death 4
gene[J]. Oncogene, 2008, 27(3):4373-4379.
[7] 朱学鑫,李伟平，俞燕,等.山核桃叶总黄酮制备[J].中华中医
药学刊,2013,31(1):147-149.
Zhu Xuexin,Li Weiping,Yu Yan, et al. Total Flavonoids
Preparation of the Carya cathayensis Sarg leaves[J]. Chinese
Archives of Traditional Chinese Medicine,2013, (3):147 -
149.
[8] 李芳, 张先慧, 陈临溪. 血管新生机制的研究进展[J]. 中
国心血管病研究, 2007;5:861-863.
Li Fang, Zhang Xianhui,Chen Linxi. Study on Advances
in Angiogenesis Mechanism[J]. Chinese Journal of Cardio-
vascular Review, 2007;5:861-863.
[9] 张秀莉. 一种新黄酮类化合物 ((2S)-8-异戊烯基-7, 2,
4-三羟基 5-甲氧基二氢黄酮) 的抗血管生成作用及其
机制研究[D]. 兰州大学,2010:8-9.
Zhang Xiuli . The Anti -Angiogenesis Effect of a New
Flavonoid((2S)-8-isopentenyl-7,2 ,4-trihydroxy-5-meth-
oxyflavo-none) and Its Mechanism[D]. Lanzhou University;
2010:8-9.
[10] 杨旸. miRNA-21与肿瘤相关研究新进展[J]. 中国肿瘤临
床, 2011, 38(6):357-360.
YangYang. Recent Advancesin the R esearchon the
Relation ship betweenmi RNA-21 and Cancer[J]. Journal of
Clinical Oncology, 2011, 38(6):357-360.
[11] Kuehbacher A, Urbich C, Zeiher A M, et al. Role of
dicer and drosha for endothelial microRNA expression
and angiogenesis[J]. Circ Res, 2007, 101(1):59-68.
(收稿日期：2014-01-09)
病人、尊重生命的职业操守，并对学生的人文素养、职
业态度、沟通能力等进行综合评价。
2.3 完善医学人文教育实践体系 建构以大爱文化
主题的校园文化育人环境。通过建立医学生誓言墙、
医学家雕塑、无语师碑、中医药文化碑廊等，提升校园
物质环境的文化内涵，发挥校园环境在学生陶冶情
操、砥砺德行中的作用。通过开展医学生宣誓、医学
人文讲座、医生事迹报告、学科竞赛、专业社团活动
等，培育“大医精诚”、“大爱无疆”的校园文化，培养学
生的人文关怀与奉献精神，增强学生对医学的认同
感、责任感与使命感。
开展医学人文教育社会实践活动，有计划有步骤
地安排主题社会实践：低年级学生以“走进医院、关爱
病人”、“感知医药卫生国情”等为主题，在医院从事义
工服务，深入基层开展医疗卫生政策主题调研；高年
级学生在见习和实习期间，开展“假如我是病人”活
动，进行角色互换试验，让医学生充分体会就医环境，
学会换位思考。此外，积极开展上山下乡，送医送药
活动，组织学生深入农村、社区，开展卫生健康知识宣
教、免费医疗、保健咨询、义务献血、志愿服务等活动，
引导学生树立救死扶伤、无私奉献的职业精神。
通过长期的教育与实践，学生的医学人文素养显
著提升，专业思想更加巩固，职业使命感更加强烈，理
想信念更加坚定，形成了崇学向善、互助友爱的校园
文化，涌现了一批“救死扶伤好青年”、“浙江青少年学
生道德榜样”等先进典型。
以医学人文精神为内核开展大学生理想信念教
育，将理想信念教育与大学生的专业学习、职业规划、
现实追求等联系起来，有助于实现学业观、职业观、人
生观、价值观、世界观的结合，使理想信念从“云端”回
归到“陆地”，提高教育实效，促进学生成长。
参考文献：
[1] 吴潜涛.正确理解理想信念的科学含义[J].教学与研究,2011,
5(4): 5-9．
[2] 习近平. 理想信念是共产党人的精神之“钙”[EB /OL].
(2014-01-20) http://news.xinhuanet.com/politics/c_119051416.
html．
[3] “当代大学生理想信念教育研究”课题组.大学生理想信念
教育现状调查分析报告[J].学校党建与思想教育, 2008
（12）: 15-18．
(收稿日期：2014-04-04)
胡
洁
，
等
：
以
医
学
人
文
精
神
促
进
大
学
生
理
想
信
念
教
育
的
实
践
研
究
640