全 文 ：２０１５年４月 Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．４
Ａｐｒｉｌ　２０１５　 Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１３～４１８
技术与应用 ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１４．１２０３５
＊通讯联系人．Ｔｅｌ：（０９３１）８９１５６８６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｓｈｌ＠Ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
基金项目：甘肃省科技支撑计划项目（１３０４ＦＫＣＡ１０１）．
收稿日期：２０１４－１２－２９
红芪药材防治肝纤维化的谱效关系
陈心悦，　柳小亚，　陈亚丽，　洪　妍，　封士兰＊
（兰州大学药学院，甘肃 兰州７３００００）
摘要：研究了红芪药材的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）指纹图谱与抗肝纤维化作用之间的谱效关系。采用四氯化碳
（ＣＣｌ４）－花生油（体积比为４∶６）皮下注射（０．１　ｍＬ／１０　ｇ，１次／５　ｄ）致小鼠肝纤维化，同时灌胃给予红芪各不同溶剂
提取物（１０　ｇ原药材／ｋｇ，１次／ｄ），５周后测定与肝纤维化有关的各血清指标及肝重指数，结果乙醇提取物药效最
佳。运用灰色关联度和偏最小二乘法研究了不同产地红芪药材乙醇提取部位的ＨＰＬＣ指纹图谱与抗肝纤维化药
效之间的谱效相关性。结果红芪乙醇提取物中多数成分与抗肝纤维化药效均有高度关联性（＞０．８），表明该药效
是红芪中所有成分共同作用的结果；同时鉴定出腺苷、毛蕊异黄酮及芒柄花苷３种成分，其中腺苷及毛蕊异黄酮对
药效有较大贡献。
关键词：指纹图谱；肝纤维化；谱效相关；统计方法；红芪
中图分类号：Ｏ６５８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１０００－８７１３（２０１５）０４－０４１３－０６
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ－ｅｆｆｅｃｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ
ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ
ＣＨＥＮ　Ｘｉｎｙｕｅ，ＬＩＵ　Ｘｉａｏｙａ，ＣＨＥＮ　Ｙａｌｉ，ＨＯＮＧ　Ｙａｎ，ＦＥＮＧ　Ｓｈｉｌａｎ＊
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ－ｅｆｆｅｃｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｗａｓ
ｅｘｐｌｏｒｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｂｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ　ａ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｐｅａｎｕｔ　ｏｉｌ（４∶６，ｖ／ｖ）
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　ｆｏｒ　３５　ｄ　ａｔ　ａ　ｉｎｔｅｒｖａｌ　ｏｆ　５　ｄ（０．１　ｍＬ／１０　ｇ）．Ａｎｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｔｈｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｗｅｒｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ｏｒａｌｙ　ｏｎｃｅ　ｄａｉｌｙ　ａｔ　ａ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１０　ｇ／ｋｇ．Ｔｈｅ
ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｗａｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｍｏｓｔ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｂｙ　ｄｅ－
ｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ｔｏｔａｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｂｕｍｉｎ，
ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＴＰ，ＡＬＢ，ａｎｄ　Ａ／Ｇ）ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｉｖｅｒ　ｗｅｉｇｈｔ．Ｓｕｂｓｅ－
ｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅ　ｇｒｅｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｇｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｌｅａｓｔ　ｓｑｕａｒｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｒｅ－
ｖｅａｌ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ
ｆｒｏｍ１０　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ　ｏｒｉｇｉｎｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ
ｍｏｓｔ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｈａｖｅ　ａ　ｈｉｇｈ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔ－
ｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ（＞０．８），ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｒａｄｉｘ
Ｈｅｄｙｓａｒｉ．Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，ｃａｌｙｃｏｓｉｎ　ａｎｄ　ｏｎｏｎｉｎ　ｉｎ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｉｄｅｎｔｉ－
ｆｉｅｄ　ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ　ａｍｏｎｇ　ｗｈｉｃｈ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ａｎｄ　ｃａｌｙｃｏｓｉｎ　ｍａｄｅ　ｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｃ
ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ；ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｓｐｅｃｔｒｕｍ－ｅｆｆｅｃｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ；ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ；
Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ
　　中药谱效相关研究是近年来发展的探究药效物
质基础、有效控制中药质量的新方法，它在中医药理
论现代研究的基础上，以中药指纹图谱为基础，以效
应学为主要内容，运用统计的方法（聚类分析、主成
色 谱 第３３卷
分分析、回归分析、灰色关联度分析等），将中药指纹
图谱中化学成分的变化与中药的药效关联起来［１］。
　　红芪（Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ）也称为“独根”，是豆科
植物多序岩黄芪（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ　Ｈａｎｄ．
Ｍａｚｚ．）的干燥根。红芪性微温、味甘，归肺、脾经，
具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功
效［２］。其化学成分主要有多糖［３］、黄酮［４］、皂苷［５］、
微量元素及氨基酸［６］。胡芳弟等［７］利用ＨＰＬＣ测定
了红芪中两种异黄酮类成分的含量；邵晶等［８］利用
双波长薄层扫描法测定了红芪颗粒剂中γ－氨基丁
酸的含量；关于红芪多糖的测定，目前报道有蒽酮－
硫酸分光光度法［９］、ＨＰＬＣ－蒸发光散射检测器
（ＥＬＳＤ）检测法［３］；而对于红芪根中微量元素和氨基
酸的测定，早在上世纪９０年代已有报道［６］。
　　柳姜冰等［１０］研究证实了红芪多糖对Ｄ－氨基半
乳糖所致大鼠肝损伤及四氯化碳所致小鼠肝损伤具
有保护作用，但关于红芪发挥该疗效的物质基础并
未研究。为此，本研究以四氯化碳－花生油（体积比
为４∶６）溶液造成小鼠肝纤维化，将红芪的ＨＰＬＣ指
纹图谱与药效学实验相结合，运用灰色关联度及偏
最小二乘的方法研究两者之间的谱效关系，以揭示
其药效物质基础。
１　实验部分
１．１　仪器、试剂与材料
　　Ｗａｔｅｒｓ　Ａｌｉａｎｃｅ　２６９５－高效液相色谱仪，包括
２９９６－二极管阵列检测器、７１７自动进样器和 Ｍｉｌｅｎ－
ｎｉｕｍ３２－色谱工作站（美国 Ｗａｔｅｒｓ公司）；中南大学
中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价软件
（１１．０）；旋转蒸发仪（Ｎ－１１００，东京理化器械［株］独
资工厂）；涡旋混匀器（ＸＫ９６－Ｂ，姜堰市新康医疗器
械有限公司）；５５０酶联免疫检测仪（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ
公司）；超声波清洗器（ＫＱ３２００ＢＥ数控，昆山市超声
仪有限公司）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ＢＰ２１１Ｄ电子天平（误差±
０．０００　０１　ｇ，德国赛多利斯）；ＦＡ２１０４电子天平（误
差±０．０００　１，上海市安亭电子仪器厂）。
　　乙腈（分析纯，Ｍｅｒｃｋ公司）；娃哈哈纯净水；对
照品芒柄花苷（批号：２０１２０６，购自中国药品生物制
品检定所，纯度＞９８％）；对照品腺苷（批号：１１０８７９－
２００２０２，购自中国药品生物制品检定所，纯度＞
９８％）；对照品毛蕊异黄酮（购自上海顺勃生物工程
有限公司，纯度＞９８％）；秋水仙碱片（批号：１４０５０５，
西双版纳药业有限责任公司，规格０．５　ｍｇ／粒）；四
氯化碳（ＣＣｌ４，天津市富宇精细化工有限公司）；花生
油（山东鲁花集团有限公司）；谷草转氨酶试剂盒
（ＡＬＴ）、谷丙转氨酶试剂盒（ＡＳＴ）、总蛋白试剂盒
（ＴＰ）、白蛋白试剂盒（ＡＬＢ）（均购自南京建成生物
制药公司）；１０批甘肃省不同产地红芪药材，自采
或购买，编号及来源见表１。经兰州大学生药学研
究院马志刚教授鉴定为多序岩黄芪 Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ
ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ　Ｈａｎｄ．Ｍａｚｚ．的干燥根。
　　昆明种小鼠，雄性，体重１８～２５　ｇ，兰州大学动
物实验中心提供，合格证号：ＳＣＸＫ（甘）２０１３－０００２。
表１　红芪药材来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ
Ｎｏ． Ｓｏｕｒｃｅ　 Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｎａｍｅ
１　 Ｍｉｃａｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｏｆ　Ｗｕｄｕ　Ｃｉｔｙ 武都米仓山
２　 Ｌｉ　Ｃｏｕｎｔｙ 礼县
３　 Ｓｈｏｕｙａｎｇ　Ｔｏｗｎ　ｏｆ　Ｌｏｎｇｘｉ　Ｃｏｕｎｔｙ 陇西首阳镇
４　 Ｃｈｅｎｇｇｕａｎ　Ｔｏｗｎ　ｏｆ　Ｔａｎｃｈａｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ 宕昌城关镇
５　 Ｊｉａｎｇｔａｉ　Ｃｏｕｎｔｒｙ　ｏｆ　Ｔａｎｃｈａｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ 宕昌将台乡
６　 Ｇｕａｎｔｉｎｇ　Ｔｏｗｎ　ｏｆ　Ｔａｎｃｈａｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ 宕昌官亭镇
７　 Ｌｏｎｇｘｉ　Ｃｏｕｎｔｙ（ｐｕｒｃｈａｓｅｄ　ｉｎ　２０１４） 陇西（２０１４年采购）
８　 Ｗｕｄｕ　Ｃｉｔｙ（ｗｉｌｄ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ） 武都野生
９　 Ｌｏｎｇｘｉ　Ｃｏｕｎｔｙ（ｐｕｒｃｈａｓｅｄ　ｉｎ　２０１１） 陇西（２０１１年采购）
１０　 Ｈａｄａｐｕ　Ｔｏｗｎ　ｏｆ　Ｔａｎｃｈａｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ 宕昌哈达铺镇
１．２　红芪不同提取部位的制备［１１］
　　称取红芪（编号９）５００　ｇ，每次加入６倍量的
９５％乙醇回流提取１　ｈ，３次后，合并提取液，减压
蒸馏至无醇味，取其中１／５浓缩至干，得红芪总提取
物；剩余４／５移至分液漏斗，加入等体积的石油醚萃
取５次，合并上层萃取液，浓缩至干，即为石油醚提
取部位；下层液体加入等体积乙酸乙酯萃取，方法同
石油醚提取部位，即得乙酸乙酯提取部位；经两次萃
取后剩余溶液浓缩至干，加入乙醇，能溶于其中的即
为乙醇提取部位；回流提取后的红芪药渣加热水提
取３次，每次１　ｈ，合并提取液，减压浓缩后离心，取
上清液，加入乙醇得到的沉淀部分即为红芪粗多糖
部分。按照该步骤，依次得到红芪总提取物、石油醚
部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和红芪粗多糖（表２
中分别以序号１、２、３、４、５来依次表示各提取部位），
根据各提取部位的出膏率换算小鼠的给药剂量。
１．３　红芪不同提取部位的抗肝纤维化作用［１２，１３］
　　取雄性昆明种小鼠９６只，适应性饲养一周后，
随机分为空白组、模型组、阳性对照组和５个红芪提
取部位给药组，每组１２只。模型组皮下注射四氯化
碳－花生油（体积比为４∶６）溶液诱发肝纤维化，０．１
ｍＬ／１０　ｇ（首剂加倍），１次／５　ｄ，连续３５　ｄ，即可形成
肝纤维化。除空白组外，其余各组均按模型组同法
造模。造模同时阳性对照组灌胃给予秋水仙碱片
（０．６　ｍｇ／ｋｇ），５个给药组灌胃给予各自提取部位
（１０　ｇ原药材／ｋｇ），空白组和模型组均给予生理盐
·４１４·
　第４期 陈心悦，等：红芪药材防治肝纤维化的谱效关系
水，剂量同上。末次给药后，摘眼球取血，静置离心
后，分离出血清，按试剂盒说明测定ＡＬＴ、ＡＳＴ、Ｔｐ、
Ａｌｂ、Ａ／Ｇ各项指标［１４］；同时摘除小鼠肝脏，称重，计
算肝重指数［１５］。结果见表２。
表２　红芪不同提取部位对四氯化碳致小鼠肝纤维化的影响（ｎ＝１２）
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ＲａｄｉｘＨｅｄｙｓａｒｉｏｎ　ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ（ｎ＝１２）
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　 ＡＬＴ／（Ｕ／Ｌ） ＡＳＴ／（Ｕ／Ｌ） ＴＰ／（ｇ／Ｌ） ＡＬＢ／（ｇ／Ｌ） Ａ／Ｇ　 Ｌｉｖｅｒ　ｉｎｄｅｘ
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 １２０．３７１±０．０２５＊＊＊ １４０．１８２±０．０６５＊＊＊ ７７．１３１±０．０２０＊＊＊ ７５．２３３±０．０３４＊＊＊ ６．３２２±０．０１３＊＊＊ ０．０５３±０．０３０＊＊
ＣＣｌ４（Ｍｏｄｅｌ） ２２２．１２５±０．０３３　 ２０１．９６６±０．０２３　 １４０．２１２±０．０５１　 ５３．１１４±０．０２１　 ０．６１０±０．０３６　 ０．０７２±０．４４０
ＣＣｌ４＋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　１６０．３３４±０．０４６＊＊ １７５．３０７±０．０３３＊＊ １２３．４１７±０．０２２＊＊ ７３．６７４±０．０５６＊＊ １．４８１±０．０１２＊＊＊ ０．０６５±０．０２５＊
ＣＣｌ４＋１　 ２４０．１９１±０．０３７　 ２００．６５２±０．０５０　 １５５．４０８±０．０６２　 ５０．２２８±０．０６７　 ０．４７７±０．０３７　 ０．０７０±０．０３４
ＣＣｌ４＋２　 １９２．２４０±０．０３８　 １６０．３９１±０．０４３＊ １３８．５５０±０．０４２　 ５２．２２５±０．０３９　 ０．６０５±０．０１１　 ０．０６９±０．０５５
ＣＣｌ４＋３　 １８１．７２５±０．０９７＊ １６８．５４３±０．０７０　 １４５．２２４±０．０３６　 ５５．３６１±０．０１８＊ ０．６１５±０．０２６　 ０．０７１±０．０１３
ＣＣｌ４＋４　 １３４．１２８±０．０２７＊＊＊ １４４．９２９±０．０２１＊＊＊ ９９．６７２±０．０２８＊＊＊ ６７．２３７±０．０１４＊＊ １．９５２±０．０３５＊＊＊ ０．０５８±０．０５１＊＊
ＣＣｌ４＋５　 １４３．６６４±０．０４７＊＊ １５６．７２１±０．０３０＊＊＊１１０．３２２±０．０４４＊＊ ６３．４４５±０．０４６＊＊ １．３５３±０．０６５＊＊ ０．０６０±０．０２２＊＊
　Ｎｏｔｅ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５．１：ｔｏｔａｌ　ｅｘｔｒａｃｔ；２．ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ　ｅｔｈｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ；３．ｅｔｈｙｌ　ａｃ－
ｅｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ；４．ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ；５．ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｙｓ　ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．
１．４　不同产地红芪乙醇提取部位的抗肝纤维化作用
　　取１０批不同产地红芪，按１．２节步骤制备乙醇
提取部位。取雄性昆明种小鼠１５６只，随机分为空
白组、模型组、阳性对照组和１０批红芪乙醇提取部
位给药组，每组１２只。各组实验方法和周期均同
１．３节。结果见表３。
表３　不同产地红芪乙醇提取部位对四氯化碳所致小鼠肝纤维化的药效指标（ｎ＝１２）
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｆｒｏｍ１０　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｎ　ｃａｒｂｏｎ
ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ（ｎ＝１２）
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　 ＡＬＴ／（Ｕ／Ｌ） ＡＳＴ／（Ｕ／Ｌ） ＴＰ／（ｇ／Ｌ） ＡＬＢ／（ｇ／Ｌ） Ａ／Ｇ　 Ｌｉｖｅｒ　ｉｎｄｅｘ
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 １７２．３５２±０．０２７＊＊＊ １７０．４１３±０．０１２＊＊＊ ９５．１５３±０．００６＊＊＊ ８４．４３３±０．０１７＊＊＊ ７．８８２±０．０１５＊＊＊ ０．０５６±０．０３１＊＊
ＣＣｌ４（Ｍｏｄｅｌ） ２８７．２２３±０．０５３　 ２７７．１５５±０．０５５　 １５２．０１４±０．００８　 ６５．６２５±０．０１４　 ０．７６０±０．０２２　 ０．０７５±０．０２５
ＣＣｌ４＋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　１９５．１４１±０．０１２＊＊＊ １９６．１９１±０．０１８＊＊＊１４９．１０５±０．０３４＊＊ ８０．７５２±０．０２０＊＊ １．１８２±０．０１７＊＊ ０．０６０±０．０１３＊＊
Ｓａｍｐｌｅ１　 １８９．９９５±０．００５＊＊＊ １８５．０３６±０．００８＊＊＊１３８．４０２±０．０２３＊＊＊ ６８．５１９±０．０２２＊ ０．９８０±０．０１６＊＊ ０．０６３±０．０１９＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　２　 １９７．１６３±０．０１４＊＊＊ １８２．０７４±０．０２８＊＊＊１３４．５６３±０．０１３＊＊＊ ８６．１１８±０．０５４＊＊ １．７７８±０．０２５＊＊＊ ０．０５９±０．０２７＊＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　３　 ２０８．０１６±０．０１５＊＊ １８２．８５２±０．０５３＊＊＊１３８．０３４±０．０２６＊＊＊ ７３．６６ｄ±０．０２０＊＊ １．１４４±０．０３０＊＊ ０．０６１±０．０２２＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　４　 １９２．７５２±０．０１１＊＊＊ １７９．１９３±０．０４７＊＊＊１３８．５０６±０．０３０＊ ８０．９０３±０．０４９＊＊＊ １．４０４±０．０３３＊＊ ０．０６６±０．０１８＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　５　 ２５３．４０５±０．０９０　 １５７．７０２±０．０５３＊＊＊１５１．０７０±０．０３０＊＊ １０５．３８９±０．０３３＊＊＊ ２．３０６±０．０２９＊＊＊ ０．０５８±０．０１９＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　６　 ２２０．５０７±０．０１５＊＊＊ ２１０．０３０±０．０２２＊＊ １４０．０９７±０．０２１＊＊ ８７．３４４±０．０３６＊＊＊ １．６５６±０．０１３＊＊＊ ０．０５９±０．０２０＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　７　 ２６７．１８８±０．０１３＊ １７５．０７４±０．０９９＊＊＊１４１．４１４±０．０２６＊＊ ８１．４１１±０．０１４＊＊＊ １．３５７±０．０３３＊ ０．０６３±０．０２７＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　８　 １９１．６５５±０．０１７＊＊＊ １８７．０６２±０．０１０＊＊＊１２１．７０５±０．０２７＊＊＊ ７１．４１２±０．０３２＊＊ １．４２０±０．０１０＊＊ ０．０６２±０．０１６＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　９　 ２７１．２３２±０．０２７＊ １７６．７０１±０．０４０＊＊＊１４１．２２０±０．０２１＊＊ ７６．７７６±０．０２２＊＊ １．１９１±０．０３２＊ ０．０６１±０．０２４＊＊
Ｓａｍｐｌｅ　１０　 ２１９．０３０±０．００６＊＊＊ １７９．２８３±０．０１２＊＊＊１３９．３４０±０．０２３＊＊＊ ８６．５５７±０．０１８＊＊＊ １．６３９±０．０１１＊＊＊ ０．０５７±０．００７＊＊
　Ｎｏｔｅ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５．
１．５　不同产地红芪乙醇提取部位的 ＨＰＬＣ指纹图
谱
１．５．１　色谱条件
　　Ｓｐｕｒｓｉｌ　Ｃ１８色谱柱（２５０　ｍｍ×４．６　ｍｍ，５μｍ）；
流动相：Ａ为乙腈，Ｂ为水；梯度洗脱：０～４０　ｍｉｎ，
４０％Ａ；４０～７５　ｍｉｎ，６０％Ａ；检测波长为２６０　ｎｍ；流
速为１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为２５℃；进样量为２０μＬ。
１．５．２　对照品溶液的制备
　　精密称量腺苷对照品、毛蕊异黄酮对照品、芒柄
花苷对照品适量，加甲醇分别制成适当浓度的对照
品溶液。
１．５．３　供试品溶液的制备
　　取１０批红芪药材乙醇提取部位的干燥品各
０．５　ｇ，精密称定，加甲醇溶解并转移至１０　ｍＬ量瓶
中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
２　结果与讨论
２．１　红芪不同提取部位的药效学研究
　　由表２可知，红芪总提取物与模型组相比，各指
标均无显著性差异；石油醚部位与模型组相比，仅
ＡＳＴ指标与模型组相比有显著性差异，其余５项指
标与模型组相比均无显著性差异；同理，乙酸乙酯部
位虽有两项指标（ＡＬＴ，ＡＬＢ）与模型组相比表现出
显著性差异，但另４项指标与模型组相比均无显著
性差异；红芪乙醇提取部位及红芪多糖对四氯化碳
致小鼠肝纤维化有明显的抑制作用，与模型组相比，
６项指标均具有显著性差异 （ｐ＜０．００１，ｐ＜
０．０１）。而本实验室［１６－１８］已研究了红芪多糖的提取
分离及组成结构，已获得红芪多糖（ＨＰＳ－１，ＨＰＳ－２，
ＨＰＳ－３），经气相色谱、薄层色谱及红外光谱分析，确
·５１４·
色 谱 第３３卷
定了３种红芪多糖均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡
萄糖、半乳糖５种单糖组成，并进行了含量测定。而
红芪乙醇提取部位的研究暂未涉及，因此本工作选
择红芪乙醇提取部位进行ＨＰＬＣ指纹图谱与抗肝纤
维化作用之间的谱效关系研究。
２．２　不同产地红芪乙醇提取部位的抗肝纤维化作用
　　从表３可以看出，１０批不同产地红芪与模型组
相比，综合６个指标来看，大部分指标均具有极显著
性差异（ｐ＜０．００１），说明造模成功，药效显著。
２．３　不同产地红芪乙醇提取部位的 ＨＰＬＣ指纹图
谱
２．３．１　色谱峰归属
　　分别精密吸取腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷对照
品以及１０批红芪供试品溶液，按照１．５节的色谱条
件进行测定，结果见图１和图２。１０批红芪乙醇提
取部位的ＨＰＬＣ－ＤＡＤ指纹图谱中，共确定了９个共
有峰，通过与对照品的保留时间及紫外吸收比较，２
号峰、７号峰及９号峰分别鉴定为腺苷、毛蕊异黄酮
和芒柄花苷。
图１　１０批红芪乙醇提取部位的ＨＰＬＣ－ＤＡＤ指纹图谱
Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ－ＤＡＤ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ
ｏｆ　Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｆｒｏｍ　ｔｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｕｒｃｅｓ
　Ｐｅａｋ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：２．ａｄｅｎｏｓｉｎｅ；７．ｃａｌｙｃｏｓｉｎ；９．ｏｎｏｎｉｎ．
图２　对照品的ＨＰＬＣ图谱（２６０　ｎｍ）
Ｆｉｇ．２　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（２６０　ｎｍ）　
２．３．２　方法学考察
　　精密吸取芒柄花苷对照品溶液２０μＬ，按上述
色谱条件连续进样５次，以测试仪器精密度；按照
１．５．３节方法制备供试品溶液（９号红芪药材），精密
吸取２０μＬ，分别在０、３、６、９、１０、１２　ｈ进样，以考察
供试品溶液的稳定性；取同一批红芪药材（９号红芪
药材），按照１．５．３节方法平行制备６份供试品溶
液，精密吸取２０μＬ，进样，以考察方法的重复性。
结果各考察项下，指纹图谱中各色谱峰的相对保留
时间及相对峰面积的ＲＳＤ均＜３％，说明仪器精密
度良好，供试品溶液１２　ｈ内稳定，方法重复性好；将
腺苷、毛蕊异黄酮及芒柄花苷对照品溶液定量加入
已测定含量的供试品溶液（９号红芪药材）中，重复
测定６次，得腺苷、毛蕊异黄酮及腺苷的平均回收率
分别为 ９６．８８％、９７．７６％、９７．９３％，ＲＳＤ 分别为
１．９５％、２．５２％、２．０１％。
２．４　谱效相关性分析
２．４．１　灰色关联度相关分析［１９］
　　将峰面积数据与ＡＬＴ药效学数据进行关联。
通过对原始数据标准化转化后，计算关联度，得各峰
对药效的贡献程度排名为：７＞２＞５＞３＞１＞６＞４＞
９＞８。几乎共有峰所代表的化学成分与药效的关联
度均＞０．８（除８号峰外），可以看出红芪抗肝纤维化
药效是多种成分共同作用的结果（见表４）。
２．４．２　偏最小二乘法相关分析［２０］
　　利用ＳＩＭＣＡ－Ｐ　１１．５软件，经过多次提取主成
分，多次迭代，拟合出峰面积与药效数据之间的数理
方程：ｙ＝－０．２５３　４　Ｐ１＋０．３４１　４　Ｐ２－０．４２２　４　Ｐ３－
０．５７５　６Ｐ４＋０．２１９　４　Ｐ５－０．４７３　３　Ｐ６＋０．３５０　５　Ｐ７－
０．３４１　４Ｐ８－０．０９３　３７　Ｐ９（Ｐ１～Ｐ９ 为共有峰面积，ｙ
为红芪乙醇部位抗肝纤维化药效），各峰所代表的化
学成分对抗肝纤维化药效贡献大小顺序为：７＞２＞５
＞９＞１＞３＞６＞８＞４，其中７、２、５与药效呈正相关，
而９、１、３、６、４、８与药效呈负相关。
２．５　讨论
２．５．１　统计方法
　　本文采用灰色关联度和偏最小二乘的统计方法
研究谱效关系。灰色关联度主要分析两种因素在发
展过程中的关联度大小，若发展趋势一致，则关联度
大，反之关联度小。主要步骤包括：原始数据转换、
求绝对差序列、确定关联系数，进而确定关联度，排
列出关联序［２１］。但灰色关联度法只是单独考察了
各成分的重要性，并不能反应各成分对药效的综合
作用，故而本文又采用偏最小二乘的方法，通过拟合
·６１４·
　第４期 陈心悦，等：红芪药材防治肝纤维化的谱效关系
表４　１０批红芪药材乙醇提取部位的共有峰峰面积、保留时间、ＡＬＴ药效值（Ｒ）及峰面积与Ｒ 的灰色关联度
Ｔａｂｌｅ　４　Ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｐｅａｋｓ，ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ＡＬＴ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｖａｌｕｅｓ（Ｒ）ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ
Ｒａｄｉｘ　Ｈｅｄｙｓａｒｉ　ｆｒｏｍ１０　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｇｒｅｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ　ｇｒａｄｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　ａｎｄ　Ｒ
Ｓａｍｐｌｅ
Ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｐｅａｋｓ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９
Ｒ
１　 ３６１３４０　 ６２１６２４　 １８１９４２　 １５４４３３　 ２３７５２３　 １２１２０４　 ６９５３９　 ２０４３３０　 １０７５８８　 ９７．２３
２　 ４４０９１５　 ８３０４１５　 ２２５９１６　 ８８８５５　 ７２２７２２　 ７７２５９　 ７６７１３　 ７０３２０　 １０７５９１　 ９０．０６
３　 ４３０６６８　 ８９６０３９　 ８５３５３　 ８４２１９　 ５４０１２０　 ６８８４５　 ５４８４１　 ５７２９３　 ９９４１９　 ７９．２１
４　 ２７４１１０　 ３８２６４７　 ５２０３６　 ８３２６０　 １０７９９２　 ２２７３３　 ４６９５３　 ４６７４９０３　 ５６３９４７　 ９４．４７
５　 ２５４３６６　 ２４８１８２　 １２７３８９　 １７９２７５　 ３１１２８２　 １００６１４　 ５２１０１　 １２５８２５　 ３８０４０７　 ３３．８２
６　 ２３９７２６　 ２０４８９２　 １３５１６５　 １６６０４１　 ３９１０８１　 ６５０２３　 ２００９８　 ５９２１６　 ４０１１３２　 ６６．７２
７　 ２６９４２１　 ５３３５５１　 １３７８００　 ２８７４７２　 ６８７９１０　 １３９５５４　 ４８９３７　 １０７０６１　 ５６２４９６　 ２０．０４
８　 １６０７４４　 ４８５４３０　 １８７０２２　 １５８７３６　 ５８６６３８　 １０３１４６　 ５９５４３　 １５４００５　 ４６０８９１　 ９５．５７
９　 ９４５５４１　 ７００３９２　 ３４０１５１　 １６７５８９　 ２７３３９４　 ７８４５７　 ３７６３９　 １８２９０７　 ８５８５４　 １５．９９
１０　 ３３１７０９　 ５８２５７０　 １３１４７８　 ４５４１４　 ２０６３７７　 ４９５１０　 ８７９０３　 ２００３７　 ２４５３１　 ６８．１９
ｔ／ｍｉｎ　 ６．３３８　 ８．０９０　 ９．８３３　 １１．０２１　 １３．９４２　 １７．７６８　 ２０．２９２　 ２１．５９７　 ２９．４９３
Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ　ｇｒａｄｅｓ　 ０．８７２７　 ０．８８６４　 ０．８７４４　 ０．８３４４　 ０．８７８３　 ０．８６８６　 ０．８９７０　 ０．７７６１　 ０．８２６２
药效与ＨＰＬＣ色谱峰之间的数理方程，以具体的数
学表达式综合反映了各成分对药效的重要性。
２．５．２　药效学实验
　　ＣＣｌ４ 已被广泛地应用于诱导动物肝纤维化模
型，在肝滑面内质网受微粒体细胞色素Ｐ４５０激活
后，分解成为活泼的三氯甲基自由基，进而与细胞膜
上的磷脂部分结合，产生脂质过氧化反应，引起细胞
器甚至细胞膜的变性和坏死，最终导致肝细胞坏
死［２２］。ＣＣｌ４ 亦可使钙离子水平增加，激活肝细胞膜
上的磷酸化酶，从而引起膜的脂质过氧化，导致肝细
胞膜损伤［２３］。ＣＣｌ４ 肝纤维化模型是一种经典的实
验研究模型，它能准确反映肝细胞功能、代谢及形态
学变化，重复性较好，而局限性在于实验动物的个体
差异，对于肝纤维化的反应不具有绝对的一致性，同
时给药途径、剂量、周期等对实验结果也有影响［２４］。
本实验以四氯化碳－花生油（４∶６，ｖ／ｖ）溶液造成小
鼠肝纤维化模型，选取有表征性的血清指标及肝重
指数全面评价药效，筛选有效给药提取部位时，测定
出乙醇提取部位的６个指标与模型组均有极显著性
差异（ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１）；以此为据开展后续实
验，测定１０批不同产地的红芪乙醇提取部位的６个
指标，实验结果亦良好，大部分指标显著性差异达到
ｐ＜０．０１，其药效在大批量样本的验证下得到充分
肯定，这才值得我们进一步探究其发挥药效的物质
基础。
　　柳姜冰等［１０］研究了红芪多糖对Ｄ－氨基半乳糖
所致的实验性肝损伤的保护作用，本研究则表明水
提醇沉的红芪多糖和乙醇提取部位对四氯化碳所致
的肝纤维化均有良好的保护作用，扩大了对红芪抗
肝损伤及肝纤维化的有效部位研究。
２．５．３　ＨＰＬＣ色谱条件优化
　　对色谱柱、流动相组成和配比、柱温、检测波长
等一系列色谱条件进行了优化。流动相曾使用甲
醇－水的组合，但得到的色谱峰容量少且分离度不
好，故而改用洗脱能力较强的乙腈与水的组合，检测
波长选择２６０　ｎｍ，结果峰容量大且分离度好。
３　结论
　　灰色关联度法和偏最小二乘法两种统计结果表
明，７号峰所表示的毛蕊异黄酮和２号峰所表示的
腺苷对药效的贡献最大，总体来看，各成分与药效的
关联都较大（＞０．８），可见红芪抗肝纤维化药效是各
成分共同作用的结果。毛蕊异黄酮及腺苷在指纹图
谱中看来含量较低，但却是发挥主要作用的药效物
质，而９号峰所表示的芒柄花苷虽然含量较高，但却
与药效关联程度不高，甚至在偏最小二乘中与药效
呈负相关，由此可见中药的复杂性。所以通过“谱效
相关”的研究，才能有效辨别红芪中真正发挥药效作
用的化学成分。本文鉴定了共有峰中的３个成分，
其余成分有待进一步鉴定。后续研究中本实验室将
分离纯化红芪中的活性成分，进行体内代谢研究及
体外细胞活性研究，从分子水平验证其与抗肝纤维
化疗效的相关性机理，更加全面地阐述红芪抗肝纤
维化的药效物质基础。
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