全 文 ：收稿日期:2007-09-27
基金项目:贵州省自然科学基金(2005.6 ～ 2008.6);贵州道地中药材独
蒜兰共生真菌研究(2005)2020号。
作者简介:杨友联(1975-),男 ,讲师 ,硕士研究生;主要从事微生物学
教学和研究工作。
通讯作者:刘作易 , E-mail:liuzuoyi@yahoo.com.cn。
独蒜兰菌根真菌对环草石斛生长的影响
杨友联 1.2 , 　刘作易 1 , 　朱国胜1 , 　毛堂芬 1
(1.贵州省农业生物技术重点实验室 , 　贵阳 550006;
2.六盘水师范高等专科学校 生物与地理科学系 , 　贵州 水城 553004)
摘要:选择分离自独蒜兰的 GN09等 6株菌根真菌与环草石斛组培幼苗共生培养。通过根切片观察证明 , 6株真菌都能
与环草石斛组培苗形成共生关系 ,但其菌根结构与自然条件下的菌根结构存在差异。共生培养条件下 ,在根外皮层细胞
中形成大量念珠状细胞 ,菌丝结较小。其中 4株菌株的处理苗的鲜重增长率高于对照;GN09、GN10和 GN43菌株的处
理苗增长率分别为 69.8%、61.9%和 81.7%,能显著地促进环草石斛生长 ,因此 ,该 3株菌根真菌对于环草石斛组培苗
的成功栽培具有实际应用价值。
关键词:　独蒜兰;环草石斛;菌根真菌;念珠状细胞
中图分类号:　S682.31;　S567　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2008)01-0034-04
EfectofMycorhizalFungiofPleioneBulbolodiodesRolfeonGrowthof
DendrobiumloddigesiRolfeSeedling
YANGYou-lian1.2 , LIUZuo-yi1 , ZHUGuo-sheng1 , MAOTang-fen1
(1.KeyLabofAgriculturalBiotechnologyofGuizhouProvice, GuizhouAcademyof
AgriculturalScience, Guiyang550006, China;
2.DepartmentofBiologyandgeography, LiuPanShuiteachers Colege, Shuicheng, Guizhou, 553004, China)
Abstract:TheefectofmycorhizalfungiofPleionebulbolodiodesRolfongrowthofDendrobiumloddigesi
Roflewereinvestigated.Theresultsindicatethatalofsixisolatescaninfectthegermfreeseedlingof
Dendrobiumloddigesianddevelopethemycorhizalstructureintheroots.Butitdiferfromthenaturalmycor-
rhizalstructure.Therearemanymoniliodcelsinexodermiscelsofsymbioticculturedroots.Atthesametime,
thefungalpelotoninthesymbioticculturedrootsissmalerthaninthenaturalroots.Foursingleisolatespro-
motedthegrowthoftheseedling.ThefreshweightincreaseofGN09 achieved69.8 percent, theGN43 is
81.7%, andtheGN10 is61.9%.Theperminationfreshweightissignificantlydiferentfromthecontrol
seedling.Itisofapotentialvalue, thatthesethreefungiareappliedtoDendrobiumloddigesiRoflecultiva-
tion.
Keywords:　Pleionebulbolodiodes;Dendrobiumloddigesi;mycorrhizalfungus;moniliodcels
　　兰科(ochidaceae)植物是与菌根真菌形成典型共
生关系的特殊类群 ,国内外学者对兰科植物内生真菌
进行 了 大量 研 究[ 1-3] 。 环草 石 斛 [ Dendrobium
loddigesiRolfe]是我国珍贵的药用兰科植物 ,具有生
津益胃 、清热养阴 、止咳润肺和抗血小板聚集之功效。
随着药用石斛的开发逐渐深入和广泛利用 ,需求量日
益增多 。由于自然繁殖力极低 ,生长缓慢 ,加之长期的
乱采滥挖 ,导致环草石斛资源日趋枯竭 ,被国家列为三
级濒危保护药用植物。同时 ,石斛组培苗移栽成活率
低 ,生长缓慢 ,难以规模生产 ,这与兰科菌根真菌有着
密切的关系[ 4] 。为此 , 选取分离自独蒜兰 [ pleione
bulbolodiodesRolfe]的菌根真菌与环草石斛无菌幼苗
共生培养 ,以期探讨菌根真菌的专一性 ,并筛选具有促
生作用的菌根真菌。为全面深入研究菌根真菌对兰科
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第 27卷　第 1期　2008年 1月　　　　　　 　　 　　　种　子　(Seed)　　　 　　 　　　　　　Vol.27　No.1　Jan.　2008
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2008.01.058
药用植物的促生机理和促进环草石斛的中药现代化提
供参考 。
1　材料和方法
1.1　材　料
1.1.1　供试植株
环草石斛组培苗及大棚盆栽苗由贵州省农业科学
院生物技术研究所提供。
1.1.2　供试菌株
菌根真菌分离自独蒜兰 ,经以苔藓为基质粗筛后
的 GN09、GN10、GN24、GN42、GN40和 GN43六株菌
株 ,经 PDA培养基 25℃暗培养活化备用。
1.1.3　培养基
兰花真菌共培养培养基(依据 Dijik和 Eck1995
改进)(μmol/L):
氯化钙 1.0 μmol/L,硫酸钾 1.0μmol/L,硫酸铁
100μmol/L,氯化锰 33μmol/L,钼酸钠 1.0μmol/L,硫
酸镁 0.5 μmol/L, 磷酸氢二钾 0.4 μmol/L, 硼酸 25
μmol/L,硫酸锌 2.8 μmol/L, Na2EDTA· 2 H2O140
μmol/L,淀粉 9 g/L,酵母膏 1 g/L, 琼脂 8.0 g/L, pH
6.0。
每组培瓶装量 40ml,灭菌后备用 。
1.2　方　法
1.2.1　移　栽
选取在 MS培养基上生长了 3个月的健康 、长势
较一致的环草石斛组培苗 ,无菌水洗净根附着的培养
基 ,无菌滤纸吸干水分 ,千分之一电子天平称重后移栽
入已灭菌的兰花真菌共培养培养基 ,每处理接种 4瓶 ,
每瓶 2株 ,每瓶接种材料鲜重 (0.24±0.02)g, 株高
(3.3±0.2)cm,根(4±2)条 。移栽后观察有无污染 ,
10天后用内径 0.5cm的打孔器打取经 PDA活化的菌
株 ,放到组培苗的根部 ,每处理重复 4瓶。打取同量
PDA无菌平板接入组培苗根部 ,作为对照。每周观察
1次 , (23±1)℃下 ,每天光照 14h,光照强度为 1 600
～ 2 000lx。培养 90天后收获培养物 ,测量并记录。
1.2.2　环草石斛根切片观察
将根洗净 , 徒手切片 , 棉兰乳酚油染色 , 利用
OLYMPUS(DP70)显微镜观察 、拍照 ,并增加野外采集
后盆载的环草石斛根切片作对照。
1.2.3　数据处理
采用 DPSv5.02Duncan法对鲜重增重率和株高增
高率进行统计分析。
2　结果与分析
2.1　菌根真菌对环草石斛幼苗生长的影响
各菌株在共培养培养基上都能生长 ,但菌落比较
稀疏。在共培养植株的茎和叶表面有稀疏的菌丝 ,根
表面的菌丝较多 。除与 GN40菌株共培养的植株死亡
一棵外 ,其余都生长正常 ,叶片及茎呈绿色 ,没有出现
病斑。对照生长正常 。测量统计分析结果如表 1所
示 。由表 1可知 , GN09、GN10、GN24和 GN43四株
菌株促进环草石斛生长。
表 1　独蒜兰菌根真菌对环草石斛生长的影响
菌株 鲜重(g)
株高
(cm)
90d
鲜重
增重
(g)
增重率
(%)
90d
株高
增高
(cm)
增高率
(%)
ck 0.23 3.5 0.29 0.08 34.4 4.2 0.8 22.5
GN09 0.24 3.4 0.41 0.17 69.8A 4.7 1.3 36.8A
GN10 0.25 3.3 0.41 0.16 61.9a 4.4 1.2 33.9a
GN24 0.22 3.1 0.35 0.12 55.6 3.9 0.8 24.2
GN40 0.24 3.2 0.29 0.05 21.7 3.7 0.6 18.3
GN42 0.24 3.1 0.28 0.04 18.7 3.8 0.7 21.0
GN43 0.24 3.5 0.43 0.20 81.7A 4.5 1.0 27.0
　　注:1、“A” (p=0.01);“a”(p=0.05)。
　　从鲜重增重率来看 ,四株菌株的处理苗分别为
69.8%、61.9%、55.6%和 81.7%,对照仅为 34.4%,
其中 GN09和 GN43菌株处理苗达极显著差异
(p=0.01), GN10达显著差异(p=0.05)。从增高率
来看 ,四株促生菌株也比对照高 ,其中 GN09菌株处理
苗达极显著差异(p=0.01), GN10达显著差异(p=
0.05),而鲜重增加最多的 GN43在株高上仅比对照
高 4.5个百分比 ,没有达显著性。 GN40和 GN42两
株菌株处理苗的鲜重和高增加率两个指标都低于对
照 。
2.2　菌根结构观察
环草石斛的根主要由根被 、皮层和中柱组成。空
白对照根皮层细胞中没有菌根结构 ,外皮层细胞呈多
边形 ,排列较规则 ,根被较薄(图 1)。盆栽植株根的皮
层细胞近圆形 ,同时根被较厚;在外皮层细胞中有许多
较大的菌丝结 ,极少有念珠状细胞 ,部分菌丝团处于被
消解的状态(图 2 ～ 3)。各菌株共培养的环草石斛根
的外皮层细胞亦近圆形 ,根较厚;外皮层细胞中也均发
现菌丝穿过细胞壁 、菌丝结等菌根结构;许多菌丝膨大
呈圆形或近圆形 ,形成念珠状细胞 ,部分念珠状细胞缠
绕成菌丝结 ,但菌丝结都比较小 ,部分菌丝结也处于正
被消解阶段(图 4 ～ 8)。菌丝膨大形成念珠状始于菌
丝刚进入定殖的细胞时 ,进入定殖的细胞后 ,菌丝的顶
端首先开始膨大 ,常能膨大至原菌丝的 2 ～ 3倍 ,具有
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研究报告　　杨友联 等:独蒜兰菌根真菌对环草石斛生长的影响
明显的横膈膜(图 6)。
3　讨　论
兰科植物与菌根真菌之间的专一性问题一直是争
论的焦点 ,相关报道较多 [ 1, 5, 6] 。但都是利用种子与各
种菌根真菌进行共生萌发实验 ,探讨种子和原球茎与
菌根真菌之间的关系 。本实验采用具有根和绿叶的能
进行光合作用的组培苗与分离自不同属的兰科菌根真
菌进行共生培养 。环草石斛属石斛属 ,岩石或树上附
生 ,海拔 400 ～ 1 500m,独蒜兰为独蒜兰属 ,地生或岩
石上附生 ,海拔 900 ～ 3 600m[ 6] 。二者生境存在一定
的差异 。从根结构上看 ,二者最主要的不同是 ,独蒜兰
的根表皮细胞分化形成根毛 ,没有根被;而环草石斛的
根表皮细胞老化加厚形成根被 ,没有根毛。在本实验
中使用了完全可控的条件 ,通过根切片观察 ,直观 、有
力地证明了供试的 6株独蒜兰菌根真菌能与环草石斛
的根形成共生菌根结构 。由此可见 ,这 6株独蒜兰菌
根真菌能与环草石斛形成菌根结构 ,无严格的专一性。
这与 Masuhara等在研究了种子共生萌发后提出的兰
科植物与菌根真菌之间的关系不是高度专一的相一
致 。引起我们注意的是 ,其菌根结构与自然条件下形
成菌根结构在形态上有一定的差异。野生兰科植物的
菌根结构已有很多报道 ,菌丝结较大 ,但均未观察到菌
丝膨大并形成念珠状结构 [ 3, 7 -9] ,在野生环草石斛根切
片中 ,菌丝团大 ,菌丝极少形成念珠状 。而在与供试菌
株单一共生时形成大量念珠状细胞 ,且部分缠绕形成
较小的菌丝结。这一现象可能由两个原因所致 ,一是
菌根真菌在感染特定的新宿主时 ,新宿主对其发生一
定的防御作用 ,二者相互作用的结果是进入皮层的菌
丝细胞形态发生了变化 ,部分菌丝细胞连续或间隔性
的圆形或近圆形膨大 ,呈念珠状 ,最终形成了和谐 、互
利的共生关系;二是单一菌根真菌感染宿主时 ,难以形
成较大的菌丝团 。 Kristiansen等通过单一菌丝团进行
分子鉴定的方法表明 ,即使是单一菌丝团也可能含有
在分类单元上不同的共生菌 [ 2] 。刑晓科 [ 10]等在研究
人工栽培铁皮石斛菌根的细胞学时亦发现 ,在皮层细
胞中的部分菌丝呈圆形膨大 ,菌丝结由膨大细胞构成 ,
这与本研究的结果颇为相似 ,但膨大菌丝极少形成念
珠状。
从促生作用来看 ,虽然 6株菌株都能与环草石斛
形成共生菌根结构 ,但仅有 4株菌株能促进环草石斛
生长。由此可见 ,并非所有能形成共生菌根的真菌都
能促进兰科植物生长 ,这些菌根真菌可能在兰科植物
生长发育的其他方面发挥其生物学作用。 GN40和
GN42两株菌株处理苗低于对照 ,可能是由于培养基
中的营养有限 ,真菌在生长消耗了部分营养物 ,从而影
响了植物的生长 。在 4株促生长菌株处理苗中 ,鲜重
增加最多的 GN43菌株处理苗的增高率最低 ,没有达
显著水平 ,而 GN09和 GN10两菌株的处理苗鲜重增
加虽低于 GN43菌株处理苗 ,但增高率高于 GN43菌
株处理苗 ,达显著水平 。据研究报道 [ 11, 12] ,部分兰科
菌根真菌能不同程度地产生一种或几种植物激素或维
生素促进植株生长 ,而不同激素在植物生长发育中的
作用机制不同 ,这可能是不同菌株处理苗在增重率和
增高率存在差异的原因。
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第 27卷　第 1期　2008年 1月　　　　　　 　　 　　　种　子　(Seed)　　　 　　 　　　　　　Vol.27　No.1　Jan.　2008
图 1　环草石斛组培苗根显微结构　　　　　　　　　　　　　图 2 ～ 3　环草石斛菌根显微结构　　　　　　　
图 1注:(空白对照)(标尺:200μm)(EP:表皮;EX:外皮层;EN:内皮层;VB:中柱;V:根被。)(下同)。
图 2 ～ 3注:(标尺:图 2:200μm;图 3:20μm)(PE:菌丝结;B:念珠状细胞;CW:细胞壁;PC:菌丝团间的菌丝连接;P:菌丝;
S:菌丝的横隔;BP:念珠状细胞形成的菌丝结。)(下同)。
图 4 ～ 5　环草石斛组培苗与独蒜兰菌根真菌 GN40共生 90d后根显微结构
(标尺:图 4:200μm;　　　　　图 5:20μm)
　图 6 ～ 7　环草石斛组培苗与独蒜兰菌根真菌 GN09共生 90d后根显微结构　　　　图 8　环草石斛组培苗与独蒜兰菌根真菌
　　　　　　　　　　　　(标尺:20μm)　　　　　　　　　　　　　　　　　　GN24共生 90d后根显微结构
(标尺:20μm)　　　　　　
《种子 》———给您收获的希望 !
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研究报告　　杨友联 等:独蒜兰菌根真菌对环草石斛生长的影响