全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod ResDev 2006 , 18:841-845
文章编号:1001-6880(2006)05-0841-05
　
　
　收稿日期:2005-09-29　　　接受日期:2005-12-16
　基金项目:广东省农业攻关项目(2004B20101004)
＊通讯作者 Tel:86-20-87237376;E-mai l:zjdtxj@163.com
微波辅助提取灰树花多糖工艺研究
唐小俊1＊ ,池建伟1 ,何焕清2 ,魏振承1 ,张　雁1 ,施　英3
(1.广东省农业科学院农业生物技术研究所 农业部功能食品重点开放实验室 , 广州 510610;
2.广东省农业科学院蔬菜研究所 ,广州 510640 ;3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 ,广州 510610)
摘　要:采用提取时间 、微波功率 、液料比的单因素试验和正交试验法优化微波辅助提取灰树花多糖条件。 结
果表明 ,以净多糖得率为指标 , 影响微波辅助提取灰树花多糖的主次因素为:提取时间 >微波功率>液料比 , 并
且提取时间和微波功率的影响达到了极显著水平。灰树花多糖最佳提取工艺条件为:提取时间为 10 min , 微波
功率为 80%(全功率为 800 W), 液料比为 25:1。创立了一种用苯酚-硫酸法测定多糖时排除蛋白质干扰的方法。
关键词:灰树花;多糖;微波;提取;蛋白质干扰
中图分类号:Q539;R284.2 文献标识码:A
Microwave-assisted Extraction Technology of Polysaccharides
from Grifla frondosa
TANG Xiao-jun1＊ ,CHI Jian-wei1 ,HE Huan-qing2 ,WEI Zhen-cheng1 ,ZHANG Yan1 ,SHI Ying3
(1.Institute of Agricultural Biology Technology , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Key Laboratory of Functional
Food , Ministry of Agriculture , Guangzhou 510610 , China;2.Vegetable Research Institute , Guangdong Academy of
Agricultural Sciences ,Guangzhou 510640 , China;3.The Sericulture&Farm Product Processing Research
Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou 510610 , China)
Abstract:The conditions of polysaccharides extraction from Grifola frondosa including extraction time , microwave power and
water/dry weight ratio were studied by single factor experiment and orthogonal design guided by the pure polysaccharides ex-
traction rate.The results show that the influencing level of every factors during extracting polysaccharides from Grifola frondosa
is as follows:extraction time > microwave power > water/dry weight ratio , and the influnces of extraction time and microwave
power were very notable.The optimum extraction conditions were as follows:10 min , 80%microwave power(full power is 800
W), 25:1(water/dry weight).A method was set up to remove the disturbances of protein on phenol-sulphate acid method dur-
ing measuring of polysaccharides.
Key words:Grifola frondosa;poly saccharides;microwave;extraction;disturbance of protein
　　灰树花(Grifola frondosa)属担子菌亚门 ,层菌
纲 ,无隔担子菌亚纲 ,非褶菌目 ,多孔菌属中的一种
大型真菌 ,又名千佛菌 ,莲花菌 ,贝叶多孔菌 ,舞茸
(日本)等[ 1] ,是一种珍贵的食 、药两用真菌 ,主要分
布在亚热带至温带森林中 ,在我国河北 、福建 、浙江
等地已在进行大量人工栽培。灰树花不仅富含大量
的营养物质 ,还含有重要的生物活性物质 —多糖 。
据农业部质检中心和中国预防医学科学院营养与食
品卫生研究所检验 ,灰树花干品中含蛋白质 32%,
其中含 18种氨基酸 ,总量近 20%,碳水化合物 50%
及多种维生素和微量元素 ,对改进食物构成 ,平衡营
养成分及提高机体对蛋白质的利用率具有重要作
用[ 2] 。近年来大量的化学和药理分析表明 ,灰树花
多糖具有明显的抗艾滋病病毒 、抗肿瘤 ,改善免疫系
统功能 ,调节血糖 、血脂及胆固醇水平 ,降血压等作
用 ,并对防止癌细胞的生成和转移 ,治疗艾滋病 、高
血压 、肥胖症 、糖尿病 ,以及免疫系统功能紊乱都有
很好的疗效 ,且无任何毒副作用[ 3] 。特别是其抗肿
瘤活性 ,日本医学专家用灰树花多糖进行抗肿瘤实
验结果表明 ,灰树花多糖的抑瘤率可达 86.5%,比
国际公认的抗癌新药香菇多糖抑制率高 32%[ 4] 。
因此 ,灰树花具有重要的医药保健价值 ,目前已被开
发成多种保健品 ,其中包括我国的保力生胶囊和维
吉尔胶囊 、日本的 MAIEXT 以及美国的 Grifron系列
产品。
DOI :10.16333/j.1001-6880.2006.05.033
目前对灰树花多糖提取技术的相关研究不多 ,
基本上是传统的热水提取技术 ,未见使用微波辅助
提取技术的报道 。目前微波技术应用于天然产物的
提取是一个新的领域 ,有关的应用报道虽然还不多 ,
但已有的结果表明微波辅助提取法比传统水提法相
比具有提高产率 、缩短提取时间 、节约能耗等优
点[ 5 ,6] ,因此具有很好的应用前景 。本研究通过对
微波辅助提取灰树花多糖工艺的研究 ,可为灰树花
多糖提供一种效率更高的提取方法 ,有助于更好地
开发灰树花资源 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
供试材料由广东省农业科学院蔬菜研究所提
供 ,烘干后粉碎 ,过 200目筛后备用 。牛血清白蛋白
购自 Sigma 公司;其它试剂均为国产分析纯;UV-
1700分光光度计:SHIMADZU CORPORATION;微波
炉:Galanz WD800B 型 , 800 W;旋转蒸发仪 N-1000:
TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.;TDL-5 型离心机:上
海安亭科学仪器厂;HH-4型数显恒温水浴锅:金坛
市富华仪器有限公司 。
1.2　试验方法
1.2.1　多糖微波辅助提取工艺
灰树花粉※加入蒸馏水※搅拌混匀※调 pH ※
微波处理※趁热过滤※离心去渣(4000 rpm ,15 min)
※真空浓缩※乙醇沉析※4 ℃静置12 h※离心(4000
rpm ,15 min)※沉淀用适量 80%乙醇洗涤两遍 ,再用
丙酮洗涤※真空冷冻干燥※灰树花粗多糖。
称取 10 g粉碎好的灰树花 ,置于 1000 mL 烧杯
中 ,加入一定量的蒸馏水并混匀 ,调 pH至 7.0 ,按各
种设定条件(提取时间 、微波功率 、液料比)进行微波
提取。微波提取过程为间歇微波处理 ,每次 2 min ,
中间停 1 min ,补加损失的水分使提取液体积保持相
对恒定 。处理完后将提取液过滤 ,按同样条件重复
提取 1次 ,合并提取液 ,用旋转蒸发仪浓缩到五分之
一体积 ,加入终浓度体积分数为 80%的乙醇 ,于 4
℃静置12 h ,离心收集沉淀 ,依次用无水乙醇 、丙酮
洗涤沉淀 ,真空干燥得灰树花粗多糖。
1.2.2　微波提取灰树花多糖的单因素实验
微波提取工艺的优化 ,主要包括提取时间 、微波
功率 、液料比几个主要因素。针对这几个因素 ,分别
在保持其它因素相同的条件下进行单因素实验 ,考
察各因素对灰树花净多糖得率的影响 ,选择最佳的
提取工艺条件。
1.2.3　多糖提取条件正交设计
为了进一步优化灰树花多糖的提取条件 ,根据
单因素试验的结果 ,选取提取时间 、微波功率 、液料
比作为考察因素 ,以灰树花净多糖得率作为考核指
标 ,每个因素拟定 3个水平(见表 1),选用 L9(34)正
交表[ 7] ,处理组合见表 1。
表 1　正交试验因素水平表
Table 1　Factors and levels of orthogonal test
水平
Levels
因素Factors
A
提取时间(min)
Extraction time
B
微波功率(%)
Microwave power
C
液料比(倍)
Water/ dry weight ratio
1 8 60 20
2 10 80 25
3 12 100 30
1.2.4　多糖的纯化
灰树花粗多糖依次用石油醚 、丙酮回流脱脂 ,挥
干溶剂后 ,溶于蒸馏水中 ,90 ℃加热至彻底溶解 ,制
成含粗多糖 5%的溶液 ,木瓜蛋白酶结合 Seveage 法
脱蛋白[ 8] ,然后用蒸馏水透析 72 h ,透析液减压浓缩
后 ,加入 4倍体积的无水乙醇 ,置冰箱 12 h ,离心分
离(4000 rpm ,10 min)沉淀 ,沉淀依次用无水乙醇 、丙
酮 、无水乙醚各洗两次 ,真空干燥至恒重 ,得灰树花
多糖精制品 。
1.2.5　葡萄糖标准曲线的制备[ 9]
精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品 20
mg ,置于 500 mL 容量瓶中 ,加蒸馏水溶解并稀释至
刻度 ,配成 0.04 mg/mL的标准溶液。然后精密移取
标准溶液0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、1.4 、1.6 、1.8 mL ,
置于带塞试管中 ,各以蒸馏水补充至 2.0 mL ,然后
加入6%重蒸苯酚 1.0 mL及浓硫酸 5.0 mL ,静止 10
min ,摇匀 ,室温放置 20 min 后于 490 nm 测光密度 ,
以 2.0 mL 水按同样显色操作作为空白 ,以吸光度
(A)对葡萄糖浓度(C)作回归处理 ,得回归方程:
A=0.0631C-0.026 , R=0.9992
1.2.6　多糖换算因子的测定
精密秤取干燥至恒重的灰树花多糖精制品 20
mg ,置于 200 mL容量瓶中 ,加适量蒸馏水加热至 90
℃彻底溶解 ,冷至室温后定容至刻度 ,摇匀 ,作多糖
储备液 。
吸取多糖储备液 0.5 mL 于带塞试管中 ,加蒸馏
水至 2 mL ,按测定标准曲线的方法测其吸光度 ,按 f
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=W×103/C·D计算换算因子 ,W为多糖重量(mg),
C为多糖中葡萄糖的浓度(μg/mL),D为多糖的稀释
倍数。做平衡实验 3次 ,求其平均值。测得灰树花
多糖换算因子 f=1.378。
1.2.7　多糖测定与净多糖得率计算
多糖测定:粗多糖研磨 ,过 60目筛 ,取 40 mg 溶
于适量热蒸馏水中 ,冷至室温后定容至 500 mL ,用
苯酚-硫酸法[ 7]测定多糖含量 。
测定多糖含量时对蛋白质干扰的纠正:先精确
称取一定量的粗多糖 ,配成适当浓度的溶液 ,按一定
比例稀释 ,计算出各稀释液中粗多糖总量 ,并测出吸
光度 A粗。用 Bradford法[ 10]测出各稀释液中蛋白质
含量并算出总量 ,再把各稀释液中粗多糖总量减去
相应稀释液中蛋白质总量 ,便得到减去了蛋白质的
多糖量 ,再用精制的多糖配成对应浓度的多糖液 ,测
出 A精 ,用 A粗减去A精 可得蛋白质产生的A蛋白。我
们发现 A蛋白与蛋白质含量存在一定的线性关系 ,可
建立回归方程。那么测定多糖时 ,只要先测出蛋白
质含量 ,便可根据回归方程算出蛋白质干扰产生的
A蛋白值 ,再把待测的多糖液 A粗减掉A蛋白值便可真
实得测得多糖的吸光度。
净多糖得率(%)=C·D·f·W1/(40×W×103)
×100%,式中 C —从回归方程求得的葡萄糖浓度
(μg/mL);D—稀释倍数;f —多糖换算因子;W1 —粗
多糖总重(g);W —灰树花重量(g)。
1.2.8　传统水提法
称取灰树花粉50 g ,加蒸馏水1500mL ,调 pH 至
7.0 ,100 ℃浸提4 h ,浸提过程中保持恒定的浸提液
体积 ,趁热过滤 ,收集滤液 ,按同样条件重复提取一
次 ,合并滤液。滤液按微波辅助提取法同样的步骤
进行离心 、浓缩 、乙醇沉析 、干燥及净多糖得率的测
定。
2　结果与讨论
2.1　单因素实验
2.1.1　微波处理时间对净多糖得率影响
按不同的处理时间 ,液料比为 25:1 ,微波功率
为全功率的 80%的条件辅助提取多糖并测定净多
糖的得率 ,结果如图 1所示 。
由图 1可知 ,在前 10 min期间提取时间对灰树
花净多糖得率有较明显影响 ,净多糖得率随提取时
间延长而增加 ,并在 10 min时达到最大值 。这是由
于微波不仅具有快速均匀的加热功能 ,还能因促使
试验材料的细胞膜破裂而加速多糖分子对基体的渗
透和溶解 ,使多糖被快速释放出来[ 11] ,所以净多糖
提取率随微波提取时间延长而上升得比较快。但随
着时间的延长 ,多糖扩散作用减慢并逐渐达到平衡 ,
而多糖得率不再增加。根据本实验结果 ,微波处理
时间宜选择 10 min较合适。
图 1　微波处理时间对多糖得率影响
Fig.1　Effect of microwave extracting time on the polysaccha-
rides extraction rate
2.1.2　微波处理功率对净多糖得率影响
按不同的微波功率 ,处理时间为 10 min ,液料比
为 25:1的条件辅助提取多糖并测定和计算净多糖
的得率 ,结果如图 2所示 。
由图 2可知 ,净多糖得率随微波功率增加而不
断增加 ,并在 100%微波功率时达到最大值 , 但在
80%微波功率后 ,增加速度明显减缓。由于随着微
波功率增加 ,提取体系吸收转换的能量增加 ,促进了
多糖分子的溶解和扩散 ,并且微波功率的增加也直
接促进了多糖分子的溶解和对物料的渗透 。当微波
功率达到一定值时 ,多糖分子的溶解和扩散作用逐
渐达到平衡 ,净多糖得率不再增加。
2.1.3　液料比对净多糖得率影响
按不同的液料比 ,处理时间为 10 min ,微波功率
80%的条件辅助提取多糖并测定和计算净多糖的得
率 ,结果如图 3所示 。
结果如图3所示 ,随着液料比加大 ,灰树花净多
糖得率不断增高 ,并在液料比 30:1时达到最大 ,不
过当液料比达到 25:1后 ,增速减缓。生产时可以采
取 30:1的液料比 。
2.2　正交试验
正交试验方差分析结果表明(表 3),提取时间 、
微波功率 、液料比在灰树花多糖提取中影响不同 ,其
中提取时间和微波功率的影响达到了极显著水平 ,
而液料比的影响较小。根据表 2的正交试验极差分
析 ,可以判断出影响灰树花多糖提取诸因素的主次
关系依次为提取时间(A)>微波功率(B)>液料比
843Vol.18 唐小俊等:微波辅助提取灰树花多糖工艺研究 　
(C)。表2结果也显示 ,因素 A以第 2水平最好 ,因
素B以第2水平为最好 ,因素 C以第 2水平为最好 ,
最佳组合为 A2B2C2 ,即提取时间为 10 min ,微波功率
为全功率的80%,液料比为 25:1。
正交试验得到的结果与单因素试验得到的结果
有些不同 ,以正交试验的结果作为最佳条件。
按正交试验得到的最佳提取条件试验三次 ,灰
树花净多糖得率分别是 11.05%,10.96%,10.65%,
平均值为 10.89%。
图 2　微波功率对多糖得率影响
Fig.2　Effect of microwave power on the polysaccharides extrac-
tion rate
图 3　液料对比对多糖得率影响
Fig.3　Effect of water/ dry weight ratio on the polysaccharides
extraction rate
2.3　微波辅助提取与传统水提法的比较
分别用按正交试验法得到的最佳微波辅助提取
条件和传统水提法对灰树花多糖进行提取 ,然后比
较此两种方法净多糖的得率 ,结果见表 4。
从表 4可知 ,微波辅助提取法与传统水提法相
比 ,提取时间缩短至二十四分之一 ,所得净多糖产率
也有一定的提高。这是由微波所具有的高频特性 、
热特性及生物效应几大特点所致[ 11] 。一方面 ,高频
微波促使样品中偶极分子旋转而导致弱氢键破裂及
离子迁移 ,加速了多糖对样品的渗透 ,并使多糖很快
溶解;另一方面 ,微波是一种高频波 ,它使提取体系
中偶极分子因高速旋转产生高频率摩擦 ,从而可在
短时间内产生极大的热量 ,使整个样品同时被加热 ,
从而大大加快了多糖的溶解;第三方面 ,微波具有生
物效应 ,微波会引起样品细胞膜破裂 ,加速了多糖从
细胞中释放出来。
表 2　正交试验结果
Table 2　Results of orthogonal experiment
试验号
No. A B C
净多糖得率(%)
Net polysaccharides ext raction rate
I II III 合计 sum
1 1 1 1 7.32 7.86 7.13 22.31
2 1 2 2 9.51 9.58 9.37 28.46
3 1 3 3 9.63 9.31 9.52 28.46
4 2 1 2 9.96 9.51 9.81 29.28
5 2 2 3 10.31 10.21 10.61 31.13
6 2 3 1 10.73 10.68 9.80 31.21
7 3 1 3 8.98 9.34 8.81 27.13
8 3 2 1 9.73 9.95 9.53 29.21
9 3 3 2 9.51 9.36 9.82 28.69
K 1 79.23 78.72 82.73
K 2 91.62 88.80 86.43
K 3 85.03 88.36 85.83
k1(平均) 26.41 26.24 27.58
K 2(平均) 30.54 29.60 28.81
K 3(平均) 28.34 29.45 28.61
R 4.13 3.36 1.33
表 3　正交设计方差分析
Table 3　Variance analy sis of orthogonal experiment
变异来源
SV
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F值
F value
显著性
P
SA 8.54 2 4.27 18.23 ＊＊
SB 7.21 2 3.61 15.40 ＊＊
SC 1.10 2 0.55 2.35 -
SE 4.22 18 0.23 2.35 -
表 4　姬松茸多糖提取中微波辅助提取法与传统水提法效
果对比
Table 4　Comparison of microwave-assisted method and traditional
method during extraction of polysacccharides from Grifola
frondosa
提取方法
Extraction method
液料比
Ratio
提取时间
Time(min)
净多糖得率(%)
Net polysaccharides
extraction rate
微波辅助提取
Microwave-assisted extraction 30 10 10.89
传统水提法
Traditional extraction
30 240 10.08
　　综上所述 ,将微波辅助提取法应用于灰树花多
糖的提取上 ,可以大大提高生产效率 ,节约能源和成
本 ,是一种具有广阔应用前景的多糖辅助提取技术。
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