全 文 ：第 22 卷第 2期
2 00 3年 3月
无 锡 轻 工 大 学 学 报
J o u rn a l o f W u x i U n i v e r s i t y o f L i g h t I n d u s tyr
V o l
.
2 2
M
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.
No
.
2
20 03
文章编号 : 1009 一 o 38x (2 00 3 ) 02一 00 75一 0 4
硫酸醋化灰树花多糖的制备与分析
史宝军 , 许正宏 , 敖宗华 , 孙志浩 , 陶文 沂 `
( 江 南大学 生物工程学院 , 江 苏 无锡 2 14 0 3 6)
摘 要 : 利用碱提酸沉淀 法从灰树花 ( G r ifo al 介 o n do as )发酵 菌丝体 中获得碱提水 不溶性 多糖
G A P
,氛磺酸一咄吮 法对 G A P 进 行硫酸化修 饰后 , 即制得能溶 于 水 的硫 酸化 灰树花 多糖 . 通过
D E A E
一
se p ha or
s e F
.
F
. 离子交换柱层析精制 为一 种相 对分子 量为 2 . 8 x 10 4 , 硫 酸基质量分数 为
16
.
4 % 的硫酸醋化灰树花多糖 ( S - G A )P . 琢 脂糖电泳显示 , S一G A P可被 甲 苯胺蓝染 色且着 色较深 .
S
一
G A P的紫外光 谱和 红外光谱分析表 明 , 在波长 2 0 8 , 2 6 4 , 2 6 8 , 2 8 6 n m 以及 波数 1 2 3 0 c m 一 ` 、
8 10 。 m 一 `处有硫酸醋键的特征吸收峰 .
关键词 : 灰树花 ; 水不溶性多糖 ; 多糖硫酸化
中图分类号 : Q 5 39 文献标识码 : A
P r e P a r a t i o n a n d A n a l y s i s o f G r ifo l
a
fr
o n d o s a P o l y s a c e h a r i d e S u l af t e
S H I Ba-o j
u n , X U Zh e n 兮 h o n g , A O Z o n g 一 h u a , SU N Z h i一 h a o , T A O W e n 一 y i
( S
e
h ol of B i
o t e e h n ol o g y
, 乳 u t h e r n Y a n g tz e U n iv e sr i t y , W u x i 2 1 4 03 6 , C h in a )
A b s t r a e t : W a t e -r in so l u b le p o l y s a e e h a r id e G A P w a s e x t r a e t e d w i t h Z% N a O H for m t h e m y e e l i a o f s u b
-
m e r g e d f emr
e n t a t io n o f g
r
ifo l
a fr o n d o sa
.
5
一
G A P
, a k i n d o f g o d w a t e r
一 s o l u b l e s u l fa t e d d e r iv a t i v e
,
w a s
o b t a i n e d f or m s u laf t i n a l m o d i f i e a t i o n o f G A P w i t h e h lo or s u lfo n ie a e id
一
P y r id i n e
, a n d p u r i f i e d b y D E A E
eS P h
a r
os
e F
.
F
.
io n e x e h a n g e e h r o m a t o g r a p h y
.
I t s s u l f u r e o n t e n t w a s 1 6
.
4 % a n d a v e r a g e m o le e u la r
w e i g h t w a s 2
.
8 X 10 4
.
T h e r e s u lt s o f a g a or s e e l e e t r o p h o r e s i s s h o w e d t h a t s
一
G A P e o u ld b e d e e p l y
s t a i n e d b y t o lu i d i n e b lu e
.
T h e U V a n d I R s p e e t r u m o f S
一
G A P s h o w e d t h a t e h a r a e t e r is t i e a b s o r P t i o n s o f
s u lf a t e e s t e r b o n d w e r e a t w a v e l e n g t h o f 2 1 8 n m
,
2 64 n m
,
2 6 8 n m
,
2 8 6 n m a n d 1 2 3 0 e m
一 1 , 8 10 e m
一 1
r e s p e e t i v e l y
.
K e y wo
r d s : G r ifo al fr
o n
do as ; w
a t e -r i n s o l u b le p o l y s a e e h a r id e ; 卯l y s a e e h a r id e s u lf a t e
灰树花 ( G r ifo al f) ’o n do as )属担子菌亚门 , 多孔
菌科 , 是一种营养丰富 , 生物活性物质含量高的珍
贵覃菌 . 灰树花多糖具有明显的抗肿瘤 , 抗 H l v 病
毒 ,改善免疫系统功能 ;调节血糖 、血脂及胆 固醇水
平 , 降血压等作用 ;对防止癌细胞 的生成和转移 , 艾
滋病 、高血压 、肥胖症 、 糖尿病以及免疫功能的紊乱
都有一定的疗效 ;且无任何毒副作用〔` ]一些食药
用真菌的天然多糖通过硫酸酷化得到 了用途更为
广泛的多糖衍生物 , 如硫酸醋化的香菇多糖具有良
好的抗 H l v 活性 2[] ;硫酸醋化的虎奶菇多糖具有较
强的抗氧化作用 〔3 〕 .
灰树花发酵菌丝体经碱提 、 乙酸 中和 、 离心 , 上
收稿日期 : 200 2 一 11 一 07 ; 修回 B期 : 2 002 一 12 一 0 6 .
作者简介 : 史宝军 ( 1973 一 ) , 男 , 青海西宁人 , 发酵工程博士研究生一 为通讯作者 .
7 6 尤 锡 径 工 大 宇 宇 才陡 第 2 2卷
清液为碱提水溶性多糖 , 沉淀为水不溶性多糖 , 后
者不溶于水 , 无法制成注射液 , 影响进一步的药理
研究 . 作者通过硫酸醋化 , 将碱提 水不溶性 灰树花
多糖制成了溶于水的硫酸化多糖 .
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 菌株 G F 9 8 01 由江南大学生物工程学院生
物制药研究室提供 .
1
.
1
.
2 灰树花深层发酵 按照文献〔4 」介绍的方法
制备灰树花菌丝体 .
1
.
2 试剂
D E A E S e p h a or
s e F
.
F
. 、
B lu e D e x t r a n 2 0 0 0
、
D e x t r a n T 5 0 0
、
D e x t r a n T I 10
、
D e x t r
a n T 7 0
、
D e x t r a n
4T 0
、
D e x t r a n ,2T 0
、
D e x t r a n T 10 均为 P h a r m a e i a 产
品 ;明胶为 Am er cs o 产 品 ;其余试剂均为 国产分析
纯 .其中 , 毗叹和 甲酞胺用前分子筛 S A 型脱水 .
1
.
3 仪器
U 一 30 0 紫外可见 扫描 仪 : 日立 公 司 产 品 ;
C 9S 30 1 ( P )C S 型双波长飞点扫描仪 : 日本岛津 ; 75 2
紫外可见分光光 度计 : 上海 精密科学仪 器有 限公
司 ; D Y Y 一 nI 一 4 型稳压稳流 电泳仪 : 北京市六一仪器
厂 ;美国 N ce iol 5t D x B 傅立叶变换红外光谱仪 .
1
.
4 硫酸醋化灰树花多糖的制备
灰树花发酵菌丝体经热水 ( 80 ℃ )提取 , 反复多
次 , 直至苯酚 一 硫酸法检测无多糖 . 剩余残渣用质量
浓度 2 酬id J N a 0 H , 4 ℃ , 过夜提取 , 离心 , 上清液用
冰醋酸中和 , 产生大量白色沉淀 , 重复 3 次 , 合并沉
淀 ,经水 、 丙酮 、 乙醚洗涤 , 真 空干燥 . 用 0 . 05 mo l / I _
N a O H 溶解干粉 , 离心 , 上清液加入 4 倍体积的 95 %
乙醇沉淀多糖 , 过夜 , 离心收集白色沉淀 , 真空干燥 ,
得到灰树花菌丝体碱提水不溶性多糖 “ G AI 〕 , , .
醋化试剂的制备 : 按照文献仁s] 的方法 , 稍加改
进 . 10 m l碑 无水毗吮置于反 应瓶中 , 经冰盐浴冷却
后 , 剧烈搅拌下 , 缓慢滴加 4 m I J 氯磺酸 , 继续搅拌
30 m in
, 密封后置于低温冰箱备用 .
将 G A P 悬浮于 35 m I J 无水甲酞胺中 , 然后逐
渐加入醋化试剂 , 45 ℃下搅拌反应 2 一 4 h , 反应结
束后 , 2 . 5 m ol / L N a O H 中和 , 流水透析 3 d , 蒸馏水
透析 l d , 浓缩 , 加无水 乙 醇沉淀多糖 , 得到硫酸酷
化衍生物 . 将该衍生物加到 D E A E S e p h a r o s e F . F ·
阴离子交换柱上 , 先用蒸馏水洗 , 后用 0 一 1 . s m ol /
L N a CI 梯度洗脱 . 苯酚 一 硫酸法检测多糖 , 仅有一
个主要洗脱峰 , 收集 , 充分透析 , 冷冻干燥得到硫酸
化衍生物 : S一 G A .P
1
.
5 理化性质测定
多糖测定 : 苯酚 一硫酸法仁“ 〕 ; 还原糖测定 : 3 , 5 一二
硝基水杨酸法〔“ ;l 硫酸基含量测定 : aB lCz 一明胶浊度
法 [6〕 ,取代度公式 : d . s = ( 1 . 6 2 义 s ) / ( 3 2 一 l . o Z X S ) .
1
.
6 纯度鉴定及相对分子质量测定
1
.
6
.
1 高压液相 色谱 将多糖配制成 20 m g / m L
的溶液进样 . 采用 u l t r a h y d r o g e l l i n e r ( 7 . 8 m m X 30 0
m m )色谱柱 , 双柱 串联 , 示差折光检测器 , 流动相为
o
.
l m o l / I
J
N a N O 3 溶液 , 体积流量为 0 . g m L / m in ,
柱温 45 ℃ , 进样量 20 可 J , 记录样品色谱曲线 .
1
.
6
.
2 相 对分子质量测定 完全按 H PI 刃 测定纯
度时的相同条件 , 将相对分子质量分别为 T 5 0 0 ( 4 8 2
0 0 0 )
,
T l 10 ( 1 10 0 0 0 )
,
T 7 0 ( 7 0 0 0 0 )
,
T 4 0 ( 4 0 0 0 0 )
,
T Z o ( 2 1 6 0 0 0 )
,
T I O ( 1 0 0 0 0 )的标准 D e x t r a n 相继进
样 , 记录各 自的保留时间 R T . 待测样品相同条件进
样 , 得到多糖相对分子量 .
1
.
7 琼脂糖电泳
用 0 . 0 6 m o l / xJ 巴比妥缓冲液 ( p H 8 . 6 )配置成
1 9 / dI
一 琼脂糖溶 液制板 , 电压 巧 o v , 电泳 1 . 5 h,
0
.
1 9 d/ I
J 甲苯胺蓝溶液染色 . 完全脱色后 , 进行双
波长扫描 v[] .
1
.
8 光谱学鉴定
紫外扫描的样 品质量浓度为 1 9 / dI J 的水溶液 ,
扫描范围 1 90 一 30 n m . 红外光谱为嗅化钾压片 , 测
定范围为 4 0 0 0 一 4 0 0 e m 一 ` .
2 结果与讨论
2
.
1 5
一
G A P 分离纯化结果
灰树花菌丝体通过热水提取 , 剩余残渣碱提酸
沉淀 , 所得多糖硫酸化后 , 经过 D E A E s叩ha or s e F .
F
. 柱层析 , 主要分离得到 了一种多糖 , 即 S 一G A (P 图
1)
,
S
一
G A P 经高压液相色谱测定呈单一对称吸收峰
(图 2) , 表明 S 一G A P 是 一纯多糖 . 经 H P L C 测得 S -
G A P 的相对分子质量为 2 . 8 义 1 0 4 (图 3 ) .
0
.
s r
0
.
4
宫 0
.
3
侧
0
.
2
0
.
1
3 0 5 0
洗脱管序号
图 1 5· G A P 的皿 A E s印 h a r os e F . F . 柱层析
F ig
.
1 C h r o m a tgo
r a Ph y o f s
一
G A P o n D E A E S eP h a osr
e
F
.
F C o l u m n
第 2 期 史 宝军等 :硫酸醋化灰树花多糖的制备与分析
10 54 1 2
.
3 G A P 的硫酸醋化条件及结果
多糖的硫酸酷化 反应是在路 易斯碱溶液 中由
s O 3H
十取代多糖经基中的 H 十 , 经中和得到硫酸醋
盐 (图 5) .
>ull子田
15 2 0
保 留时间 /m in
图 2 .s G A P 的高压液相色谱
F ig
.
2 H P L C o f s
·
G A P
一。 一
}不忍 )、 。 } 一}n二赵乡 、 }
}
H乱戈升味 .卜坐竺旦2耸 1“二。` 峨峨 1盆5 } ” 0 6干n Z , N a O H } Sb , N · 尸叶·
r l ’ S O
3
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T 5 0 0
\ 卫 T 1 1 0
T 7 0日石1, 4 0
T 2 0氏 T 10
`翔妙
12 14 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4
保留时间/ m in
图 3 .s G A P 的相对分子质 t 测定
F i g
.
3 D e te r m i n a t io n o f s
·
G A P M o le e
u la W
e igh t b y
H P L C
2
.
2 琼脂糖电泳结果
从电泳图谱 (图 4) 可以看到非常明显的深蓝紫
色斑点 , 于广利等指出 8[] , 样品凝胶色泽的深浅与
样品分子中含有的负电荷尤其是硫酸基含量 的多
少有关 , 硫酸基含量越高 , 凝胶 着色越深 . 由于本文
采用的是碱性琼脂糖电泳系统和甲苯胺蓝显色剂 ,
只有酸性多糖才能泳动和染色 , 故说明 GAP 已被
硫酸醋化 , 且硫酸根含量较高 . 经双波长扫描 , 呈单
一峰 , 说明 S 一 G A P 是均多糖 .
图 5 多糖硫酸醋化的反应方程式
F ig
.
5 P o l y s a c h ar id
e s u l af t e w i t h c h I 0 r OS u lfo n ie a c i d
S
一
G A P 为白色粉末 , 糖质量分数为 52 . 8 % , 硫
质量分数为 16 . 4 % , 取代度为 1 . 74 . 多糖硫酸化 的
方法有多种 , 氯磺酸 一毗咤法试 剂简单易得 , 反应条
件相对简单 , 产物回收方便 , 是最理想的一种方法 .
控制反应温度 , 不同反应时间以及不同比例的醋化
试剂 , 可 以得到取代度不 同的硫酸醋化多糖一般
来讲 , 高温 、 氯磺酸 比例高 , 反应 时间长 , 产物取代
度高 . 但是 , 高温会造成多糖结构破坏 , 经预实验表
明 , 高温 ( 10 0 ℃ )条件下 , 反应结束后 , 经 D N S 法测
得还原糖含量较高 , 因此 本实验将 温度 固定在 45
℃ . 提高氯磺酸的 比例 , 氯磺酸 一毗咤盐 (淡黄色 固
体 )生成增多至出现板结 , 搅拌困难 , 加入无水 甲酞
胺可溶解 . 高比例的磺化试剂 , 多糖易被酷化 , 取代
度高 , 但产率低 , 可能是由于反应液酸度过高 ( p H <
1 )引起多糖降解 . 采用较 温和的条件 , p H 4 一 5 , 收
率和取代度较 为理想 . 本实验 产物得率 为 82 . 7 %
( d
.
5 = 1
.
7 4 )
.
2
·
4 -S G A P 的光谱学鉴定结果
紫外光谱在波长分别为 21 8 , 264 , 2 68 和 2 86
n m 有一 S 一O 一和 一 5 0 3 的吸收 . G A P 的红外光谱 (图 6)
和 S 一G A P 的红外光谱 (图 7) 显著不同 , S一 G A P 除 了
多糖母体特征 吸收峰得以保留外 , 还增加 了 1 2 30
c m
一 `左右的吸收 , 表 明为 0 5 0 3 一 的 s = O 伸缩振
动 , 8 10 c m 一 `左右 的 吸收表 明为 G O 一 s 的拉伸振
动 ,这些是硫 醋键 的特征 吸收峰 ; 同时 , 还 可以看
出 , s 一 G A p 在 3 40 0 。m 一 `附近的经基吸收峰有所降
低 , 表明部分羚基已被醋化 , 以上充分说明多糖已
形成硫酸酉旨.
3 结 论
图 4 5· G A P 的琼脂箱电泳
F ig
.
4 A g a r os e e l e e t r o Ph o r es i s o f s
·
G A P
研究表明 , 以灰树花发酵菌丝体为原料 , 经碱
提酸沉淀 , 得到了水不溶性 多糖 , 该多糖经硫酸酷
化后水溶性得到 了很好的改善 , 为进一步研究其生
物活性带来了方便 . 多糖硫酸化常用的方法有三氧
78 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 2 2 卷
化硫 一毗吮法 , 浓硫酸法 , 氯磺酸一毗吮法 9[] . 其中氯
磺酸一毗陡法试剂简单易得 , 反应条件相应地简单 ,
产物 回收方便 , 收率和取代度均较理想 , 因此 , 该法
是多糖硫酸化最理想的一种方法 . 所得硫酸化多糖
S
一
G A P
, 硫酸基质量分数为 16 . 4% , 取代度为 1 . 74 ,
相对分子量 为 2 . 8 x 10 4 . 红外 光谱显示 , 在波数
1 2 3 0 c m
一 `和 8 1 0 。 m 一 `处出现硫酷键的特征吸收
峰 , 表 明多糖 已形成硫酸醋 . S GAP 的生物活性有
待进一步研究 .
691534691”45
,了Qù门、,ù
岁食并来姻
,口Où内,à,`
食岁并散喇
07
,
201图.g73iF
2 1 l e
. ~
4 0 0 0 2 4 0 0 1 6 0 0 8 0 0
波如 c m 一 l
2 1 L es es -
4 0 0 0 2 4 0 0 1 6 0 0 8 0 0
波数c/ m 一 ’
G A P 的红外光谱
IR s eP
e t r u m o f G A P
S
_
G A P 的红外光谱
I R s P e e t r u m o f s
·
G A P
0朽620图i.g
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(责任编辑 : 杨 萌)