全 文 ：第 12卷 第 4期
2 0 0 4年 1 0月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
vOI．12 NO．4
0ct．． 2004
抗线虫基因表达载体构建与转化甘蔗研究初报
陈平华 许莉萍 陈如凯
c 磊 福州3soo2， 、农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室 ⋯” ⋯⋯
摘 要 试验研究利用德国引进的抗线虫基因 I-Is1 pro一1构建表达载体并转化甘蔗(Saccharum officinarum L．)，
以获得抗线虫转基因植株。提取克隆载体 P1832用 Nco I酶切 、Klenow补平和 Sac I酶切 ，回收基 因片段；提取表
达载体 pBIL-1用 Kpn I酶切 、T4 DNA polymerase补平和 Sac I酶切，回收大片段；目的片段用 T4 DNA ligase连接
并转化 E．coli，鉴定重组质粒；用基因枪轰击转化甘蔗品种“ROC”16获得 16株再生苗，其中4株经 PCR检测呈阳
性，通过 Southern杂交，证明 Hs1 pro一1基因已整合到其中3株甘蔗基因组中。
关键词 抗线虫基因 表达载体构建 基因枪轰击 甘蔗
Construction of expression vector of nematode—resistant gene and transformation of sugarcane．CHEN Ping—Hua．XU
Li—Ping，CHEN Ru—Kai(Institute of Sugarcane，Fujian Agricultural and Forestry University；Key Lab of Eco—physiology
and Genetic Improvement for Sugarcane，Ministry of Agriculture，Fuzhou 350002)，CJEA，2004，12(4)：57～59
Abstract The expression vector of H 1 pro一1 of nematode-resistaht gene cloned by the Germany scientists was con—
structed and transform ed into sugarcane tO get the transgenic plants．The cloned vector P1832 was digested with restric—
tion nuclease Nco I．DNA polymerase I Large Fragment and Sac I in order．The short fragm ent was purified．Expres—
sion vector pBIL-1 was digested with Kpn I，blunted with T4 DNA polymerase and digested again with Sac I．The
large fragment was isolated．The short fragm ent of P1832 was ligated with the large fragment of pBIL一1 by T4 DNA、li—
gase and the reactant was transferred into E．coli．The recombinant plasmid was identified and transformed into sugarcane
genotype“ROC”16 via particle bombardment．Sixteen kanamycin—resistant sugarcane seed lings were obtained and four
seedlings were positive by PCR，of which three were proved tO be transgenic plants by southern blot．
Key words Nematode resistance gene，Construction of expression vector，Particle bombardment，Sugarcane
线虫(Heterodera avenae)侵入或取食甘蔗幼嫩根尖，造成根尖畸形或侧根消失，使植株丧失吸收功能而
变黄甚至萎焉死亡。传统采用土施农药防治线虫，成本高且严重污染环境。本研究利用德国引进的抗线虫
基因 Hs1 pro一1 ，通过基因枪轰击法 ¨ 获得转基因甘蔗植株，使甘蔗 自身获得线虫病抗性 ，为降低甘蔗
生产农药使用量寻求有效途径 。
1 试验材料与方法
供试甘蔗材料为引进优良品种“ROC”16，取自福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放
实验室农场。由德国引进含有 Hs1 pro一1基因的克隆载体 P1832，载体大小约 4kb，Hs1 pro一1长 1．4kb，植
物表达载体 pBIL一1大小约 12kb，含有玉米泛激素 UBI启动子、1个外源基因(Lfy)、胭脂碱合成酶基因终止
子和 NPTI／选择标记基因，克隆载体和表达载体的宿主菌为 DH5a。pBIL一1和菌株由中国热带农业科学院
热带作物生物技术国家重点实验室提供。本研究所用限制性内切酶购 自华美生物工程公司，其他工具酶和
DNA纯化回收试剂盒及合成特异引物由上海生物工程公司提供 ，基因枪 PDS一1000／He、金粉、可裂膜、载体
膜等为 Bio—Rad公司产品，DIG DNA Labeling and Detection Kit(Cat．No．1093657)为Roche公司产品，常规
药品均为分析纯。表达载体构建流程按图 1设计，细菌生长培养基为 LB，质粒提取与纯化采用碱裂解法⋯。
根据 P1832上基因片段两端单一酶切位点 Nco I、Sac I和 pBIL一1上单一酶切位点 Kpn I、Sac I进行酶切
鉴定。提取克隆载体 P1832，用 Nco I酶切、Klenow补平和 Sac I酶切，回收基因片段；提取表达载体 pBIL一1
*国家自然科学基金项目(39870545)、国家高技术发展(863)计划项目(2001AA241191，2002AA241031)共同资助
收稿 El期：2003·09—20 改 回El期：2003·10·31
58 中 国 生 态 农 业 学 报 第 12卷
Gus
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cDNA
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图 1 UBI启动子表达载体构建
Fig．1 Construction of the expremsion vector pBI—NU
用 Kpn I酶切 、T4 DNA polymerase
补平和 Sac I酶切，回收大片段；基
因片段和载体大片段用 T4 DNA li一
(408) gase连接。选定 I-Is1 pro一1上单一
(。00) 酶切位点 Ba H I和连接位点之一
Sac工作为重组质粒鉴定的酶切组
合 ，双 酶切 位点 之 间 片段 长度 为
800bp左右。鉴定 的重组质粒命名
为 pBI—NU，用碱裂解法大量提取。
本实验室成熟 的甘 蔗再生技 术包括
诱导培养基 MS+2，4一D 3mg／L；继
代培养基 MS+2，4-D 2mg／L；分化
培 养 基 MS+BA 2mg／L+NAA
0．1mg／L；促 根 培 养 基 MS +
NAA3mg／L+BA0．1mg／L，依据上述
技术建立甘蔗再生体系。选继代 1
次生长 良好 的胚性愈伤组织，切成
直径 2mm左右 的粒状小块并分 3
瓶，每瓶 20粒 ，接入含卡那霉素的继
代培养基上，测定“ROC”16胚性愈
伤组织最低抑制浓度。卡那霉素浓
度设 210mg／L、240mg／L、270mg／L、300mg／L、330mg／L和 360mg／L 6种梯度，以不含卡那霉素的培养基为对
照。每 lOd继代 1次，40d后记载胚性愈伤组织相对生长量，以相对生长量无变化的最低浓度为最低抑制浓
度，相对生长量表达式为：
相对生长量 =处理生长量 ／对照生长量 ×100％ (1)
选甘蔗继代 1次生长良好的胚性愈伤组织，切成直径 2mm左右的粒状小块，接入预处理培养基 MS+
2，4一D 2mg／L+Sorbitol 0，2mol／L+Mannitol 0，2mol／L，预脱水 8h后进行轰击。将重组质粒 pBI—NU浓缩至
1 g L。金粉预处理、微弹制备与涂膜过程均按基因枪 PDS—lO00／He说明书进行。轰击参数 ：可裂膜选
900psi、1100psi和 1350psi 3种规格，可裂膜与发射盘相距 1／4英寸，轰击距离设 6cm和 9cm 2种，真空度设
定为 28inchs Hg0轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基上继续处理 18h，其后接入继代培养基上恢复培
养 7d，之后愈伤组织转移至 MS+2，4一D 2mg／L+kanamycin 300mg／L培养基上筛选，10d继代 1次，继代 5
次后将存活的愈伤组织接入分化培养基，抗性苗长至 5cm高后转入促根培养基上培养。根据 I-Is1 pro一1的
碱基序列，从设计的几种上、下游引物中筛选出特异性较强的上游引物 P1：5’一GGGcGcGTTGGATT．3’和
下游引物 P2：5’一CTCCATAACCTCCCTATCGC一3’作为转基因植株 PCR检测特异引物，以 820bp长度的特
异扩增条带作为基因检测特异条带。用 CTAB法微量提取 DNA[2]，对抗性苗 DNA进行 PCR检测，加样成
分为双蒸水 13．35>L，10倍反应缓冲液 2>L，4种三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTP，10mmol／L)0．25 L，镁离
子(MgClz25mmol／L)1．6>L，上、下游引物 P1、P2(10t,mol／L)各 I>L，Taq DNA聚合酶(5u／~1)0．3>L，抗性再
生苗模板 DNA 0．5>L，反应总体积 20t*L。PCR反应程序为 94*(2预变性 5min，循环参数为 94*(2变性 30s，
58℃退火 50s，7212延伸 90s，共 35个循环，反应结束后 72℃延伸反应 lOmin后置 412保存。Southern blot按
照 DIG DNA Labeling and Detection Kit说明进行。
2 结果与分析
UBI启动子表达载体构建。根据单一酶切位点对 P1832和 pBIL一1进行酶切鉴定，结果无误(见图 2)。
pBIL。1经 K I和 Sac I双酶切，大片段长约 9kb；P1832经 Nco I和 Sac I双酶切，小片段长约 1．4kb左
右。回收纯化并连接 pBIL-1大片段和 P1832小片段，连接反应液直接转化E．coli感受态细胞，用含 Kana—
mycin平板筛选，对产生的抗性单菌落进行扩增和质粒提取 ，用 BamH I和 Sac I双酶切鉴定，筛选出 1个重
m
叭 Ⅱ Ⅱ n ，at由t 0 c ＼etttJ e ct．16 恤 №；i 、、 胁 ；i胁l；
第 4期 陈平华等：抗线虫基因表达载件拘建与转化甘蔗研究初报
组质粒．命名为 pBl—NU．
结果见图 3 图 3表明抗
性单菌落质粒用 B“ H I
和 fI消化后．在第 7泳 ⋯．
遭出现2个条带 ．1条分子 1．3kb
小于第 L6泳道的小片段 Itt 2 P 8 、pBIL。 酶切鉴定
(全基因片段)，与设计酶 Hg 2 d n¨f啪Ⅲ ’f P 832
切小片段太小一致；另 1
． ¨
’
：
条分子量略大于第 15泳 Pl 2质越
．3身Pl832 』、 I
道大片段 (载体大片段)， 酶 ． 身 B[I t露托．5为 BI 1
这与其 比载体大片段多 Kpn1、 1圳自 ：
600bp一致．说明含 H 1 pro 1的表达载体构建正确=
图4 甘蔗转化抗性再生苗 PCR检谢
Fig 4 Detection nf 1he kanamycin—resistant
seedlirtgs sugarcane hy PL、R
圈 l L、2 3 4为 R( 【一l6转化再生m．5为
对照 P1 832，6 “ x“I6来转化苗．7为
GeneRuler(sM[1321． ng~,n、
圈 3 UBI启动子重组质粒筛选’
Fig 3 reenir~g o1"the 1-e~?l iFflbinartl
plasmid drired hy UBI promou)r
*罔中I为 【^) EmKI+Hi Ⅲ妊 舒子萤．2
lj为鲁蛀理质牲撵曲 ·HI I s 『最群坷．I5为
pBI，1．Ig Kpn I J l：rd薛0J．1B pI 832 It
～珊If rl 酶切．1匀l-BIL1畦啦
囤 5 PCR阳性再生苗 ~uthernblo／杂交接定 ’
Fig 5 Southern hlol identification{】f the
PCR positive seedlings uf sugarcane
匿巾 1为 Cornml I)NA，2为 pBI-NL1跪枉．
3为埘!《{f ROC”16束转化蓝)．4、5
fi为‘I,rOC”1 6转化前．
捶 枪轰击遗传
转 化 根据 “RoC
l6胚性愈伤组织在
含卡邵霉素培养基 J二
的重髓是否增打¨确定
其生长情况．处理与
对照相比所得相对生
长量若在 一浓度以
上连续恒定在同一水
平． 兑明愈伤组织未
生艮，则浚浓度为最
低抑制浓度．本研究
确定 300nlg]L为卡
那霉素最低抑制浓度。利用 PDS—l000,tHe基因枪．按照设汁参数进行轰击．将构建的质牲转化人甘蔗愈伤
组织，经筛选分化，在轰击参数 llOOps{、轰击距离 6cm、真空度 28~nchs Hg处理中获得 l6株抗性再生苗．其
中4株经 PCR检测呈阳性反应(见网4)，3株经2．~+utbern blot鉴定有杂交信号(见图5)
3 小 结
甘蔗遗传转化最困难，目前基因枪轰击被认为是禾本科植物遗传转化最有效的方法 ’ _本试验在卡
那霉素筛选过程中发现虽有抗性愈伤组织生长，但分化成苗困难．尤其是筛选代数增加时更甚．E1．日‘蔗组织
对卡那霉素反应较迟钝，最低致死浓度很高，导致有些愈伤组织缓慢生长，而内部生理机制有 1．能已受到伤
害而分化困难，易出现黄化苗，降低正常抗性植株比率，故用卡那霉素作为甘蔗筛选抗生素尚待完善
参 考 文 献
1 Sambrcok J。Fdtsch E F．Marfiatis r 菁．金誓稚 孳孟帆等译 丹千克隆实验指南(第二版1 北京：科学出垃}士 iq+a3 26、28
2 Clark M S 主躺．唾红雅．强札嘉主译 植物分子生物学试验手册 北京：高等教育出J跬社．I998 h~7
3 Cat D Positi~ cloning 。genefor nematode resistance1 sugar heel Science．I 997．275：832～8M
4 Gheys~n G， rhe exp[oitatioa。f n宙m l^xk re n pl t g㈣ n l nema~tle cont methods Peslic Sci ．1996．47： S～11 1
5 B髓ker D Ferri[rtr~sgeticwh朗tfrommicroprojetile b~mbardmenl c,f scu~eltarti,~ue Pl t J．1994，5：299～307
6 C A M Transgm~ic sorghum ptm+ts viamic~pro】ectile bomhmrdme~t USA：pro~ Nat1．Acad Sci．I993．q《)：tI 21 2～tI216
7 Nehra H s seIf-fertile t ㈣ wheat plants regenerated from td scu qdlar ti~ues[oUowing micmproimille hond,ardment,vih distin 1
gene COl~tiuct8 Plant J 1994，5(2)：285～297
～Ⅲ
ll_ ～
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