全 文 ：第 13卷第 2期
2 0 0 5年 4月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco-Agriculture
Vo1．13 No．2
April， 2005
RNA沉默一新型的植物病毒病害防治策略 *
牛颜冰 郭失迷 宋艳波 雷万钧 申林炎
(山西农业大学 太谷 030801)
摘 要 植物 RNA沉默(RNA silencing)是植物本身固有 的一种抗病毒防御系统，是对病毒在复制过程 中形成双链
RNA(dsRNA)的特殊反应。RNA沉默介导的dsRNA干涉病毒侵染转基因抗病毒有其不足，几种体 外生产 dsRNA
的抗病毒体系能弥补这一不足，它们与转基因表达病原 RNA不同，但仍然依赖 RNA沉默机．制来获取病原抗性。
综述 了近年来发展起来 的各种启动 RNA沉默的 dsRNA产生策略、抗病状况和存在的问题及发展前景。
关键词 RNA沉默 双链 RNA 抗病毒
RNA silencing- a new strategy for the control of virus diseases in plants．NIU Yan—Bing．GUO Shi—M i，SONG Yan一13o，
LEI Wan—Jun，SHEN Lin—Yan(Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)，CJEA，2005，13(2)：47～50
Abstract RNA silencing Occurs in plants is conceived as a natural antiviral defense system that is activated as a response
to double-stranded RNA(dsRNA)formed during virus replication．To compensate for the disadvantages on RNA silencing
by using dsRNA to specificaly interfere with virus infection in transgenic plants，several approaches of obtaining dsRNA
used for virus—resistance have been developed which differ from strategies based on transgenic expression of RNAs but still
rely on RNA silencing as a means to achieve pathogen—derived resistance(PDR)．In this paper，the dsRNA produce strate—
gies for RNA silencing，their applications for virus resistance，disadvantages and perspectives are reviewed．
Key words RNA silencing，Double—stranded RNA，Virus resistance
(Received Aug．16，2004：revised Aug．31，2004)
RNA沉默是真核生物共有的、在转录后水平起作用的同源依赖的基因沉默现象 j，双链 RNA(dsRNA)
高效启动 RNA沉默后 ，被 Dicer(RNA酶 Ⅲ样的核酸酶)切割成 21～26nt的小 的干扰型 RNA(siRNAs)，随
后siRNAs整合入 RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并引导 RISC对与其同源的目标 RNA进行降解 j。植
物抗病毒过程是 RNA沉默介导的病毒 RNA与所转病毒基因的 mRNA均被降解的过程 j。Fire A．等_5j发
现向小杆线虫投递外源 dsRNA能导致小杆线虫相应内源基因以序列特异性的行为降解 ，这一发现开创了人
类利用外源 dsRNA沉默基因、抗病毒的新局面。随后有研究发现 dsRNA或体 内能转 录出 自我互补发夹
RNA(也即 dsRNA)的反向重复片段也是植物基因沉默的高效启动子，含有病原 dsRNA的转基因植物能 以
100％的效率诱导植物对病毒产生免疫 ， J。植物 RNA病毒的细胞质复制中间体即类似启动植物抗病毒防
御机制的 dsRNA，这种 dsRNA通过启动植物 RNA沉默机制对植物进行保护 j。作为一种反防御策略，许
多植物病毒编码在 RNA沉默不同阶段起抑制作用的蛋白抑制子 ，植物抗病毒过程是植物对病毒的 RNA沉
默防御过程与病毒对植物的反防御过程的较量。用病原 dsRNAs转化大麦 、烟草 、番茄等获得多种抗病毒转
基因植物。由于植物病毒的寄主范围一般较广泛，通常能危害多种植物，必须将同一病原dsRNAs转入多种
寄主植物才能获得多种抗病毒转基因植物。故植物病毒学家 目前共同研究 目标是将动物中所用的外源
dsRNA沉默基因方法延伸到植物抗病毒中，以期发展一种新的以 RNA沉默为基础 ，但又有别于通过转基因
表达 RNA的新型抗病毒策略。
1 植物中的 RNA沉默抗病毒
RNA沉默的本质是将 RNA沉默诱导因子 dsRNA投递至生物体的组织或细胞引起生物体 中同源 目标
RNA的降解。RNA沉默介导的抗病毒策略是将病原 dsRNA投递至植物叶片引起病原 dsRNA和同源病毒
mRNA的降解 。
*山西农业大学优秀人才引进基金项 目和山西农业大学博士启动基金项 目
收稿 日期 ：2004-08—16 改回日期：2004—08—31
48 中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
1．1 转基因植物中转基因转录产生的病原 dsRNA分子抗病毒
dsRNA能被表达 自我互补发夹 RNA的转基因传递，其原 因是 由于反向重复结构的转录产物 自交形成
发夹结构 ，该发夹结构含有单链环区(通常是内含子)和与诱导 RNA沉默的 dsRNA结构极其相似的碱基互
补臂。Smith N．等 研究表明，内含子被剪切掉的发夹结构转基因抗病毒能引起转基 因植物几乎 100％发
生沉默 ，导致几乎所有转基因植物对病毒产生免疫作用。Wang M．B．等 将大麦 黄矮病毒 PAV分离物
(BYDV—PAV)多聚蛋白基因的反向重复结构转化大麦，在所得 25株转基因大麦中有 9株对 BYDV—PAV具
有免疫作用。笔者将番茄花叶病毒移动蛋白基因(ToMV—MP)的反向重复结构转化烟草 ，在所得 47株转基
因烟草中有 23株对 ToMV具有免疫作用 ；将烟草花叶病毒部分复制酶基因(CMV—ARep)的反 向重复结构
转化烟草，在所得 40株转基因烟草中有 25株对 CMV具有免疫作用。
1．2 非转基因植物中体外转录出的病原 dsRNA分子抗病毒
Tenlado F．等l_9 J将 3种典型正链 RNA病毒辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)、烟草蚀纹病毒(TEV)和苜蓿花
叶病毒(AMV)基因组不同部位 eDNA克隆转录成正义单链 RNA(ssRNA)和反义单链 RNA，并将二者退火
形成 dsRNA，将所得病原 dsRNA和同源病毒摩擦接种植物叶片，考察体外转录出的 dsRNA能否以序列特
异性的行为干涉病毒侵染。首先他们对 PMMoV 的正义 ssRNA、反义 ssRNA和 dsRNA抑制其诱导敏感寄
主(珊西烟和辣椒)产生局部枯斑情况进行分析，发现机械接种 PMMoV 54kDa蛋 白区域的正义 ssRNA、反
义 ssRNA均不能使 PMMoV在珊西烟和辣椒上所产生的枯斑数减少 ，只有与该病毒具有极高序列同源性的
dsRNA才能对其侵染产生干涉作用。其次他们将 PMMoV及其 dsRNA同时接种其系统寄主本氏烟，发现
病原 dsRNA对系统寄主中同源病毒的侵染也具有干涉作用。抗病性分析还表明 PMMoV的dsRNA干涉其
系统侵染有长度要求 ，如 PMMoV的 596bp长的 dsRNA对 PMMoV系统侵染具有干涉作用 ，而 PMMoV的
315bp长的dsRNA则无干涉作用 ，仅能推迟 1～2d发病 ，且病毒 RNA的量与对照接近。Thomas C．L．等l_oJ
也发现含有目标基因300～800bp片段的重组病毒能有效诱发植物 RNA沉默，少数情况下 23～60bp的片段
也能诱导植物 RNA沉默 ，这与在植物、小杆线虫和果蝇 中所发现 的 RNA沉默依赖于 dsRNA的长度相一
致 J。Tenlado F．等还进一步证明病原 dsRNA对植物病毒侵染产生干涉是一个普遍 的策略，如 TEV HC—
Pro的 dsRNA对 TEV具有抗性；AMV RNAsl、AMV RNAs2和 AMv RNAs3体外转 录产物 以及 AMv
RNAs3的 l124bp的 dsRNA对 AMV也具有抗性。上述研究结果表明植物叶片同时接种体外转录出的病原
dsRNA和 目标病毒能引发 RNA沉默，进而导致植物对病毒侵染产生干涉作用。体外转录出的 dsRNA通过
叶片伤 口进入植物细胞 ，因而无法确保定量 的 dsRNA进入植物细胞 ，因此很难确定诱导植物 RNA沉默抗
病毒的最适 dsRNA量。在实验条件下针对 PMMoV，Tenlado F．等l_9 J发现对病毒具有干涉作用 的 dsRNA
最低限量是病毒 RNA的 500倍 ，这一结果显然与小杆线虫中几分子的 dsRNA就足以诱导 RNA沉默相违
背 J。有研究推测转基因 RNA沉默扩增是由于沉默诱导因子 dsRNA产生的初级 siRNAs与 目标 RNA退
火 ，通过寄主编码的 RNA依赖的 RNA聚合酶(RdRp)引发类似 PCR的酶促反应形成新 dsRNA所致。Ten—
lado F．等_9 J的研究体系中 dsRNA对病毒侵染的干涉作用发生在细胞水平 ，即在敏感寄主中 dsRNA可干涉
PMMoV的侵染 ；在系统寄主中病毒能够部分战胜 dsRNA所提供的保护作用，导致接种叶片中有效侵染位
点减少。该系统中不存在 RNA沉默扩增是因其体外合成的dsRNA无法从目标病毒 RNA中引发新dsRNA
产生所致 。为引起干涉作用，将病毒和 dsRNA接入同一植物细胞是必要的，它们之间间隔仅 24h即可导致
植物对病毒完全敏感 ，这些发现表明植物中局部引入的 dsRNA不能诱发系统性的抗病毒反应。
1．3 非转基因植物中瞬时表达的病原 dsRNA分子抗病毒
用农杆菌培养液浸润接种植物组织来瞬时表达基因已成为向植物投递 RNA沉默诱导因子 、目标和抑
制子的一种方法_l 。Tenlado F．等_l 首次证实用含有能转 录产生 dsRNA结构的农杆菌浸润接种非转基
因植物叶片，所得病原 dsRNA对植物病毒侵染具有干涉作用。他们用含有 PMMoV 54kDa区域 dsRNA的
农杆菌浸润接种本氏烟，该烟草接种叶对随后 PMMoV的挑战接种产生抗性 ，相反用农杆菌正 向或反向瞬
时表达 2个串连(头尾相连)的 PMMoV 54kDa区域 ，该植物接种叶及上部叶片中均有发病症状。农杆菌介
导的瞬时表达系统产生的外源 dsRNA对植物病毒侵染的干涉作用与 RNA沉默有直接联系，Tenlado F．
等_l2J发现该体系的几个 RNA沉默特征，一是 dsRNA对植物病毒侵染所产生的干涉作用依赖于发夹 RNA
与 目标 RNA的序列同源性。将与 PMMoV不相关的病毒如 AMv或 TMV接种瞬时表达 PMMoV dsRNA
的植物时，该植物表现出典型的花叶症状；相反，将与 PMMoV同源性高达 93％的病毒 PMMoV—I接种瞬时
第 2期 牛颜冰等：RNA沉默一新型的植物病毒病害防治策略 49
表达 PMMoV dsRNA的植物时，该植物则表现不发病 ；而用与 PMMoV发夹 RNA 同源的马铃薯 x病毒
(PVX)重组载体接种含 PMMoV发夹 RNA农杆菌浸润接种过的植物后 ，该植物对相关病毒具有抗性。二
是 dsRNA浸润接种的植物叶片中，也含有 2种类型能诱发植物发生 RNA沉默的 siRNAs，它们都是 RNase
Ⅲ切割 dsRNA的产物。三是 dsRNA引发的植物对 PMMoV的干涉作用 ，能被李痘病毒 (PPV)HC—Pr0的
瞬时表达克服。Brigneti G．等[” 发现马铃薯 Y病毒(PVY)的 HC—Pro是 RNA沉默的病毒抑制子。目前虽
无确凿的证据 ，但 PPV的 HC—Pr0可能也是 RNA沉默的病毒抑制子 ，其原因是 PPV的 HC—Pro参与了与其
他病毒中 HC-Pro的沉默抑制非常相似的本氏烟中 PVX的协生作用。Tenlado F．等虽仅提及 PMMoV 的
dsRNA对相应的病毒侵染具有干涉效果，其实许多植物 RNA病毒的发夹 RNA都能通过农杆菌介导法瞬时
表达来抑制其同源病毒 的侵染。正如笔者等_2 J所研究证实黄瓜花叶病毒 (CMV)部分复制酶基 因的发夹
RNA和番茄花叶病毒(ToMV)全长运动蛋白发夹 RNA瞬时表达均能干涉其同源病毒的侵染。Ruiz M．T．
等[1 ]对植物 RNA沉默的分析表明 ，RNA沉默包括起始、系统性沉默信号的扩增和保持 3个相互独立的过
程。Palauqui J．c．等Ll5 报道与 目标 RNA同源的细胞核因子、转基因或内源基因是 RNA沉默的系统沉默信
号传播和扩增所必需的。笔者研究发现摩擦接种 dsRNA能启动以降解 RNA为 目标的 RNA沉默起始 ，但
RNA沉默的保持则需要与目标病毒 RNA同源的细胞核因子、转基因或内源基因。瞬时表达 dsRNA对植物
病毒所产生的干涉效果与向植物叶片中摩擦接种 dsRNA所产生的干涉效果类似，但这 2个系统中都缺乏同
源的细胞核因子、转基因或内源基因等因子 ，也不具有持续输入适量外源 dsRNA的能力，从而导致特定信号
分子不能向植物其他部分传递。
2 RNA沉默控制植物病毒病的潜能
体外转录合成的 dsRNA和农杆菌介导的瞬时表达系统表达的 dsRNA用于植物抗病毒时 ，它们 的致命
缺陷是这些体系中接种叶片产生的 RNA沉默不能传递至植物的其他叶片，从而导致体外转录的 dsRNA或
农杆菌介导的瞬时表达系统表达 dsRNA引发的干涉作用仅局限于基础研究。若能发展一种高效产生和投
递足够量 dsRNA到整株植物的方法，提供外源 dsRNA将极有可能成为植物抗病毒侵染产业化的最适生物
学工具。Timmons L．等u ’ 用 “HT115”生产 的 dsRNA诱 导 小 杆线 虫 内源基 因发 生 了 RNA 沉默。
“HT115”是缺失 RNase11的突变体，RNase11能降解细菌中绝大多数 dsRNA，故“HT115”菌株能大量生产长
的 dsRNA。基于“HT115”菌株这一 特性 ，Tenlado F．等 1 用转化 PMMoV 的 54kDa区域 dsRNA结构 的
“HT115”生产了大量病原 dsRNA，并发现细菌产生的 dsRNA也能干涉 PMMoV 的侵染。Tenladq F．等发
现混合接种 PMMoV和“HT115”生产的 PMMoV的 dsRNA酚抽提物的烟草 ，其接种叶整个生活周期内均不
发病 ，也无病毒积 累；而混合 接种 PMMoV dsRNA核 苷酸提取 物和 与其非 同源 的病 毒 TMv，PMMoV
dsRNA则对 TMV无干涉作用 ；混合接种 PMMoV和“HT115”生产的空载体 dsRNA酚抽提物的烟草却表现
发病症状，说明细菌提取物的非特异性毒性对病毒侵染无影响，因此细菌表达的 dsRNA对病毒侵染的干涉
作用也依赖于序列同源性 。为促使“HT115”生产病原 dsRNA抗病毒技术产业化应用，Tenlado F．等E博 还
研究出将病原 dsRNA粗提取物喷至植物叶面的技术，他们发现用喷雾器将病原 dsRNA喷至植物叶面几天
后，再在植物同一叶片机械接种 PMMoV和 PPV，该植物对病毒具有免疫作用，其理论基础是喷在植物叶面
的 dsRNA分子可停留在叶面数天，并能借助于表皮细胞伤 口与病毒粒子一起进入植物细胞 ，结果这些 dsR—
NA分子被寄主植物的 Dicer切割成指导同源病毒 RNA切割的 siRNAs，随后 siRNAs整合人 RISC，并引导
RISC对与其同源病毒 RNA进行降解。目前用“HT115”生产的病原 dsRNA抗病毒还仅局限于少数几种病
毒(如 PMMoV和 PPV)的实验研究阶段。
3 RNA沉默抗病毒病应用前景
RNA沉默是许多真核生物固有的抗病毒策略，dsRNA分子是所有生物体中 RNA沉默的高效诱导因
子。对已建立起成熟遗传转化体系的作物而言，依赖 RNA沉默机制，用转病毒基因反向重复结构(转录产
生 dsRNA)来获取抗病毒转基因植物是基因工程控制植物病毒病害的最有效方法 ，且在所得抗病毒转基 因
植物中既不存在有功能的病毒基因或蛋白，也不存在转基 因 mRNA的积累，因而不存在发生互补 、异源包
壳 、协生和重组的风险，符合人们对生物安全性的高要求E ]。但特殊情况下抗病毒转基因植物的生态风险
还是限制其应用 ，如含有病毒抑制子的非同源病毒侵染 RNA沉默介导的抗病毒转基因植物可 以翻转转基
因植物的沉默状态 ，导致病毒抗性的丢失和转基因 mRNA的高水平表达 ，造成转基因 mRNA和入侵病毒
中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
RNA之间发生重组[2 0l。Ten1ado F．等[18]建立的快速廉价病原 dsRNA细菌表达系统可以满足未建立遗传
转化体系的作物、多寄主病毒或不能进行遗传转化的作物抗病毒。这一技术若真正应用到大田其存在的问
题一是对摩擦接种病毒具有抗性的植物，却未必对天然载体接种的同一病毒产生抗性，这是因为载体能将
病毒颗粒释放到植物细胞内部。大多数单链 RNA植物病毒包括PVY是通过蚜虫传毒的，有关学者目前正
在进行使病原 dsRNAs不通过表皮细胞向植物组织直接渗透来防治蚜虫传毒的试验研究。二是 dsRNAs诱
导的 RNA沉默仅存在于接种的植物组织中，而在其他叶片中则不存在 ，只有在干涉产品 dsRNAs遍布整个
植物体时才能起到对整株植物的保护作用。三是 dsRNAs仅能在短期内保持抗病毒效果 ，在 田间抗病毒时
存在诸多不便 ，如必须在特定时间内多次喷施干涉产品、在病毒流行适宜时期激发 RNA沉默机制才能起到
应有效果。与获得抗病毒转基因植株相比，用“HT115”表达病原 dsRNAs的 RNA沉默技术抗病毒具有明显
优势，首先在实验程序上它避开了转基因工作量繁重、周期性长、费时费力的途径；其次它能以一种简单方
式投递多种病原 dsRNAs，从而获得多种抗性 ，而转基因植物要获得多种抗性则需要多次转化和杂交；再次
外源 dsRNAs诱导的 RNA沉默虽能被病毒抑制子破坏 ，但将 dsRNAs分子置于突变的转录调节区可 以减少
dsRNAs处理的植物中干涉产品过量积累，进而减少重组机会。最终 目标是将细菌表达 dsRNAs抗病毒体系
发展成为一种环境友好高效控制植物病毒病的方法。
参 考 文 献
1 牛颜冰等．RNA沉默机制及其抗病毒应用 ．中国生物工程杂志，2004，24(2)：76～79
2 牛颜冰等．瞬时表达黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋 白基因的 dsRNA能阻止相关病毒的侵染 ．农业与生物技术
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