全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1209—1214
Acta Horticulturae Sinica
萝 卜中一种新 dsRNA的全长 cDNA克隆及序列分
析
李露露 ，李力强 ，乔爱民 ，陈 亮 ，陈集双
(‘浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018； 仲恺农业技术学院农业与园林学院，广州 510225)
摘 要：从 ‘一点红’萝 卜 (Raphanu~sativu~一root‘Yidianhong’)叶片中提取 dsRNA，应用 SPAT方法
对各 dsRNA条带进行 cDNA克隆并测序，除获得先前报道的5条序列 (RasR 1～RasR 5)以外，还得到一
条新的全长序列，将其定名为 RasR 6(EU285027)。序列分析结果表明：RasR 6全长为 1 778 bp，其正义
链编码 1个由502个氨基酸组成、分子量约为55．1 kD的蛋白质。该序列与前人报道的双分病毒科 5个病
毒序列具有相似性，且它们均编码双分病毒科病毒的外壳蛋白 (capsid protein，CP)。核苷酸序列比对结果
显示：RasR 6与同时来源于萝 卜的RasR 1和 RasR 2的5 UTR序列高度同源，且其3 末端具有poly A结构 ，
而与 RasR 3、RasR 4和RasR 5的UTR则没有明显的相似性。因此，推测 RasR 6与 RasR 1、RasR 2同属于
双分病毒 RasV 1(Raphanu~sativu~virus 1)，可能与 RasR 2共同编码该病毒的 CP或作为 RasV 1的卫星
RNA存在。
关键词：萝 卜；双链 RNA；双分病毒科；Raphanus sativu~virus 1
中图分类号：S 631．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)08—1209-06
Full-length cDNA Clone and Sequence Analysis of A New Double-stranded
RNA from Radish
LI Lu．1u ，LI Li—qiang ，QIAO Ai．min 。CHEN Liang ，and CHEN Ji．shuang
( Institute ofBioengineering，Zhejiang Sci—Tech University，Hangzhou 310018，China； College ofAgriculture and Landscape
Architecture，Zhongkai University ofAgriculture and Technology，Guangzhou 510225，China)
Abstract：Double．stranded RNA (dsRNA)were extracted from leaf tissues of radish(Raphanus sativ —
root‘Yidianhong’)grown in Hangzhou China．Complementary DNAs corresponding to the dsRNA segments
were obtained by using a modifed single primer amplifcation technique(SPAT)，and folowed by cloning ahd
sequencing．The results revealed that a new dsRNA sequence，different from al the previously reported se—
quences RasR 1 to RasR 5．was obtained．And the newly detected RasR 6(EU285027)was found to be 1
778 bp in length．It predicted that the positive strand of RasR 6 potentialy encoded a protein of about 55．1
kD，containing 502 amino acids．Five members of Partitiviridae。aU of which encoded putative viral CPs．
were found to have some identity with RasR 6．Multiple alignments showed that RasR 6 were highly conserved
at the 5(UTR regions with RasR 1 and RasR 2 previously reposed from the same radish varities。but had no
similarity with RasR 3 to RasR 5．rhUS．it could be presumed that both RasR 6，RasR 1 and RasR 2 should
belong to Raphanus sativus virus 1(RasV 1)，and RasR 6 encods CP together with RasR 2，or is a satelite
dsRNA of this virus．
Key words：Raphanus；double．stranded RNA；Partitiviridae；Raphanus sativus virus 1
双分病毒科 (Partitiviridae)由3个属组成，即 隐潜病毒属 (Alphacryptovirus)、B隐潜病毒属
收稿日期：2008—03—04；修回日期：2008—05—27
基金项目：国家自然科学基金项目 (30671361)；科技部国际合作重点项目 (2004DFA05000)
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：chenjs@zstu．edu．cn；Tel：0571-86843197)
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园 艺 学 报
(Betecryptovirus)和双分病毒属 (Partitivirus)。通常情况下，双分病毒科病毒的基因组由两条大小相
近的dsRNA构成，且长度均在 1．4～3．0 kb之间。每条 dsRNA都编码一个蛋白，一般较大的 dsRNA
编码病毒的RdRp，较小的dsRNA编码病毒的CP。此外，某些病毒除了含有两条完整的基因组dsRNA
之外，还含有只有部分基因组序列的缺省 RNA(defective RNA)和卫星 RNA (satellite RNA)，这两
种RNA的存在依赖于基因组 dsRNA的支持 (Ghabrial et a1．，2005)。双分病毒科病毒的病毒粒子的
直径30～40 nm，在寄主中积累量低，且不引起明显的寄主症状 (Boccardo et a1．，1987；Ghabrial et
a1．，2005)。仅隐潜病毒属和 B隐潜病毒属成员的自然寄主为植物，双分病毒属成员的自然寄主为真
菌。
作者继从杭州市郊的 ‘一点红’萝 卜品种中鉴定出可能属于两种 Partitiviridae病毒的5条 dsRNA
以后，继续从同一地点采集该萝 卜品种的叶片，并抽提叶片组织的 dsRNA，获得了4条大小在 1 400
～ 2 000 bp范围的 dsRNA条带。但是，在某些萝 卜样品中只发现含有两条较大的 dsRNA。继续用
SPAT方法即单引物扩增的方法，获得了全部 dsRNA条带的cDNA并随之克隆测序，重复获得 RasR 1
～ RasR 5的序列，其大小依次分别为 1 866 bp、1 791 bp、1 717 bp、1 521 bp和 1 486 bp(Lambden et
a1．，1992；刘莉 等，2005)。推测 RasR 1和 RasR 2共同组成一个植物潜隐病毒Raphanus sativus virus
1(RasV 1)，RasR 1编码该病毒的 RdRp(RNA dependent RNA polymerase)，RasR 2编码该病毒的
CP。而 RasR 3～RasR 5组成另一植物潜隐病毒Raphanus sativus virus 2(RaSV 2)，RasR 3编码该病毒
的 RdRp，RasR 4与 RasR 5编码该病毒的 CP(Chen et a1．，2006a，2006b)。
此外，作者还发现在萝 卜植株中可以单独检测到 RasV 1的存在，但是未发现 RasV 2单独存在的
情况。在克隆 RasR 2时，还获得了一条和 RasR 2大小相近的 dsRNA，即 RasR 6。为了验证其确实
存在并确定其序列，参照新获得的 RasR 6序列设计 3对特异性引物，分别以叶片组织的总 RNA和
dsRNA为模板进行 RT．PCR并克隆、测序，最终重复确认了该序列的存在并验证了该序列的来源，为
深入研究萝 卜中 dsRNA病毒相互作用的侵染机制提供分子生物学基础。
l 材料与方法
1．1 叶片的采集与保存
试验用 ‘一点红’萝 卜植株叶片于2006年4月采集自杭州市农业科学院蔬菜研究所实验田，与
2004-2005年为同一采样地点。样品于4℃冰箱短期保存或存于一80℃冰箱中。单株或多株材料分
别提取 dsRNA或总RNA进行病毒检测。
定点收集标记植株的萝 卜种子，同一株植株的种子苗用于进一步鉴定。
1．2 主要试剂
T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、反转录酶 AMV、LA Taq和 pMD18．T载体试剂盒为 TaKaRa公
司产品；反转录酶 SuperScript ”m购自Invitrogen公司；DNA回收试剂盒购自Axygen公司；引物委托
上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Trizol试剂购自Invitrogen公司。
1．3 引物的设计
用于 SPAT的接头 primer A与primer B根据马铃薯纺锤形块茎类病毒 (Potato spindle tuber viroid，
PSTVd)的基因组序列设计 (刘莉 等，2005)，序列如下：
primer A：5 PO4一TC1TrCGGGTGTCC1TrCCTCG—NH2—3 ；
primer B：5 一CGAGGAAGGACACCCGAAGA一3 。
在 RasR 6序列内设计的3对特异性引物：
primer 1一F：5 一AGAAAGGTm ’AGACTCTCTCCTAATT一3 ：
primer 1．R：5 ．GAAGGTAGACACTYCAGGGTATYG．3 ：
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8期 李露露等 ： 萝 卜中一 种新 dsR NA 的全长 eD N A 克隆及 序列分析
prim er 2 - F ： 5
’
一 C C A C C A C ’I’rC
’I’(了I’rC A C G - 3 ’ ；
prim er 2 - R ： M 13 M 4 + O ligo d (T )m 即 5
’
一 C n W C C C A G T C A C G A C + O ligo d (T )18 - 3
’
；
prim er 2 - R 一 1 ： M 13 M 4 ， 即 5
’
一 G qqqT C C C A G T C A C G A C 一 3 ’ ；
prim er 3 - F ： 5
’
一 G C C C A A C A G C A A C A A G T G A T 一 3 ’ ；
prim er 3 一 R ： 5
’
一 G T G T A G G C A T C G G G G A A T A T 一 3 ’ 。
1 ． 4 dsR N A 的提取 和 S P A T
萝 卜叶片组 织 dsR N A 的提取 参照 本实验室方法 (陈集双 ， 2001 ) 进行 ， 并进 行割胶 回收 。 在 T 4
R N A 连接酶与 T 4 D N A 连接酶存在的条件下 prim er A 连接到 dsR N A 序列 的 3 ’端 。 其后模板 dsR N A 的
末端被 D N A 聚合酶补平 ， 再在 D M S O 的存在下高温 变性 ， 以 prim er B 为下游 引物 ， 进 行反转录合成
cD N A 的第 一 条链 ； 继续 以 prim er B 为上 下游引物 ， 以 cD NA 为模板进行 P C R 扩增 。
1 ． 5 叶片组 织 总 R N A 的提取 和 R T - P C R
叶片组织 总 R N A 利用 T rizol试 剂 提取 ， 以 prim er 1 一 R 、 prim er 2 - R 、 prim er 3 - R 为引物进 行 反 转
录 ， 然后分别 以 prim er 1 一 F 和 prim er 1 一 R 、 prim er 2 - F 和 prim er 2 - R 一 1 、 prim er 3 - F 和 prim er 3 - R 三 对 引
物进行 P C R 扩增 。 扩增程序为 ： 94 ℃ 预变性 5 m in ； 然后进行 30 个循环 ， 循环 的条件为 94 ℃ 变性 1
m in ， 60
oC (prim er 1 )、 56 ℃ (prim er 2 )、 5 8
oC (prim er 3 ) 退 火 30 S ， 72 cI= 延 伸 1 m in ； 最 后 在
72 ℃ 条件下延 伸 10 m in 。
1． 6 扩增产物 的克隆测序 与分 析
扩增产物在 1％ 的琼脂糖凝胶上 电泳 ， 回收后 连接到 pM D l8． T 载体上 ， 转 化感受 态 细胞 D H 5 c~，
经 氨苄抗性 和 蓝 白斑 筛选 后 ， 挑取 10 个 以上 的阳性 克隆 ， 用相应引物进行 P C R 鉴 定 ， 挑选 3 个 阳性
克隆进行测序 。
特异性 引物 的设计采用 P rim er prem ier 5 ． 0 完成 。 O R F 的搜寻 以 及 核苷酸 的统计分析等工 作通 过
D N A S tar 软件完成 。 在 G enB ank数据库 中同源序列 的搜索工 作利用 B L A S T 程序完成 (A hschulet a1． ，
1997 )。 同源序列的 比对通过 C lustalW 程序完成并用 G eneD oc 程 序查看 (Nicholas & Nicholas ， 1997 )。
同源序列之 间的系统发生 树 由 M E G A 3 ． 1 软件生成 。
2 结果与分析
2． 1 dsR N A 的提取和 cD N A 的获得
从杭州郊 区 表现有典型黄边症 状或症 状不 明显 的 ‘ 一 点红 ’ 萝 卜品种 中获得 的总 dsR NA ， 与我
们以前报道 的结果相似 。 在 5 ％ 聚丙烯酰胺凝胶 中分离得到大小在 1 500 ～ 2 000 bp 的两 条主带 ， 仍然
命名为 dsR N A 1 和 dsR N A 2 (图 1 )。
渊—r!
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1212 园 艺 学 报 35 卷
继续采用 S P A T 方法获得 dsR N A l和 dsR N A 2 的 cD N A ， 结 果仍然 为 2 条主 带 ， 大小在 1 700 ～
1 900 bp 范 围内 。
2． 2 序 列测定
目标 片段 经 克 隆测 序 ， 发 现 dsR N A 1 与 我 们 已 经 报 道 的 R asV 1 中 的 R asR 1 完 全 相 同 ， 但
dsR N A 2 实际是 由两个共迁 移条带组 成 ， 相对 大 的条带 (1 79 1 bp) 与 R asR 2 完全 相 同 ； 新 的条带 即
本文 中的 R asR 6 ， 全长 1 778 bp， 其 中 A 、 G 、 T 和 C 的含量 分别 为 24 ． 63％ 、 18． 1 1 ％ 、 26． 4 3 ％ 和
30． 82％ ， 很 明显 G 的含量 比其它 3 种碱基 的含量低 。
2． 3 R T - P C R 验证 序 列 的来源
在新获得 的 R asR 6 序列 中 ， 设计 3 对特异性
引物 (prim er I — F 和 prim er l— R ， prim er 2 - F 和
prim er 2 一 R 和 prim er 2 一 R - 1 ， prim er 3 - F 和 prim er 3 -
R ) 分 3 段 克隆 R asR 6 ， 由于 R asR 6 的 3 ’末端具
有 poly (A ) 结构 ， 所 以在扩增 R asR 6 的 3
’端序
列时采用 M 13 M 4 + O ligo d (T )18 以 及 M 13 M 4 作
为扩增 引物 。 以萝 卜叶片组 织 中的 totalR N A 为模
板 ， 进行 R T ． P C R ， 结 果 均得 到预 期 大小 为 379 、
4 4 2 、 1 298 bp 的 目的片段 (分别标记 为 a 、 b、 e ，
图 2)， 测序结 果 也 与 R asR 6 的序 列 相 吻 合 ， 说
明 R asR 6 来源 于 dsR N A 。
2． 4 R asR 6 核酸序 列分析
R asR 6 的 cD N A 序 列 的 G en B ank 登 陆 号 是
E U 285027 。 R asR 6 与 R asR 1 的 5 ’ U T R 长 度 分别
为 79 bp 和 70 bp， 二 者 同源性 为 65 ． 4 ％ ， 共 同拥
有 4 个 相 同 的 区 域 ， 包 括 末 端 的 5
’
一
A G A A A A A ，I] rr一 3 ’ 。 R asR 6 的 3 ’U T R (190 bp) 明
显 长于 R asR l 的 3 ’U T R (74 bp)， 它们之 间的同
1 500 bp
1 000 bp
500 bp
M 1 2 3
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图 2 R T ? P C R 验证 序 列 来 源 的结果
1 ～ 3 ： 以 萝 h叶片组 织 中的 总 R N A 为模板 ，
分别 以 prim er 1 - F 和 prim er 1 一 R ， prim er 2 - F 和
prim er 2 - R 和 prim er 2 - R 一 1 ， prim er 3 - F 和 prim er 3 - R
为引物进 行 R T - P C R ； M ： D N A 分子量 标准 。
a ： 379 bp； b： 4 4 2 bp； e ： 1 298 bp。
F ig． 2 R esults for detection ofR asR 6 origin
by R T - P C R w ith specific prim er
l 一 3 ： A m plification ofthree specific fragm ents by R T — P C R
w ith totalR N A s from radish by using prim er 1 一 F ＆ prim er 1 一 R ．
prim er 2 - F ＆ prim er 2 - R & prim er 2 - R 一 1 and prim er 3
- F ＆
prim er 3 - R as prim ers respectively； M ： D N A m arker．
a ： 379 bp； b： 4 2 bp； C ： 1 298 bp．
源性 为 25 ． 7％ ， 但两 者也 有 一 些 相 同的区域 ， 包括 3 ’末端 的 5
’
- A A A A T A A A A 一 3 ’。 R asR 6 序列 两 端 的
U T R 分别与相应 R asR 2 序列两 端 的 U T R 有较 高的 同源性 (图 3 )。 R asR 6 与 R asR 2 的 5
’U T R 长度相
当 ， 分别为 79 bp 和 77 bp， 同源 性 高达 82． 3％ ， 二 者 具 有 3 个 较 长 的相 同 区 域 ， 包 括 末 端 的 5
’
一
A C A A A A A 肿 A G A ． 3 ’ ； R asR 6 与 R asR 2 的 3 ’U T R 长度也 相 当 ， 分别为 190 bp 和 196 bp， 同源性为
66． 0％ ， 同时具 有 多 个 相 同的 区 域 ， 包 括 3 ’末 端 的 5 ’一 T A A A A A A A A -3
’ (图 3 )。 此 外 ， R asR 2 和
R asR 6 的全长序列也有 多个相 同的区域 ， 二 者 同源性 为 54 ％ 。
2． 5 R asR 6 编 码 蛋 白序 列分 析
在 G en B ank数据库 中利用 B L A S T 程序搜索与 R asR 6 同源 的序列 ， 结果显 示 ， 有 5 条蛋 白序列 与
R asR 6 编码 的蛋 白序列具有较 高相 似性 ， 且 均 为双 分病毒科病毒 的外壳蛋 白 ： R asV 1 (Y P _ 656505 ，
相似性 37％ )， W hite clover cryptic virus 1 (W C C V l， Y P 一 086755 ， 相 似性 21％ )， V icia cryptic virus
(V C V ， Y P _ 272125 ； A B N7 1235 ， 相 似性 23 ％ )， A m asya cherry disease— associated partitivirus (A C D — P V ，
Y P
一
138536 ， 相似性 30％ )， C herry chlorotic rusty spot associa tedpartitivirus (C C R S — P V ， Y P 一 138539 ， 相
似性 25 ％ )。 以从萝 卜上 克隆到的 R asR 5 为外组 对照 ， 生成 系统发生树 (图 4 )， R asR 6 编码 的蛋 白
与 R asV l的外壳蛋 白 (即 R asR 2 推测 编码 的蛋 白) 聚到 一 类 。 以上 结果说 明 R asR 6 可 能编码 R asV
1 的另外 一 个外壳蛋 白 ， 或者编码 的蛋 白具有未知的功能 。
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8期 李露露等 ： 萝 卜中一 种新 dsR NA 的全长 cD NA 克隆及序列分析
R m R l：
R asR 2：
R asR 6：
b
R asR 1 ：
R asR 2：
R asR 6：
R asR 1 ：
R as R 2：
R as R 6：
R asR l：
R as R 2：
R asR 6：
’ 20 。 4 0 。 60 。 80
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 _ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一
C
⋯
T C T
⋯
C T
，
C 邀懑隧踵感 鏊逐戮 爨懑麟麓麓潮黪题器簇 ；题醺
c c c c c c g c a c c c c t c c g ga g c g喜 g a t gt a c gga gt a ga c t a g g t t c
80 ‘ 100 。 120 ‘ 14 0
垂函垂蠹藏 蠢 区氢匿菌 隧 藤黛豳麟 焉蒸 翻雹
c t t c g a t t t t c gg e t c t t t t gt t t gt c gt t c t a c C~ c T t t T t t T a t t T c A a T G T A A
} 160 } 180 ‘ 200
壁黔c溷蓥；垂罐滋淄豳豳戳霉鋈隧赢 一 一
74
196
190
图 3 R asR l、 R asR 2 和 R asR 6 的 5 ’U T R (a ) 和 3 ’U T R (b) 序 列 比对结 果
核苷酸保守性 ： 黑色 100％ ， 灰 色 > 80％ ， 无 阴影 < 60％ 。
F ig． 3 C om parisons of5
’U T R (a )and 3 ’U T R (b)sequences am ong
cD N A s ofR asR 1 。 R asR 2 and R asR 6
S hadin g le、rels in each colum n represen ts differen tsim ilarities ： black 100％ ． grey > 80％ ． u nshaded < 60％
图 4 P artitiviridae 成 员与 R asR 6 的 C P s 系统发生树
F ig． 4 P hylogenetic tree generated from m ultiple alignm ents ofP artitiviridae viralC P s and R asR 6
70
77
79
●
70
67
25
133
14 0
3 讨论
植物组 织 中大分子 双 链 R NA 的存在通 常与 R NA 病 毒 的感染 相关 (O sakiet a1． ， 1998)。 分析
dsR N A 已 经 成为研究植物病毒 的重 要 途 径 之 一 (D odds et a1． ， 1984 )。 N atusuaki等 (1979 ) 在 日本
萝 卜 (R apha nus sativus L ． ) 中发现 了 一 种球状病毒 ， 直径约 30 nm 。 感染这种病毒的萝 卜幼苗通 常表
现不 明显 ， 但有 时会 出现 叶 片边 缘 轻微 黄 化 的现 象 ， 因此 该 病 毒被 命 名 为萝 卜黄边 病 毒 (R adish
yellow e@ e virus ， R Y E V )。 他们认 为 ： 侵染 萝 卜的 R Y E V 属于 双 分病毒科 (P artitiviridae ) 的 o【 一 潜隐
病毒属 (A lpha cryptovirus )， 该 病毒 只能通 过 种子 传播 ， 从 病毒粒 子 中提 取 的基 因组 为 dsR N A 形 式 ，
P A G E 胶 电泳结果显 示共有 5 条带 。 分子量换算成碱基数约为 1 ． 9 1 、 1 ． 84 、 1 ． 78、 1 ． 68、 1 ． 60 kb。 他
们也 发现 了有些 萝 卜中只含有较大的 3 条 dsR NA 。 对于这种 dsR N A 的多样性有过两 种推测 ： 1 ) 两 条
较小条带为依赖于基 因组 条带 的 satellite dsR NA ， 有 的 R Y E V 分离 物不 携 带这 两 条 satellite R N A ； 2)
两条较小条带为另 一 个病毒的基 因组 ， 该病毒 与 3 条较大条带组 成 的病毒共 同侵染萝 卜 (N atsuakiet
a1． ， 1983 )。 迄今为止 ， 还 没有 R Y E V 基 因组 序列信息的报道 。
近年来 ， 我们在杭州市郊发 现 多株 ‘ 一 点红 ’ 萝 卜植 株 叶 片带有 黄边 ， 且 该 现 象较 为普遍 。 从
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l2l4 园 艺 学 报 35卷
萝 卜叶片中分离到大小在 1 500～2 000 bp的
cDNA，且已经分析报道了克隆所得的5条带。
克隆得到一条新的序列，将其命名为 RasR 6；
的全长序列。
dsRNA条带。利用 SPAT方法获得相关 dsRNA条带的
继续应用 SPAT方法从该品种萝 卜叶片组织 dsRNA中
并且通过分段 (3段)克隆的方法重复获得了 RasR 6
RasR 6比RasR 2小 13 bp，5％聚丙烯酰胺凝胶电泳难以把二者分离开。RasR 6全长为 1 778 bp，
其正义链最大开放编码框编码一个55．1 kD的蛋白质，BLAST检索结果显示有5个蛋白序列与其具有
较高的相似性，且它们均编码 Partitividae成员的 cP。对 ‘一点红’萝 卜中的6条 dsRNA的核酸序列
比对，结果显示：RasR 6与RasR 1和RasR 2的5 UTR序列高度保守，而RasR 6的5 UTR与RasR
3、RasR 4和RasR 5的5 UTR则没有明显的相似性。初步推测 RasR 6与RasR 1、RasR 2同属于RasV
1，且 RasR 6与 RasR 2共同编码该病毒的 cP，同时不排除RasR 6作为 RasV 1的卫星RNA存在的可
能性。要证明关于 RasR 6与 RasR 2共同编码 RasV 1外壳蛋白的假设，可以在大肠杆菌中表达 RasR
2和RasR 6编码的蛋白，并制备抗体。用血清学手段来检测病毒粒子提取物中是否含有 RasR 2和
RasR 6编码的蛋白质。
如果 RasR 6也编码 CP，即说明RasV 1的外壳可能由两种蛋白组成，与目前对 Partitiviridae成员
的认识不一致。关于这两个蛋白是如何相互作用的，以及 RasV 1为什么会由两种蛋白组成 CP等问
题，都有待于更深入的研究。
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