全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 881～884
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 02 - 15; 修回日期 : 2005 - 05 - 15
基金项目 : 中国博士后科学基金资助项目 (2004036478)3 通讯作者 Author for correspondence
萝卜中一未知 dsRNA全长 cDNA克隆及其序列
刘　莉 1 　陈集双 23 　喻　珊 3 　王　冲 3
(1 湖州师范学院生命科学学院 , 湖州 313000; 2 浙江理工大学生物工程研究所 , 杭州 310018; 3 浙江大学生命科学学
院 , 杭州 310029)
摘 　要 : 采用双链 RNA ( double2stranded RNA, dsRNA ) 分析法 , 发现杭州市近郊的部分萝卜植株及
其子代含有约 118 kbp的 dsRNA; 在聚丙烯酰胺凝胶上可分离为大小接近的 dsRNA1和 dsRNA2。以 dsRNA1
为模板 , 采用单引物扩增法获得其全长 cDNA; 克隆测序确认为 1 866 nt; 预测其最大开放阅读框 ORF
(Open Reading Frame) 为 574个氨基酸 , 与双分病毒属 ( Partitivirus) 中部分病毒的 RdRp (RNA dependent
RNA polymerase) 氨基酸序列具有一定的同源性。推测此 dsRNA可能为萝卜黄边病毒 ( radish yellow edge
virus, RYEV) 感染所致。
关键词 : 萝卜 ; 双链 RNA; cDNA克隆 ; 核酸序列 ; 萝卜黄边病毒
中图分类号 : S 63111; S 436131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520881204
Full2length cD NA C lone and Sequences Ana lysis for Unknown D ouble2stran2
ded RNA Isola ted from Rad ish
L iu L i1 , Chen J ishuang23 , Yu Shan3 , and W ang Chong3
(1 Faculty of L ife Sciences, Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, China; 2 Institu te of B ioeng ineering, Zhejiang Sci2Tech
U niversity, Hangzhou 310018, Ch ina; 3 College of L ife Sciences, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, China)
Abstract: Some characters of unknown dsRNA s isolated from radish were identified. The dsRNA s could
be detected from some radish p lants and their offsp ring by dsRNA s analysis app roach. The dsRNA swere sepa2
rated into two fragments in polyacrylam ide gel, named dsRNA1 and dsRNA2, respectively with their sizes of
app roximately 118 kbp. Full2length cDNA of dsRNA1 was obtained by single p rimer amp lification technique,
and its size of 1 866 ntwas determ ined. RT2PCR also showed that dsRNA1 was of radish p lant origin. The re2
sults of BLASTP suggested that the biggest putative ORF1 was distantly related to RNA dependent RNA poly2
merase encoded by some species of Partitivirus. The molecular aspects of dsRNA s, and some biological char2
acters of p lants, seem related to rad ish yellow edge virus (RYEV) p reviously described.
Key words: Radish; Double2stranded RNA; cDNA cloning; Sequence; R ad ish yellow edge virus
1　目的、材料与方法
植物组织中大分子双链 RNA的存在常常与 RNA病毒的感染有关。dsRNA分析方法已作为植物病
毒研究的重要手段之一。笔者采集杭州市近郊的部分萝卜 (栽培品种 ‘一点红 ’) 叶组织经 dsRNA
谱带分析 , 确认获得的 118 kbp左右的 dsRNA为一核酸序列未知的条带 , 在聚丙烯酰胺凝胶中分离为
大小接近的两条带 , 即 dsRNA1和 dsRNA2。收集含有此 dsRNA的萝卜的种子 , 播种后至 5叶龄期提
取叶组织的 dsRNA和总 RNA, 用于进一步鉴定。
以 dsRNA1为模板 , 参照 SPAT ( Single Primer Amp lification Technique) 方法〔1〕克隆其全长 cDNA。
具体方法是在 T4 RNA L igase作用下 , 将 dsRNA的 3pi羟基端连接一 3pi端氨基化封闭的 p rimer A ( 5pi
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PO4 2TCTTCGGGTGTCCTTCCTCG2NH2 3pi) ; 然后采用序列与之互补的 p rimer B (5piCGAGGAAGGACA2
CCCGAAGA 3pi) 作为引物进行反转录 , 再以 p rimer B进行单引物 PCR, 扩增产物克隆于 T载体上。
经抗性及白斑初筛所得到的阳性克隆采用载体通用引物进行 PCR鉴定和玻片点杂交方法进一步鉴定。
杂交所用荧光标记探针的制备采用 PCR掺入法 , 即以阳性克隆的质粒为模板 , 在 PCR反应体系中添
加 Cy52dCTP对产物进行标记。以萝卜叶组织的总 RNA、dsRNA粗提物、分离回收的 dsRNA1和 dsR2
NA2作为检测样品 , cDNA 克隆的质粒 DNA 作为阳性对照 , 黄瓜花叶病毒 ( cucum ber m osa ic virus,
CMV ) 的 dsRNA作为阴性对照。点杂交结果用玻片扫描仪检测。
插入有外源 cDNA片段的克隆测序后 , 采用 Primer Prim ier 510软件设计两对特异性引物 ; 分别以
叶组织的总 RNA和 dsRNA作为模板 , 进行 RT2PCR扩增 , 进一步验证序列的来源。序列分析采用
DNA tools 610软件和 B last软件。
2　结果、分析与讨论
采自杭州地区的萝卜植株叶片 , 大多无明显的症状 , 有的叶片边缘轻微发黄。部分样品的 dsRNA
粗提物中含有 118 kbp左右的条带 (图 1) , 在高盐条件 (NaCl 1 mol·L - 1 ) 下可耐受 RNaseA 和
DNase的降解作用 (图 2) ; 且在它们的子代叶组织中可检测到同样的 dsRNA组分 ; 经 5%聚丙烯酰
胺凝胶电泳后 , 可分离为大小接近的两条带 (图 3)。该 dsRNA这些特征以及少数植株在某些生长阶
段下表现出叶片边缘轻微黄化的症状 , 与日本学者曾报道的 RYEV的感染比较相似〔2, 3〕。RYEV是双
分体病毒科 ( Partitiviridae) α -潜隐病毒属 (A lphacryptovirus) 的 1个种 , 至今尚无其核酸序列报道。
该病毒为种传病毒 , 其核酸为 2～3分子线形 dsRNA, Natsuaki曾报道〔3〕经氯化铯密度梯度离心所得
到的 dsRNA的分子量换算为碱基对约为 1191 kbp、1184 kbp、1178 kbp, 与我们提取的 dsRNA大小接
近 ; 而且他们的报道中也提到曾分离得到两条 dsRNA, 与本文结果相符合。
图 1　田间萝卜植株叶组织中 dsRNA粗提物 ( 1%琼脂糖凝胶 )
1～5: 含 118 kbp dsRNA的萝卜植株 ; 6: 不含 118 kbp
dsRNA的萝卜植株 ; M: DNA分子量标准。
F ig. 1　Crude dsRNA isola ted from rad ish in f ield
1 - 5: Samp les with dsRNA of 118 kbp; 6: Samp le without
dsRNA of 118 kbp; M: DNA marker. 图 2　高盐条件下 RNa seA和 D Na se降解后的 dsRNA粗提物 ( 1%琼脂糖凝胶 )1: RNaseA和 DNase降解后的 dsRNA粗提物 ;M: DNA分子量标准。F ig. 2　Crude dsRNA d igested by RNa seA and D Na se1: Crude dsRNA digested by RNaseA and DNase; M: DNA marker.
　　以 dsRNA1为模板 , 采用 SPAT方法获得了全长 cDNA扩增产物 (图 4)。 cDNA阳性克隆的玻片
点杂交结果显示 (图 5) , 以插入片段制备的探针 , 与萝卜中 dsRNA 粗提物、 dsRNA1、以及携带
dsRNA的萝卜植株总 RNA杂交呈阳性 , 而与 dsRNA2、无 dsRNA的萝卜植株总 RNA杂交呈阴性。证
实克隆得到的 cDNA插入片段源于萝卜中的 dsRNA1。
经测序 , 确定 dsRNA1的全长 cDNA大小为 1 866 nt ( GenBank登录号 : AY748911)。其中腺嘌呤
和胸腺嘧啶 (A + T) 占 5517% , 鸟嘌呤和胞嘧啶 ( G + C) 占 4413%。dsRNA1正义链的 3pi末端具有
间断的 poly (A ) 尾 , 总共有 19个腺苷酸 (A )。该 poly (A ) 尾被尿嘧啶 (U ) 分成 3段 , 最长的
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　5期 刘 　莉等 : 萝卜中一未知 dsRNA全长 cDNA克隆及其序列 　
图 3　5%聚丙烯酰胺凝胶中的 dsRNA
1: 5%聚丙烯酰胺凝胶中的 dsRNA1和 dsRNA2; M: DNA分子量标准。
F ig. 3　Electrophoresis of dsRNA in 5% polyacrylam ide gel
1: dsRNA isolated from radish m igrated as two fragments,
dsRNA1 and dsRNA2; M: DNA marker.
图 4　单引物扩增 dsRNA1全长 cD NA
1: dsRNA1全长 cDNA扩增产物 ; M: DNA分子量标准。
F ig. 4　Am plif ica tion of full2length cD NA for dsRNA1
1: Full2length cDNA for dsRNA1; M: DNA marker.
连续有 11个 A。根据所测序列设计两对特异性引物 , 即 p rimer 12F: 5piGTCAAATCTTGAATACCTCG2
GAC 3pi (72～94) , p rimer 12R: 5piGTTGCTTGGATAATTGC 3pi ( 473～492) ; p rimer 22F: 5piGGAATC2
TACTACGCAAGTTGTG 3pi (1 483～1 504) , p rimer 22R: 5piTTAGATCGTCTCAACTTGGAAG 3pi (1 770～
1 791) , 并分别以总 RNA和 dsRNA作为模板进行 RT2PCR, 结果均得到了 420 bp和 308 bp的扩增产
物 (图 6) , 进一步证实了此段 cDNA序列来自萝卜中的 dsRNA。
采用 DNA tools 610软件 , 预测 dsRNA1核酸序列中最大的 ORF位于 69～1 791, 编码 574个氨基酸。
这一 ORF的氨基酸序列经 BLASTP进行比较 , 发现与双分病毒科 ( Partitiviridae) 中的 Helicobasid ium
m om pa partitivirus V122 (AB110980)、Heterobasid ion annosum partitivirus (AF348136)、Oyster mushroom
isometric virus II (AY308801) 等编码的 RdRp有
一定同源性 , 表明该基因片段属于一个 Partitiviri2
dae成员的基因组。根据 dsRNA特征和相应植株
的某些生物学特点 , 以及 dsRNA1全序列的初步
分析 , 推测该 dsRNA的存在可能与 RYEV的感染
有关。
图 5　玻片点杂交法鉴定 cD NA阳性克隆
1, 3: cDNA 阳性克隆质粒 ; 2: CMV的 dsRNA提取物 ;
4: dsRNA1; 5: dsRNA2; 6: 萝卜 dsRNA粗提物 ; 7, 9: 含
dsRNA植株的总 RNA; 8: 不含 dsRNA植株的总 RNA。
F ig. 5　Iden tif ica tion of positive clones by gla ss slide hybr id iza tion
1, 3: Plasm id of positive clones; 2: dsRNA of CMV; 4: dsRNA1;
5: dsRNA2; 6: Crude dsRNA; 7, 9: Total RNA of p lant with
dsRNA; 8: Total RNA of p lant without dsRNA.
图 6　RT2PCR验证序列的来源
1, 2: 以萝卜 dsRNA为模板 , 分别以 p rimer 1和 p rimer 2进行
RT2PCR的扩增产物 ; 3, 4: 以萝卜总 RNA为模板 , 分别以
p rimer 1和 p rimer 2进行 RT2PCR的扩增产物 ; 5: 无模板的
阴性对照 ; M: DNA分子量标准。
F ig. 6　The detection of or ig in of the sequence by RT2PCR
w ith spec if ic pr im er
1, 2: Amp lification of two specific target fragment by RT2PCR with
dsRNA from radish; 3, 4: Amp lification of two specific target fragment
by RT2PCR with total RNA from radish; 5: Negative control without
temp lates ; M: DNA marker.
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参考文献 :
1　Lambden P R, Cooke S J, Caul E O, Clarke IN. Cloning of noncultivatable human rotavirus by single p rimer amp lification. Journal of V irolo2
gy, 1992, 66 (3) : 1817～1822
2　Natsuaki T, Yamashita S, Doi Y, Yora K. Radish yellow edge virus, a seed2borne small spherical virus newly recognized in Japanese radish
(R aphanus sa tivus L. ) . Annals of Phytopathological Society of Japan, 1979, 45 (3) : 313～320
3　Natsuaki T, Yamashita S, Doi Y, Okuda S, Teranaka M. Radish yellow edge virus, a seed2borne virus with double2stranded RNA, of a possi2
ble new group. Annals of Phytopathological Society of Japan, 1983, 49 (5) : 593～599
收稿日期 : 2005 - 02 - 21; 修回日期 : 2005 - 07 - 18
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2004AA241120)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fenghuiaaa@2631net)
羽衣甘蓝游离小孢子培养初报
姜凤英 1, 2 　冯 　辉 13 　 (1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161; 2 辽宁省农科院花卉研究所 , 沈阳 110161)
Em bryogenesis and Plan t Regenera tion of O rnam en ta l Ka le v ia Isola ted
M icrospore Culture
J iang Fengying1, 2 and Feng Hui13 (1 College of Horticulture, Shenyang A gricultural U niversity, Shenyang 110161, China;
2 Floriculture Institu te of L iaoning A cadem y of A gricultural Science, Shenyang 110161, China)
关键词 : 羽衣甘蓝 ; 小孢子 ; 胚状体
中图分类号 : S 63519　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520884201
本文介绍了羽衣甘蓝 (B rassica oleracea L. var. acepha la DC. ) 游离小孢子培养诱导出胚状体 , 并获得再生植株的
研究结果。国内还未见羽衣甘蓝小孢子培养成功的报道。
将 5个羽衣甘蓝 F1 杂交种 ‘红欧 ’、‘白欧 ’、‘皱叶红心 ’、‘皱叶白心 ’和 ‘皱叶玫红 ’穴盘育苗 , 盆栽。开
花后 , 取长 310～510 mm的花蕾分离小孢子。用 NLN213培养液稀释 , 以每皿 215 mL悬浮液分装入Φ 60 mm的培养
皿内 , 用 Parafilm封口 , 置于恒温箱中静置暗培养。2周后观察胚状体发生情况。挑出子叶期的胚接种到改良 MS培养
基上 , 置于 25℃、12 h /d光照的培养室中继续培养。
结果表明 : 在 NLN213培养基上 , 游离小孢子热激培养 1 d后 , 部分小孢子出现明显的膨大。培养 2～3 d, 小孢
子发生第 1次分裂。红欧和皱叶红心小孢子发生细胞分裂 , 并在培养 3周后 , 获得了胚状体 (图版 , 1) , 出胚率分别
为 0110和 0134胚 /蕾 , 其他 3个品种无胚状体形成。在添加 BA (0105～016 mg/L) 和 NAA (0～014 mg/L) 的 NLN2
13培养基上 , 小孢子培养 2～3 d后 , 有 4个品种小孢子细胞分裂 , 其中红欧、皱叶红心和皱叶白心获得了胚状体 ,
出胚率分别为 0132, 0158和 0137胚 /蕾。胚状体经过 30 d培养分化成幼苗 (图版 , 2)。
在上述 NLN213培养基上 , 分别添加 50、100、150μL的琼脂糖 (500 mg/L) 和活性炭 (10 000 mg/L ) , 小孢子
培养 2～3 d后 , 5个供试品种的细胞分裂情况与未添加的相似。培养 15～20 d, 挑出子叶期的胚 , 将剩下的胚分成两
组 , 一组在添加琼脂糖和活性炭 100μL的新鲜培养基上培养 , 另一组置于未加琼脂糖和活性炭的基本培养基上培养。
15 d后观察发现 , 前者培养基上幼胚发育快 , 大部分能发育成子叶形胚 ; 后者培养基上幼胚发育迟缓 , 只有少部分能
发育成子叶形胚。将子叶形胚接种到改良 MS培养基上 , 培养 3～5 d, 胚状体开始变绿 , 胚根伸长并长出根毛。经过
15 d的培养 , 整个胚状体变成绿色 , 同时分化出小芽。在添加和不加活性炭的培养基上都能诱导成苗 (图版 , 3) ,
但前者芽苗长得健壮 , 不经过壮苗培养就可直接转接到生根培养基上诱导生根 , 移栽成活后 , 获得小孢子植株 (图
版 , 4)。琼脂糖和活性炭对提高羽衣甘蓝小孢子胚状体发育有促进作用。
图版说明 : 1. 小孢子培养获得的胚状体 ; 2. 小孢子胚萌发成幼苗 ; 3. 继代苗 ; 4. 成活小孢子植株。
Explana tion of pla tes: 1. Embryoid via isolated m icrospore culture; 2. The cotyledonary embryoid formed p lantlet; 3. Regenerated p lantlet;
4. Survival p lantlet from m icrospore culture.
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