全 文 ：第 28 卷 第 2 !钓
9 19 5年 6 月
实 验 生 物 学 报 V o l . 2 8 , N o . 2
A e t a B i ol o g ia e E x P e r i m e n ta l i s S i n je a J u n e 1 9 9 5
蝶兰胚珠的 c D N A 文库构建及其
特异基因表达的研究 带
张宪省 阎先喜 马 小杰 邢树平
( 111东农业大学袋{:出部 , 泰安 2 7 1 0 2 5 )
愁~
花粉和胚囊在被子植物有性生殖过程 中起
着非常重要的作用 。 近年来关于花药和花粉发
育基因调控的研究工作巳有较多的报道 [ `一 “ , ,
而胚珠和胚囊发育的分子 生物 学研 究 工作尚
少 14 一 J 。 本工作以蝶兰为材料 , 构建了大 抱子
母细胞和成熟胚囊时期 胚 珠 的两个 c D N A 文
库 , 分别筛选出胚珠特异 c D N A , 并从中各选
择一个 c D N A 对其表达进行 研 究 , 以期为进
一步分析研究胚珠发育的基因调控奠定基础 。
材 料 和 方 法
一 、 实狡材料
蝶兰 ( P h a艺a e n OP s止s a M t . K a a l a e v S M 9 1 0 8 )生长
在温室条件下 。 用相差显微镜确定胚珠的发育时期 ,
液氮迅速冷冻不同发育时期的胚珠 及 其 它 的植物组
织 , 一 70 ℃冰柜保存备用 。
二 、 切片和显徽照相
不同发育时期的胚珠用 3 % 的戊 二醛磷酸缓冲液
( 0
.
o s m o l / L
,
p H 7
.
o )固定 2 4 h 。 J B越 塑料 ( P of y s e i -
e n e e I n e
.
U S A )包埋 。 切片厚度为 1 . 5一 2 . 0 卜m , 高
碘酸锡夫试剂和苯胺蓝黑染色 。 N ik on o P T IP H o T
显微镜观察与拍照 。
三 、 总 R N A 和 P o l y A 十 R N A 的分离
总 R N A 的提取采用 C a t h a l a 等〔g J的方法 。 p o l y -
A
+
R N A 的分离利用 0 119 0 ( d T )一 e e ll u l o s e 柱 ( P h a r m -
a c i a L K B B i ot e c h n o l o g y I n e
.
)
。 将总 R N A 溶 解在
结合缓冲液中 ( 1 0 mmo l / L T r i s pH 7 . 6 , 1 m m o l / L
E D T A PH S
。
0 , 0
.
1% S D S
,
0
.
5 m o l / L N
a C I
,
·
0
.
0 5%琉基乙醇 ) , 然后使其通过 0 119 0 ( d T )一 e l一u l o s e
柱 , 收集洗脱液 , 重复上柱一次 。柱子内 P Ol y A ` R N A
用洗脱缓冲液 ( 1 0 m m ol / L T r i s p H 7 . 6 , 1 m m ol L/
E D T A P H 8
.
0 , 0
.
1% S D S
,
0
.
0 5 %疏基乙醇 )洗脱 。
3 m ol / L 酉昔酸钠和 乙醉沉淀 R N A 。
四 、 c D N A 合成及文库构趁
双链 e D N A 合成以胚珠的 P o l y A + R N A ( 5 “ g )为
模板 , 使用 S t r a t a g e n e 公司的 Z A P一 e D N A s y n t h e s i s
K it
, 并按其说明进行 。 T 4D N A 聚合酶修平 c D N A 末
端 , T 4D N A 连接酶将 E e o R I A d a p t o r接在 e D N A 分
子两端 , 然后 X h of 消化 。 选取 5 0 0一4幻0 0 b p 大 小 }`自
e D N A 片断 , 连接在 U n i一 Z A P X R 载体 J二 , G i g a p a k
亚抽提物包装载体 , 建成 c D N A 文库 。 P C R 检 测 克
隆到的 c D N A 片断 , 引物为 T : 和 T , , 洲℃ 1 m in ,
5 5℃ Z m i n , 7 2℃ 3 m i n , 2 0 个循环 。
五 、 c D N A 探针合成及克班肺选
c D N A 探针的合成以 5 林9 P of y A + 为模板 , 反转
录酶来自 P h ar m ac ia 公司 , 放射性同位素 a 一 3护d A T P
标记 。 克隆筛选按 st r at ag e n e 公司的 说明进行 。 将培
养出的噬菌斑转移到硝基纤维素膜上 , 一式三份 。 然
后对硝基纤维素膜进行变性和 中 和 处理 , 经过预杂
交 、 杂交和洗涤等步骤 , 与 K o d o k X A R一 5 光片一起
曝光 。
六 、 R N A 分子杂交
总 R N A 在 1 . 2% 琼脂糖 巨电泳 6 h , 然后 转移到
硝基纤维素膜上 。 预杂交后再与探针杂交 。 杂交探针
的制备以筛选出的 c D N A 克隆为模板 , a 一” P d C T P 标
定 , 随机引物法合成 。
结 果 和 讨 论
一 、 c D N A 文库构盆及克隆肺选
本文 1 9 9 4 年 4 月 7 日 收 到 。 19 9 5 年 1 月 5 日接
受。
` 本文的 c D N A 文库构建及克隆筛选是在美国加
州大学 D r . S h a r ma n O ’ N e i l l 实验室完成 , 特此致
谢。
张宪省 阎先喜 马小杰 邢树平 2 8 卷
蝶兰不同于绝少: 多数被子植物 , 授粉启动 A
了子房内胚珠的分化和发有 , 海个子房内含上
万枚发育基本 同步的胚珠 。 胚珠从授粉后第 5
周开始分化 , 至第 12 周发育成熟 , 需时长达 2
个多月 (表 1 ) 。 其成熟胚珠为双珠被 、薄珠心 、
胚囊发育属寥型 〔` 。 ’ 。
k b
. 4
.
0
. 2 0
~ 1
。
0
一 0 . 5
衰 1 授粉后胚珠的发育过程
授粉后的时间
第 5周
第 6 周
第 8 周
第 10 周
第 12 周
胚珠发育进程
胚珠原基
抱原细胞
大抱子母细胞
减数分裂
成熟胚珠
分别在胚珠发育的大抱子母细胞和成熟胚
珠时期 ( 图 卜 A , B ) , 构建了胚珠的两个 c D N A 圈
2 P C R 检浦克隆出的 c D N A 片断大小
A
. 从大饱子母细胞时期胚珠的 c D N A 文 库随机
选职的 10 个克隆 。 B . 从成熟胚珠的 c D N A 文库随
机选取的 10 个克隆。
圈 1 两个不同发育时期的胚珠
A 一大抱子母细胞时期的胚 珠 。 x 350
B
. 成熟胚珠 。 x 350
文库 。 每个 c D N A 文库含有大约 3 x l 。 ’ 。 噬 菌
斑单位 (每毫升 ) 。 从 每 个 c D N A 文库中 随机
选取 10 个噬菌斑的 D N A 做 P C R , 结 果 其载
体 D N A 均含 c D N A 插入片断 , 随机克隆样本
片断大小在 5 0 一 4 0 0 0 b p 左右 , 与构建 c D N A
文库用的 D N A 片断大小一致 (图 2一 A 、 B ) 。
克隆筛选采用 差 异 杂 交 法 ( d i f r e r e n t i a l
h y b r id i z a t i o n ) [
“ ] , 即合成三份 e D N A 探针 ,
其中一份探针的合成以与 构 建 c D N A 文 .库相
同的胚珠 m R N A 为模板 (正探针 ) , 一份 探 针
以与构建 c D N A 文库相应发育时 期 的子 房壁
m R N A 为模板 (负探针 ) , 再一份 探 针是以 与
构 建 另 一 个 c D N A 文 库 相 同 时 期的 胚 珠
m R N A 为模板 (负探针 ) 。 比较正负探针杂交结
果 , 从大抱子母细胞时期胚珠的 c D N A 文库 中 ,
获得 32 个 与 正探针杂交信号 较强 , 但 与 负
探针杂交无信号或信号较弱的 C D N A 克隆 。 从
成熟胚珠的 c D N A 文库中 , 获 得 2 7 个 c D N A
克隆 , 它们与正探针杂交信号较强 , 与负探针
杂交信号较弱或无信号。
二 、 两个胚珠特异 c D N A 的表达
2 )明 蝶狡胚珠的 c D N A 文库构建及其特异基因表达的研究
从上述两个 c D N A文库 所筛选出 的 克 隆
中 , 各选择一个 c D N A , 对其在不同发育时期的
胚珠和植物体不同器官内的表达进行了研究 。
来自大抱子母细 胞 时 期 胚 珠 c D N A 文 库 的
c D N A
, 其 m R N A 只在胚珠 内积累 , 未在具他
器官内积累 。 进一步分析该 ` c D N A 在胚珠不同
发育时期的表达 , 结果显示在未授粉 、 授粉后
1 周和 4周的子房内均无 其 m R N A 积 累 。 在
授粉后 6周 ( 抱原细胞期 、 、 8周 (大抱子 母 细
胞时期 )和 10 周 (大抱子母细胞减数分裂期 )的
胚珠中 , 其 m R N A 十分丰富 , 大小为 1 . 5 k ob
而在成熟胚珠中 ( 12 周 ) , 其 m R N A 不再 合成
(图版 I , 图 A ) 。 另一个来自成熟胚珠 c廿N A
文库的 c D N A , 其 m R N A 只在成 熟籽珠 中积
累 , 大小为 1 . 4 k b , 在其他器官内未探测 到该
e D N A 的 m R N A ( 图版 I , 图 B ) 。
以上研究结果表明 , 这 两 个 c D N A 为胚
珠特异的 c D N A , 并且这两个 c D N A 在胚珠生
一民发育期间表达的 时 间 不 同 , 说 明 该 两 个
。 D N A 在胚珠生长发育过程 中 , 分别受不同的
因子调控 。 在拟南芥中 , 已发现几个与 胚 珠
发育密切相 关 的 基 因 , 如 sI N I 、 B E L l 和
o v M 3
。 其中任何一个基因突变均可导致胚珠
发育异常 , 雌性不育 e[, 7〕。 如 sI N I 基因突变
后 , 突变体的胚珠具有短珠被 , 胚珠成熟时珠
被不能象正常的珠被那样 , 覆盖住珠心 , 同时
在珠心内的大抱子母 细 胞 不 能 进 行 减 数分
裂 r 6 ]。 而 B E L I 基因的突变体 , 其胚珠只有外
珠被发育 , 最终外珠被发育成包围珠心的厚环
状组织 , 同时尽管大抱子母细胞似乎可以进行
减数分裂 , 但随后配子体败育 e[J 。 该两个基因
突变体的胚珠发育特点显示出基因控制的珠被
发育和珠心内的大抱子发生或胚囊发育之间存
在密切联系 。 进一步的研究工作还揭示出在胚
珠发育后期 , B E L I 基因对 A G 基 因 (心 皮 形
成所必需的基因 )具有负调控作用 〔“ , 。
由于蝶兰的每个子房内含上万枚发育基本
同步的胚珠 , 并且胚珠的发育时间较 一长 , 这就
为我们获得 不 同 发 育 时 期 胚 珠 的 P ol y A +
R N A
, 构建 “ D N A 文库提供了方便 。 通过差 异
;
、 ·
杂交法得到的克隆在胚珠生长发育巾的作用尚
不清楚 , 进一 步分析其核酸顺序及其在胚珠 中
表达的组织 , 井结合分子遗传学技术将有 一可能
确定其在胚珠生 一长发育期阿的功能 。
摘 · 要 ,
以蝶兰 ( P 孔a Za e 儿o P s艺s “ M t 二 K a a l a ” e v S M
9 1 0 8) 为材料 , 分别提取大袍子母细 胞 时期胚
珠 和 成 熟 胚 珠 的 P ol y A 十 R N A , 反 转 录 成
c D N A
, 构建起两个 c D N A 文库 。 克 隆筛选采
用差异杂交法 。 从上述两个 c D N A 文库中 , 各
选择 一 个筛选出的 。 D N A , 对其节 植物林不同
` 器官和不同发有时期的胚珠内的表达进行了分
析 、 ,结果表明该两个 ` D N A 均为胚珠特异 , 并
月. 分别在胚珠发育的特定时期表达 。 J一庄测该两
个 “ D N A 的表达受胚珠内部的 ·不 同因子调控 。
关锐词 : 胚珠 c D N A 文库 基因裹达
参 考 文 献
〔 1 〕 M a s e a r e n h a s , J . P . , 1 9 9 0 , G e n e 一 a e t i v i t y
d u
r
i n g P o l l e n d e v e lo P m e n t
.
A ” 凡 u . R郡 ·
P l a n 才 P h y s公0 2 . P Za 儿云 M o l· B i o 乙· , 4 :
3 1 7一 3 3 8 。「2 〕 B r o w n , S · M · a n d M · L · C r o u c h , , 1 9 9 0 ,
C h a r a e t e r j z a t i o n o f a g e n e f a m i l y a b u n
-
d a n t l y e x p r e s s e d i n O e n o 才为e r a o r g a ” e -
砚 s 玄5 p o r l e n t h a t s h o w s s e q u e n e e s im i l a r i-
t y t o P o l y g a la e t u r o n a s e
.
T儿e P正a 灯 t C e Z乙,
2 : 2 6 3一2 7 4 .
〔 3 〕 K o l t u n o w , A . M . , J . T r u e t t n e r . K . 11 .
C o x
,
M
.
W a l l r o t h a n d R
·
B
·
G o ld b e r g
,
1 9 9 0
,
D i f f e r e n t t e m P o r a l a n d s P a t i a l
g e n e e x P r e s s io n P
a t t e r n s o e e u r d u r i
n g a n
-
t h e r d e v e l o p m e n t
.
T五e P l a n 艺 C e l l , 2 :
1 2 0 1一 1 2 2 4 .仁4 卫 B o u m a n , F . , 1 9 8 4 , T h e o v u l e , I n “ E m -
b r y o l o g y o f A n g i o s P e r m s
· ”
S p r in g e r一 v e r -
l
a g
,
B e r l i n
,
p P 1 2 3一 1 5 7 .
〔 5 〕 唐锡华 , 1 9 9 2 , 植物繁殖器官分 化发 育的
分子基础 。 见 “ 植物生理与分子生 物 学 ” ,
科学出版社 , 北京 , P P 2 87一 2 9 9 .
〔 6 〕 R o b i n s o n 一 B e e r s , K . , R . E . P r u i t t a n d C . 5 .
G a s s e r
,
1 99 2
, o v u l e d e v e l o Pm e n t i n w i
·
2 3 0 张宪省 阎先六 今小杰 邢树可户 2 8 卷
l d一 t y P e A r o b该d o P s东5 a n d t w o f e m a l e一
s t e r i l e m u t a n t s
.
T h e P忍a 打 t C e忍忍, 4 :
1 2 3 7一 1 2 4 9 。
【7 〕 R e i s e r , L . a n d R . L . F i s e h e r , 1 9 9 3 , T h e
o v u l e a n d t h e e m b r y o s a e
.
T h e P l a 矛Z t
C e忍l , 5 : 1 2 9 1一 1 3 0 1 。
〔 8 〕 M o d r u s a n , 2 . , L . R e i s e r , K . A . F e l d m a n n -
R
.
L
.
F i s e h e r a n d G
.
W
.
H a u g h n
,
1 9 9 4
,
H Om e o t i e t r a n s f o r m a t io n o f o v u l e s i n t o
e a r P e l一 l ik e s t r u e t u r e s i n A r a b i d o P s东s · T h e
P la 砚 t C e 乙不, 6 : 3 3 3一3 4 9 。
〔 9 〕 C a t h a la , G . , J . F . S a v o u r e e , B . M e n d e z ,
B
.
L
.
W
e s t
,
M
.
K a r i n
,
J
.
A
.
M a r t ia l
a n d J
.
D
.
B a x t e r
,
1 9 8 3
,
A m e th od f o r
i s o l a t io n o f i n t a e t t r a n s l a t i o n a l ly a e t i v e
r l b o n u e l e i e
a e i d
. 刀 N A , 2 : 3 2 9一 3 3 5 。
「1 0 刃 Z h a n g , X · 5 . a n d 5 . D . 0 ’ N e川 , 1 9 9 3 ,
o
v a r y a n d g a m e t o Ph y t e d e v e lo Pm e n t a r e
e o o r d i n a t e l y r e g u l a t e d b y a u x i n a n d e t h
-
y l e n e f o l l o w i n g P o l l i n a t io n
·
T h e P l a ” t
C e ZI
,
5 : 4 0 3一4 1 8 。
[
一
1 1 1 W
a t s o n
,
J
.
D
. ,
M
.
G i lm a n
,
J
.
W i t k
o w
·
s
k i a
n
d M
.
Z o l l e r
,
1 9 92
,
R e e o m b i n a n t
D N A
.
F r e em a n W
.
H
.
a n d C o m P a n y
,
N e w Y o
r
k
,
P P 1 0 7一 1 1 1 。
C O N S T R U C T I O N O F T H E O V U L E e D N A L I B R A R Y A N D
G E N E E X P R E S S IO N D U R IN G O V U L E D E V E L O P -
M E N T IN P H A L A E N O P S I S O R C H I D
Z h a n g X i a n 一 s h e n g Y a n x i a n 一 x i M a X i a o 一 j i e
( A g r i e u忍t u r a艺 U扮止, e r s东ty o f S h a矛卫d o 矛19 , T a 东a n
X i n g S h u 一 P i n g
2 7 ] 0 1 8 )
A B S T R A C T
T w o o v u l e e D N A l ib r a r i e s i n P h a l a e
-
” 。 p s艺5 o r e h i d w e r e e o n s t r u e t e d . o n e o v u l e
e D N A l ib r a r y w a s i n m e g a s P o r e m o t h e r
e e l l s t a g e
, a n o t h e r o n e w a s i n m a t u r e
o v u l e s t a g e
.
o v u l e e D N A e l o n e s w e r e s e
-
r e e n e d w i t h d i f f e r e n t i a l h y b r i d i z a t i o n m e
-
t h o d
.
E x P r e s s i o n P a t t e r n s o f t w o o v u le
e D N A s f r o m b o t h l i b r a r i e s w e r e e x a m i n e d
d u r i n g o v u l e d e v e l o Pm e n t a n d i n d i f f e r e n t
o r g a n s
.
T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t b o
-
t h o f 一h e m w e r e o v u l e s P e e i f i e , a n d t h e i r
m R N A s d i f f e r e n t l y a e e u m u l a t o d i n s o m e
s t a g e s o f t h e o v u l e d e v e l o Pm e n t
.
T h e r e 15
t h e P o s s i b i l j t y t h a t t h e e x P r e s s i o n P a t t e r
-
n s o f b o t h e D N A s a r e r e g u l a t e d b y t h e
o v u l e s t h e m s e l v e s
.
K e y w o r d s : o v u l e
.
e D N A l i b r a r y
.
G e n e e x p r e s s i o n
.
户臼`
图 ”版
理二户 , , , 盆
二名呼
,习卜护.
23 2张宪省 阎先喜 马小杰 邢树乎 28 卷
圈 版 说.
图 版
R N A杂交法分析胚珠特异c DN A在胚珠发育期间及植物体不同器官 内 的 表 达 (1 5此总R N A /
L a ne )
。 该c DN A来自大抱子母细胞时期胚珠c DN A文库 。
a. 未授粉子房 b. 授粉 后 1周 子房c. 授粉后 4周子房d. 抱原细胞期胚珠 (授粉后 6周 )
e 。 大泡子母细胞期胚珠 (授粉后8 周 ) f. 减数分裂期胚珠 (授粉后0 1周 )9. 成熟胚珠 (授粉后
1 2周 ) h. 大抱子母细胞期胚珠 1. 大抱子母细胞期子房壁j 。 花瓣k. 雌蕊 1. 叶片 m. 根
R N A杂交法分析胚珠特异c DN A在胚珠发育期间及植物体 不同 器官内 的表达 (1 5阳总R N A /
L a ne )
。 该c N A D来自成熟胚珠c N A D文库。
a. 未授粉子房 b. 授粉后 1周子房
e . 大饱子母细胞期胚珠 (授粉后 橄周 )
c 。 授粉后 4周 子房d 。 饱原细胞期胚珠 (授粉 后 6周 )
f
. 减数分裂期胚珠 (授粉后0 1周 )
后 1 2周 ) h. 成热胚珠 1. 成热胚珠期子房壁 j. 花瓣k. 雌蕊 1. 叶片
g
。 成熟胚珠 (授粉
m
。 根
E X PL N A ATO I NOF F I G U获皿S
PL ATE
B
。
R N Abl o thybri i d z ati o ns hw oi
ng the e x p re s si o nP at te r ns o fthe ov ule s Pe e l i fe e DN A
fr om the e N A U Dbr ar yi nme gs aO Pre m o the re e l l s t a邵d uri ng ov ule de ve l oPme nt a nd
i nde f fe e r ntr og a ns (1 5鸿 to t alR N A)· a. u nO Pl l i a nte dv o ar yb。 1 we e k ov r ay f ate r
p o fl i nati o ne
.
4 we e k s ov ar y afte rO P川 a nti o nd. ov l ue i nac r he s P ori ale dl s t age
( 6we e k s afte r P ol l j a nti o n)e
.
v oule i nme g as pe r om o the re e l l s t ae g (s w。吹 5 afte r
p ol l i nati o n) f
. ov ule i nme i osi s s t age (0 1 we e k s afte r 脚i 11 nati o n)`. m atr ue v oue l
(1 2 we e k s afte rp ol l i nt ai o n) h
. ov ule i nme gs a卯e r m o the c re l l s t age 1. v o ar y w al l i n
m昭s a因re m o the rce l l s t age j. pe t al k. gye o nc i I U n1
.
le afm
.
r o
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.
R N Al b o thybri i d z o t f a ns hw oi
ng the e x Pe rs si o nP at te rs n
o fthe ov ule se Pc i fie e DN A
fr om the m t aue rv oule c N A Dl i br r ayd r ui ng ov ule 血ve l 即 me t na ndi ndi f fe r 亡 ntor B as n·
a。 u nO Pl l i a nte dv or ayb
.
1 we e kv or ay afte r 加i 11 a nti o ne . 4e we k sv or ay afte rp ol l i na·
tl a nd
.
v ol ue i nare he s 加ri ale e l l s t age ( 6we e k s afe tr 加l l i a nti o n)e . v oe l u布 nme g- a
sO Pe r m o the re e l l s t age (5 we e k s afte rp ol l i nati o n) f
.
v ol ue i nme j osi s s t昭e (0 1 we e k s
afte rp ol i nati o n)9
.
m ature v oule (1 2 we e k s afte rp oll i a nti o n) h
。
m ate r uv oule 1
. v o·
r ay w al l i nm atr ue v ol ue s t age j
,
Pe t a l k
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