全 文 ：收稿日期:2015-06-24
基金项目:国家自然科学基金(81202458);全军医药科研“十二五”面上项目(CLZ12JA04);中国博士后科学基金(2012M521926)
作者简介:景临林(1982-)，男，博士，主管药师，主要从事抗缺氧新药研究;Tel:0931-8994671，E-mail:lfjinglinlin@ 163. com。
* 通讯作者:马慧萍，Tel:0931-8994671。
藏紫菀醇提物的抗氧化与抗缺氧作用研究
景临林，马慧萍* ，蒙 萍，樊鹏程，贾正平
(兰州军区兰州总医院药剂科 /全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃 兰州 730050)
摘要 目的:对藏紫菀乙醇提取物(EEAS)的体外抗氧化及抗缺氧作用进行研究。方法:采用 DPPH·、羟自由
基、超氧阴离子清除和还原力检测方法考察 EEAS的抗氧化作用，并对其总黄酮和总多酚含量进行测定;利用缺氧
PC12 细胞模型对其抗缺氧作用进行评价。结果:EEAS 富含黄酮和多酚化合物，对 3 种自由基均表现出一定的清
除活性，其中对超氧阴离子的清除活性优于 VC，同时表现出一定的 Fe
3 +还原能力。EEAS能显著增加缺氧 PC12 细
胞的活力，降低缺氧 PC12 细胞 LDH活性和 MDA 含量，提高 SOD、CAT、GSH-Px 及 T-AOC 活性。结论:EEAS 是一
种活性优异的天然抗氧化剂，同时对缺氧导致的 PC12 细胞氧化损伤具有明显的保护作用。
关键词 藏紫菀;抗氧化;PC12 细胞;抗缺氧活性
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)02-0398-06
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 02. 040
藏紫菀是一种传统藏药，以缘毛紫菀 Aster sou-
liei Franch. 的干燥花絮入药。缘毛紫菀为菊科紫菀
属多年生草本植物，生长于海拔 3 000 ～ 4 500 m 的
湿润草地和沼泽地，主要分布在西藏大部分地区及
四川、云南、甘肃等地〔1〕。藏紫菀味辛性温，且温而
不燥，归肺经，具有清热解毒、止咳祛痰的功效，主治
支气管炎、咳嗽多痰、肺结核，咳血等病〔1〕。文献报
道藏紫菀的化学成分主要有黄酮和萜类化合物〔2〕，
但关于其药理作用的研究鲜有报道。藏紫菀常年生
长在低压低氧的应激环境中，笔者猜测其体内含有
的一些物质可能具有良好的抗氧化和抗缺氧活性。
为了证实上述猜想，本研究对藏紫菀醇提物的体外
抗氧化活性及对缺氧 PC12 细胞的保护作用进行了
研究。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 PC12 细胞株购自上海中科院细胞
库。
1. 2 药物与试剂 藏紫菀购自拉萨当雄商贸有限
公司，经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授
鉴定为菊科植物缘毛紫菀 Aster souliei Franch. 的干
燥花絮。干燥的藏紫菀 200 g，粉碎后加入 10 倍量
70%乙醇浸泡过夜，超声提取 1 h，重复 3 次，合并提
取液，过滤，减压浓缩干燥得浸膏 34 g，得藏紫菀乙
醇提取物(Ethanol extract of Aster souliei，EEAS);乙
酰唑胺购自武汉远城科技发展有限公司;活性氧
(ＲOS)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化
物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧
化物酶(GSH-Px)和总抗氧化能力(T-AOC)检测试
剂盒购自南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-
三硝基苯肼(DPPH·)、MTT、DMEM 培养基及二甲
基亚砜(DMSO)购自美国 Sigma 公司;还原型辅酶
Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗坏血酸(VC)、
硫代巴比妥酸(TBA)购自阿拉丁试剂公司;芦丁标
准品、没食子酸标准品购自中国食品药品检定研究
院;其余均为国产分析纯试剂。
1. 3 主要仪器 Spectramax i3 多功能酶标仪(美国
Molecular Devices 公司);SK3300L 超声清洗器(上
海精密仪器仪表有限公司);BP210S 电子天平(荷
兰赛多利斯有限公司);JY92-2D超声波细胞粉碎仪
(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV2800SPC 紫
外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公
司);Milli-Q去离子水制备仪(美国 Millipore 公司);
MCO-15AC二氧化碳细胞培养箱(美国 Thermo Ｒev-
co公司);TH4-200 倒置相差显微镜(日本 Olympus
公司)。
2 方法
2. 1 自由基清除实验
2. 1. 1 DPPH·自由基清除实验〔3〕:向 125 μL 不
同质量浓度的样品溶液中分别加入 125 μL 0. 1
mmol /L DPPH· 70%乙醇溶液，室温下暗处反应 30
min，以 70%乙醇溶剂作空白对照，测量其在波长
517 nm 处的光密度 D(λ)i。将 125 μL 70%乙醇溶
液分别与 125 μL DPPH· 70%乙醇溶液和 125 μL
样品溶液混合后，测定其在波长 517 nm 处的光密
度，分别记为 D(λ)0和 D(λ)j。并计算其清除率及
EC50。
·893· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月
清除率(%)=［1 －
D(λ)i － D(λ)j
D(λ)0
］× 100 %
2. 1. 2 羟自由基清除实验〔4〕:向 500 μL 不同质量
浓度样品溶液中依次加入 50 μL 28 mmol /L脱氧核
糖(溶于 pH = 7. 0 的 0. 2 mmol /L PBS)、50 μL ED-
TA(1 mmol /L)、50 μL FeCl2(1 mmol /L)和 50 μL
H2O2(1 mmol /L)，最后加入 50 μL VC(1 mmol /L)
启动反应，37 ℃水浴孵育 1 h后依次加入 250 μL三
氯乙酸(10%)和 250 μL TBA(0. 5%，溶于 25
mmol /L的 NaOH 溶液)，沸水中孵育 0. 5 h，测定
532 nm处光密度 D(λ)i，用 500 μL 蒸馏水代替样
品溶液，测得光密度 D(λ)0，用 PBS 代替脱氧核糖
测得光密度 D(λ)j。同“2. 1. 1”项下方法计算其清
除率及 EC50。
2. 1. 3 超氧阴离子清除实验〔5〕:向 100 μL 不同质
量浓度的样品溶液中依次加入 50 μL NADH(500
μmol /L，溶解于 0. 2 mol /L pH = 7. 4 的 PBS 中)、50
μL NBT(200 μmol /L)和 50 μL PMS(20 μmol /L)。
混合均匀后室温下反应 8 min，测定其在 560 nm 处
的光密度 D(λ)i。用 100 μL 70%乙醇替代样品，混
合后测定其 560 nm处的光密度 D(λ)0;用 50 μL水
取代 PMS，混合后测定其在波长 560 nm处的光密度
D(λ)j。同“2. 1. 1”项下方法计算其清除率及 EC50。
2. 1. 4 还原力实验〔6〕:不同质量浓度的样品和 VC
溶液 1. 0 mL，加入 0. 2 mol /L 的磷酸盐缓冲液(pH
= 6. 6)2. 5 mL和 1%的铁氰化钾溶液 2. 5 mL，50 ℃
水浴孵育 20 min，快速冷却，然后加入 2. 5 mL 10%
(m/V)三氯乙酸溶液，混合溶液 3 000 r /min离心 10
min，精密吸取上清液 2. 5 mL，加入 2. 5 mL 蒸馏水
和 0. 5 mL 0. 1%的三氯化铁溶液，在 700 nm处测光
密度 D(λ)，光密度值越大，还原力越强。
2. 2 总黄酮和总多酚含量测定
2. 2. 1 总黄酮含量测定〔7〕:将 50 μL NaNO2 溶液
(5%)加入 500 μL 的不同质量浓度的芦丁标准品
溶液(0 ～ 140 μg /mL)中，混合均匀。室温下静置 6
min后加入 50 μL Al(NO3)3 溶液(10%)，混匀后静
置 6 min，最后加入 250 μL NaOH 溶液(4%)，再次
混合均匀后静置 15 min，测定其在 518 nm 处光密
度，每个样品重复 3 次，取平均值。根据实验结果建
立标准曲线。根据芦丁标准曲线，按照相同方法计
算样品中总黄酮含量。
2. 2. 2 总多酚含量测定〔8〕:将 1 mL Folin-Ciocalteu
试剂分别与 100 μL 的不同质量浓度的没食子酸标
准品溶液(0 ～ 140 μg /mL)充分混合后，加入 1 mL
Na2CO3 溶液(7%)，室温放置 5 h，测定其在 760 nm
处光密度，每个样品重复 3 次，取平均值。根据实验
结果建立标准曲线。根据没食子酸标准曲线，按照
相同方法计算样品中总酚含量。
2. 3 抗缺氧活性研究
2. 3. 1 PC12 细胞的培养:用含有 10%胎牛血清、
100 U /mL 青霉素和 100 U /ml 硫酸链霉素的 DMEM
培养基，于 5% CO2、饱和湿度、37 ℃环境下的三气
培养箱中进行培养，每隔 48 h 更换新的培养液。细
胞大约铺满皿底 80%后传代。
2. 3. 2 MTT 法测定细胞活力:将对数期生长的
PC12 细胞接种于 96 孔板中，计数后将接种密度调
整为 1 × 105 /mL，每孔 100 μL，置于三气培养箱中正
常培养 24 h，更换培养基，加入不同浓度的 EEAS 预
处理细胞 1 h，每个浓度设 6 个复孔，在 5% CO2(V /
V)和 95% N2(V /V)的缺氧条件下培养 48 h，弃上
清，用无菌的 PBS 漂洗 1 次，每孔加入 20 μL MTT
(终浓度为 0. 5 g /L)，继续培养 4 h 后每孔加入 100
μL DMSO，振荡 10 min至蓝色晶体完全溶解，在 570
nm波长下测定 D(λ)值，筛选 EEAS 抗缺氧的最佳
浓度。
2. 3. 3 细胞形态学观察:细胞接种于 60 mm 培养
皿中，分为正常对照组(不缺氧)、缺羞模型组(缺
氧，CO2 ∶ N2 = 5% ∶ 95%，48 h)、EEAS 预处理组(0. 5
μg /mL EEAS 预处理 1 h 后缺氧，CO2 ∶ N2 =
5% ∶ 95%，48 h)，倒置显微镜观察各组细胞的形态
变化及生长情况。
2. 3. 4 LDH活性检测:细胞接种于 60 mm 培养皿
中，实验分组与缺氧处理同“2. 3. 3”项下，实验结束
后吸取培养基上清液，按 LDH检测试剂盒操作说明
书操作并计算 LDH活性。
2. 3. 5 MDA含量检测:细胞接种于 60 mm 培养皿
中，实验分组与缺氧处理同“2. 3. 3”项下，实验结束
后收集细胞，根据 MDA检测试剂盒操作说明测定。
2. 3. 6 抗氧化酶活力测定:细胞接种于 60 mm 培
养皿中，实验分组与缺氧处理同“2. 3. 3”项下，实验
结束后收集细胞，根据 SOD、CAT、GSH-Px 和 T-AOC
检测试剂盒操作说明书操作进行检测。
2. 3. 7 细胞内 ＲOS 测定:将对数期的 PC12 细胞
接种于 96 孔板中，缺氧处理结束后，弃掉培养基，用
无菌的 PBS清洗 1 遍，加入含有 100 μmol /L DCFH-
DA无血清培养基，37 ℃下孵育 30 min，预先原位装
载 DCFH探针，采用酶标仪以 488 nm激发波长，525
nm发射波长，检测各孔荧光值。胞内 ＲOS 水平用
正常对照组百分比表示。
2. 4 统计学处理 实验数据均用 珋x ± s 表示，并采
·993·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月
用 SPSS 19. 0 统计软件对组间数据进行 One-way
ANOVA统计学分析，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学
意义。
3 结果
3. 1 抗氧化活性研究
3. 1. 1 DPPH·自由基清除能力:结果如图 1 所
示，EEAS对 DPPH·自由基的清除作用具有一定的
浓度依赖性。当浓度为 80 μg /mL时，其对 DPPH·
的清除率达到了 71. 01%，随着浓度的继续增加，其
清除率变化不大。EEAS和 VC 清除 DPPH·的 IC50
分别为(58. 00 ± 2. 16)μg /mL和(30. 39 ± 0. 43)μg /
mL。
图 1 藏紫菀醇提物对 DPPH·自由基的清除作用
3. 1. 2 羟自由基清除能力:结果如图 2 所示:随着
EEAS浓度的升高，其对·OH 的清除能力逐渐增
强，具有明显的浓度依赖性，EEAS 与 VC 清除·OH
的 IC50分别为(109. 36 ± 2. 47)μg /mL 和(70. 83 ±
2. 45)μg /mL。
图 2 藏紫菀醇提物对·OH的清除作用
3. 1. 3 超氧阴离子清除能力:结果如图 3 所示，当
浓度低于 200 μg /mL时，随着浓度的升高，EEAS 和
VC 对 的清除能力逐渐增强。EEAS 表现出比 VC
更强的 的清除能力。EEAS 和 VC 清除 的 IC50
分别为(222. 94 ± 14. 50)μg /mL 和(482. 94 ± 3. 24)
μg /mL。
3. 1. 4 还原力:结果如图 4 所示，随着浓度的升高
EEAS和 VC 在 700 nm的光密度逐渐升高，尽管 EE-
AS表现出一定的二价铁离子还原能力，但在相同浓
度下，VC 的光密度值始终高于 EEAS。
图 3 藏紫菀醇提物对 的清除作用
图 4 藏紫菀醇提物的还原力
3. 2 总黄酮和总多酚含量:通过对藏紫菀乙醇提
取物中总黄酮和总多酚的含量进行测定，结果表明
其总黄酮的含量高达(420. 92 ± 2. 27)mg 芦丁 / g 提
取物，多酚含量为(213. 65 ± 1. 96)mg 没食子酸 / g
提取物。
3. 3 抗缺氧活性研究
3. 3. 1 EEAS对缺氧 PC12 细胞活力的影响:结果
如表 1 所示，随着 EEAS 浓度的升高，D(λ)值逐渐
升高，且 EEAS各组 D(λ)值均显著高于模型组(P
＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。当 EEAS 终浓度为 0. 5 μg /
mL时，所测得的 D(λ)值最高，表明在该浓度下缺
氧 PC12 细胞活力最高，因此，后续实验均在该浓度
下进行。
表 1 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12 细胞
活力的影响(珔x ± s，n =6)
组别 浓度 /(μg /mL) D(λ)570
正常对照组 － 0. 617 ± 0. 034＊＊
缺氧模型组 － 0. 365 ± 0. 012
EEAS组 0. 0625 0. 394 ± 0. 011*
0. 125 0. 431 ± 0. 025＊＊
0. 25 0. 446 ± 0. 009＊＊
0. 5 0. 460 ± 0. 009＊＊
1 0. 452 ± 0. 014＊＊
注:与缺氧模型组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
3. 3. 2 EEAS对缺氧 PC12 细胞形态的影响:结果
·004· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月
如图 5 所示，正常对照组 PC12 细胞呈梭形，边界清
晰，大小均匀，折光度强，贴壁生长，缺氧模型组细胞
体积变大变圆，折光度减小，增殖缓慢，经 EEAS 预
处理后，细胞体积变小，数量增多，折光度增强，缺氧
损伤情况明显减轻。
3. 3. 3 EEAS对缺氧 PC12 细胞 LDH漏出的影响:
结果如图 6 所示，与正常对照组比较，缺氧模型组培
养基 LDH活性显著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比
较，EEAS组培养基 LDH活性显著降低(P ＜ 0. 01)。
图 5 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12 细胞形态的影响(×200)
图 6 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12 细胞
LDH漏出的影响(珔x ± s，n =3)
注:与缺氧模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3. 3. 4 EEAS对缺氧 PC12 细胞内 MDA 含量的影
响:结果如图 7 所示，与正常对照组比较，缺氧模型
组细胞内 MDA 含量显著升高(P ＜ 0. 01)。与模型
组比较，EEAS 组细胞内 MDA 含量显著降低(P ＜
0. 01)。
图 7 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12
细胞内MDA含量的影响(珔x ± s，n =3)
注:与缺氧模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3. 3. 5 EEAS对缺氧 PC12 细胞抗氧化酶的影响:
结果如表 2 结果所示，与正常对照组比较，缺氧模型
组 SOD、CAT、GSH-Px及 T-AOC活性显著降低(P ＜
0. 01)。与缺氧模型组比较，EEAS 组 SOD、CAT、
GSH-Px及 T-AOC活性显著升高(P ＜ 0. 01)。
表 2 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12 细胞抗氧化酶的影响(U/mg prot，珔x ± s，n =3)
组别 浓度 /(μg /mL) SOD CAT GSH-Px T-AOC
正常对照组 － 55. 16 ± 3. 24＊＊ 18. 43 ± 1. 42＊＊ 24. 56 ± 1. 20＊＊ 2. 83 ± 0. 23＊＊
缺氧模型组 － 24. 22 ± 1. 76 9. 85 ± 0. 40 13. 24 ± 0. 74 1. 25 ± 0. 34
EEAS组 0. 5 40. 64 ± 1. 35＊＊ 13. 45 ± 0. 78＊＊ 18. 67 ± 0. 96＊＊ 2. 12 ± 0. 45＊＊
注:与缺氧模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
3. 3. 6 EEAS对缺氧 PC12 细胞 ＲOS 水平的影响:
结果如图 8 所示，与正常对照组比较，缺氧模型组细
胞 ＲOS水平显著升高(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，
EEAS组细胞 ＲOS水平显著降低(P ＜ 0. 01)。
4 讨论
活性氧簇(ＲOS)，包括羟自由基(·OH)、超氧
阴离子( )、过氧化氢(H2O2)和单线态氧等，是机
体的正常代谢产物。在生理状态下，机体内存在内
源性抗氧化体系，包括抗氧化酶和非酶抗氧化剂，能
及时清除体内产生 ＲOS，保持自由基代谢平衡。但
当机体处于病理状态时，机体内氧化平衡会出现紊
乱，产生的ＲOS无法及时清除，造成ＲOS蓄积。过
·104·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月
图 8 藏紫菀醇提物(EEAS)对缺氧 PC12 细胞
ＲOS水平的影响(珔x ± s，n =3)
注:与缺氧模型组比较，＊＊P ＜ 0. 01
量的 ＲOS 会攻击蛋白质、核酸等生物大分子，造成
细胞凋亡或坏死。许多疾病的发生都与 ＲOS 蓄积
有关〔9〕。有研究表明:适当摄取抗氧化剂能保护机
体免受 ＲOS诱导的氧化应激损伤，对多种疾病具有
预防和治疗作用〔10〕。人工合成抗氧化剂应用非常
广泛，但其存在一定的肝毒性〔11〕。因此，从天然产
物当中寻找高效低毒的天然抗氧化剂越来越受到人
们的关注。
藏紫菀生长环境独特，为了抵抗低压低氧诱导
的氧化应激，其体内可能含有抗氧化和抗缺氧活性
物质。本研究首先采用 DPPH·、·OH、 清除实
验和还原力评价 EEAS 的抗氧化活性。DPPH·是
一种稳定的含氮自由基，其乙醇溶液呈深紫色，抗氧
化剂可使其颜色变浅。该法具有操作简便、灵敏度
高的特点，已经广泛用于植物提取物样品的抗氧化
活性测定。·OH被认为是 ＲOS中活性最强的自由
基，能无选择性的攻击几乎所有生物大分子，造成细
胞损伤。研究表明:心血管疾病、肿瘤、糖尿病以及
阿尔兹海默病的发生均与·OH 有关。 自身活性
较弱，但其能在体内转化成活性更强的 H2O2 和·
OH。还原力是评价样品潜在抗氧化活性的重要指
标，通过对 Fe3 + 的还原，可抑制芬顿反应，减少·
OH的生成。从研究结果可看出:藏紫菀乙醇提取
物对 3 种自由基均表现出优异的清除活性，同时具
有较强的还原力，是一种非常有前景的天然抗氧化
剂。
黄酮和多酚是植物体内含有的非常重要的次生
代谢产物，也是许多植物提取物抗氧化作用的物质
基础〔12〕。EEAS中总黄酮和总多酚的含量均较高，
可能是其发挥抗氧化作用的物质基础。
缺氧对机体产生损伤的作用机制较为复杂，目
前尚不完全明确，但自由基蓄积是损伤产生的重要
原因之一。为此，本研究利用缺氧 PC12 细胞模型
考察了 EEAS的抗缺氧作用。实验结果表明，EEAS
能显著提高缺氧 PC12 细胞的活力，并呈剂量依赖
性。
当细胞产生损伤时，细胞内 LDH 会发生外漏，
导致培养基中 LDH 活性升高，因此，LDH 活性的变
化可反映细胞的损伤程度〔13〕。实验结果表明:EE-
AS能降低缺氧 PC12 细胞培养基中 LDH的活性，维
持细胞膜的完整性，减轻缺氧导致的细胞损伤。
脂质过氧化是评价机体内氧化水平的重要指
标。MDA是脂质过氧化反应中的最终产物之一，其
含量可以反映脂质过氧化的程度〔14〕。本实验结果
表明，经 EEAS预处理后，缺氧 PC12 细胞中 MDA含
量显著降低，表明 EEAS 能显著抑制缺氧导致的脂
质过氧化。
SOD、CAT和 GSH-Px 是体内重要的抗氧化酶。
SOD可通过歧化反应将·OH 转化为 H2O2，生成的
H2O2 可进一步被 CAT 和 GSH-Px 清除
〔15〕。三者协
同维持机体内自由基代谢的稳态。T-AOC 反映了
机体综合抗氧化能力。从研究结果可以看出:低氧
处理 48 h，PC12 细胞中 SOD、CAT、GSH-Px 活性和
T-AOC能力显著降低，表明细胞中抗氧化系统被破
坏，自由基代谢紊乱，ＲOS 大量蓄积，造成细胞损
伤。而 EEAS能提高缺氧条件下 PC12 细胞中抗氧
化酶的活性，维持机体内自由基代谢稳态，缓解缺氧
诱导的氧化应激。
综上所述，藏紫菀乙醇提取物表现出优异的体
外抗氧化活性，是一种高效的天然抗氧化剂，其含有
的高浓度总黄酮和总多酚，可以作为获得该类化合
物的天然来源。同时，藏紫菀乙醇提取物能显著增
加缺氧 PC12 细胞的存活率，维持细胞膜的完整性，
降低脂质过氧化，其机制可能与维持细胞内抗氧化
酶的活性、调节自由基代谢有关。
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·304·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 2 期 2016 年 2 月