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响应面法优化草本水杨梅多酚超声辅助提取工艺及抗氧化活性



全 文 :2015 年 2 月 第 17 卷 第 2 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Feb. 2015 Vol. 17 No. 2
·中药工业·
△[基金项目] 国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01) ;国家公益性行业科研专项(201303111) ;吉林省科技发展计划项
(20126046,20140204013YY,YYZX201258) ;国家自然科学基金(31000154)
*[通信作者] 赵岩,副教授,硕士生导师;E-mail:zhyjlu79@ 163. com;
张连学,教授,博士生导师;E-mail:zlx863@ 163. com
响应面法优化草本水杨梅多酚超声辅助
提取工艺及抗氧化活性

张岳1,赵岩1* ,蔡恩博1,刘双利1,杨鹤1,张连学1* ,王士杰2
(1. 吉林农业大学 中药材学院,吉林 长春 130118;2. 吉林农业科技学院 中药学院,吉林 132101)
[摘要] 目的:优化草本水杨梅多酚的超声提取工艺,并研究其抗氧化活性。方法:以草本水杨梅为原料,采
用超声辅助法提取草本水杨梅多酚,在单因素试验基础上,采用三因素五水平的响应面试验,优化工艺参数。
结果:草本水杨梅最佳提取工艺条件为乙醇浓度 33. 76%,超声提取时间 36. 94 min,液固比为 201. 78 mL·g -1,在此
条件下草本水杨梅多酚提取率为 9. 67%;三因素对草本水杨梅多酚提取率影响主次顺序为乙醇浓度 >超声提取时间
>液固比。并以水溶性 VC和 BHT为对照物,通过 DPPH自由基清除法和总还原力法对草本水杨梅多酚的抗氧化活
性进行了体外评价,发现在一定范围内草本水杨梅多酚的清除 DPPH自由基能力和总还原能力均随多酚浓度的增加
而上升。结论:由响应面法优化得到的草本水杨梅多酚的提取工艺方便可行,得到的草本水杨梅多酚具有较强的抗
氧化活性,为草本水杨梅资源的开发与利用奠定了基础。
[关键词] 草本水杨梅;多酚;超声波辅助提取;响应曲面设计;抗氧化性
Polyphenols from Geum aleppicum:Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process by
Response Surface Methodology and Antioxidant Activity Evaluation
ZHANG Yue1,ZHAO Yan1* ,CAI Enbo1,LIU Shuangli1,YANG He1,ZHANG Lianxue1* ,WANG Shijie2
(1. Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University,Jilin Changchun 130118,China;
2. College of Chinese Medicine,Jilin Academy of Agricultural Science and Technology,Jilin 132101,China)
[Abstract] Objective: The optimum conditions of ultrasonic extraction and antioxidant activities of Geum
aleppicum. Polyphenols(GP)were investigated in this paper. Methods:Response surface methodology(RSM)was employed to
optimize the ultrasonic-assisted extraction of GP. On the basis of one-factor-at-a-time experiments,polyphenols yield was
investigated by response surface methodology with respect to ethanol concentration,ultrasonic time and solid-liquid at five
levels. Results:The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration 33. 76%,ultrasonic time 36. 94
min and solid-liquid 201. 78 mL·g -1,and under this conditions,the yield of GP was 9. 67% . The primary and secondary
order of three factors affecting on extraction rate of GP were ethanol concentration > ultrasonic time > solid-liquid. The
antioxidant activity in vitro of the obtained extract was evaluated by DPPH free radical scavenging assay and total reducing power
using water-soluble Vc and BHT as the control. DPPH free radical scavenging capacity and reducing power increased with the
increasing concentration of GP in a linear dose-dependent manner. Conclusion:Optimization of the extraction process by RSM
of GP is convenient and feasible. GP has good antioxidant activity,and this laid the foundation for the development and
utilization of resources of G. aleppicum.
[Keywords] Geum aleppicum Jacq.; polyphenols; response surface methodology (RSM); ultrasonic-assisted
extraction;antioxidant activity
doi:10. 13313 / j. issn. 1673-4890. 2015. 2. 017
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2015 年 2 月 第 17 卷 第 2 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Feb. 2015 Vol. 17 No. 2
草本水杨梅别名追风七、老五叶、海棠菜,为
蔷薇科水杨梅属植物[1],主要分布于我国东北、华
北、西北等地区[2],长白山海拔 400 ~ 1500 m 山区
分布尤为丰富[3]。民间以其全草或根入药[4],具有
清热解毒、消肿止痛、利尿等功能[5],临床主要用
于治疗肠炎、腰腿疼痛、跌打损伤、小儿惊风、疥
疮、痈肿等症[6]。近年大量研究表明,合成抗氧化
剂 BHA /BHT具致癌作用,而天然抗氧化剂不仅能
抗衰老、抗辐射、捕集体内自由基的抗氧化等功
能[7-8],且抗氧化效率高、作用时间长、热稳定性
好、清除氧自由基能力强、毒副作用小[9-13]。多酚
类物质作为新型天然高效抗氧化剂,也越来越受关
注[14]。国内外研究发现,草本水杨梅中含有多酚类
物质[15-17],而对其多酚的提取工艺没有研究,抗氧
化活性方面也鲜有报道。笔者建立了草本水杨梅多
酚提取数学模型,并对其抗氧化活性进行初步研究,
以期为草本水杨梅多酚作为天然抗氧化剂的资源开
发利用提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
草本水杨梅采自吉林农业大学校园内,经水洗、
阴干、粉碎,备用;没食子酸(北京百灵威科技有限
公司);福林酚试剂(合肥博美生物) ;1,1-二苯基-
2-三硝基苯肼(DPPH)、维生素 C(Vc) (上海源叶生
物科技有限公司) ;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚
(BHT) (百灵威科技有限公司) ;其他试剂均为分
析纯。
1. 2 仪器与设备
CGT-3. 5K超声波清洗器(港威超声电子有限公
司) ;LD-34 流水式中药粉碎机(大海药材器械厂) ;
百灵 LA114 型电子天平(百灵天平仪器有限公司) ;
UV-1800 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限
公司) ;HH-W-600 型数显恒温水箱(金坛市江南仪
器厂)。
1. 3 方法
1. 3. 1 草本水杨梅多酚类物质的超声辅助提取 精
确称取 0. 10 g 草本水杨梅原料粉,放入三角瓶中,
加入一定量的提取溶剂,超声波提取多酚类物质,
抽滤后密封避光储存,待测。
1. 3. 2 多酚的测定 采用福林酚比色法测定[18],移
取 0. 5 mL 样品溶液放入 25 mL 容量瓶中,加入
2. 5 mL福林酚试剂和 2 mL质量浓度为 75 g·L -1的碳
酸钠(Na2CO3)溶液,50 ℃水浴加热 5 min,冷却后
用蒸馏水定容,760 nm 波长处测吸光度,以蒸馏水
为空白对照,没食子酸为对照品,采用外标一点法
计算多酚含量。
1. 3. 3 方法学考察
1. 3. 3. 1 精密度试验 重复测定同一草本水杨梅供
试品显色后溶液 6 次,测吸光度并计算 RSD。
1. 3. 3. 2 稳定性试验 分别在 0、0. 5、1、1. 5、2 h
测定同一草本水杨梅供试品溶液显色中的多酚含量,
计算得其 RSD。
1. 3. 3. 3 重复性试验 取同一样品粉末,按 1. 3. 1 项
下方法分别制备 6 份供试品溶液,显色后测定多酚
含量并计算其 RSD。
1. 3. 3. 4 加样回收率试验 取同一已知多酚含量的
草本水杨梅药材粉末 6 份,精密称定,分别加入适
量没食子酸标准品,按 1. 3. 1 项下方法制成供试品
溶液,显色后测定其多酚含量,计算平均回收率
和 RSD。
1. 3. 4 草本水杨梅多酚提取的单因素试验 分别以
乙醇浓度、超声时间、液固比 3 个因素作单因素试
验,考察各因素对多酚提取率的影响。
1. 3. 5 响应面分析法优化工艺条件 根据单因素试
验结果,进行响应曲面设计,优化草本水杨梅多酚
的提取工艺。
1. 3. 6 抗氧化活性测定
1. 3. 6. 1 DPPH自由基清除率的测定 吸取不同梯度样
品溶液3 mL与3 mL DPPH(质量浓度为0. 04 mg·mL -1)
溶液混合,室温避光静置 30 min后测定 515 nm处吸
光度(A1)。同时测定 3 mL 乙醇与 3 mLDPPH(A2)、
3 mL样品溶液与 3 mL 乙醇(A3)的 515 nm 处吸光
度,按如下公式计算 DPPH 清除率:SA% =(A2-A1
+ A3)/A × 100%
[19-21]。
1. 3. 6. 2 还原能力测定(铁氰化钾法)分别取不同梯
度样品溶液 2. 5 mL,加入浓度为 0. 2 mol·mL -1的磷
酸盐(pH = 6. 6)缓冲液 2. 5 mL 和 1% 铁氰化钾
[K3Fe(CN)6] 2. 5 mL,混合均匀,于 50 ℃反应
20 min,放凉,再加入 2. 5 mL10%三氯乙酸。从上
述混合液中取出 2. 5 mL放入新的刻度试管中,加入
2. 5 mL蒸馏水、0. 5 mL 0. 1%氯化铁(FeCl3)溶液,
以甲醇为空白对照,BHT、VC为对照品,在 700 nm
波长处测定吸光值。铁离子还原法测定的吸光度值
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越高,则代表该化合物还原力越强[22-23]。
1. 3. 7 数据处理 采用 SAS Server 7. 0软件对试验结果
进行响应面分析,建立数学模型,用岭脊分析优化试验
工艺,并采用 Origin V8. 0软件进行直观作图分析。
2 结果与分析
2. 1 单因素试验结果
2. 1. 1 乙醇浓度的确定 在超声时间为 30 min、液固
比为 200 mL·g -1的条件下,分别采用体积分数为 0、
20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液提取草本
水杨梅多酚,乙醇浓度和多酚提取率的关系见图 1。
图 1 乙醇浓度对多酚提取率的影响
由图 1 可知,随乙醇浓度增加,提取率呈现出
先增加后逐渐降低的趋势,其中以 60%乙醇溶液提
取效果最好。由于多酚是一大类极性范围很广的物
质,根据相似相溶原理,当提取溶剂的极性与多酚
的极性接近时,多酚的提取效果会更好,所以适当
的乙醇浓度有利于醇溶性和水溶性多酚的溶出[24]。
考虑到提取成本及操作方便性,可将乙醇浓度考察
范围定为 0 ~ 60%。
2. 1. 2 超声时间的确定 在液固比 200 mL·g -1、乙醇
浓度为 60%的条件下,分别超声提取 5、10、20、30、
40、50 min,超声时间和多酚提取率的关系见图 2。
图 2 超声提取时间对多酚提取率的影响
由图 2 可知,整体趋势上,随着超声提取时间
的延长,草本水杨梅中多酚的溶出量逐渐增大。
10 ~ 20 min,提取率增长缓慢;20 ~ 40 min,提取率
增加较快;40 ~ 50 min,提取率增加平缓。考虑到
实际生产中的耗能和效率问题,提取时间过长会使
生产周期延长,提高生产成本,增高能耗[22],因此
超声提取时间考察范围定为 20 ~ 50 min。
2. 1. 3 液固比的确定 分别以液固比 20、50、100、
150、200、250、300 mL·g -1,60%乙醇溶液对草本
水杨梅超声提取 50 min,液固比和多酚提取率的关
系见图 3。
图 3 液固比对多酚提取率的影响
由图 3 可知,随液固比增大,草本水杨梅中多
酚提取率逐渐增大。液固比 20 ~ 150 mL·g -1,提取
率增加幅度较大;液固比 150 ~ 300 mL·g -1,提取率
增加缓慢。考虑到实际生产中溶剂回收问题,应尽
可能选择较小的液固比,液固比的考察范围定为
100 ~ 250 mL·g -1。
2. 2 方法学考察
2. 2. 1 精密度试验 由精密度试验结果得吸光度平
均值为 0. 402,吸光度 RSD值为 0. 87%(n = 6),表
明精密度良好。
2. 2. 2 稳定性试验 由稳定性试验结果得多酚含量
平均值为 4. 97%,多酚含量 RSD 值为 2. 16%(n =
5) ,表明稳定性良好。
2. 2. 3 重复性试验 由重复性试验结果得多酚含量
平均值为 4. 91%,多酚含量 RSD 值为 2. 44%(n =
6) ,表明重复性良好。
2. 2. 4 加样回收率试验 由加样回收率试验结果得
平均回收率为 99. 96%,RSD 值为 1. 75%(n = 6) ,
表明回收率较好,方法稳定、可靠,可用于草本水
杨梅多酚的含量测定。
2. 3 响应面分析法优化工艺条件
2. 3. 1 响应面设计及结果 根据响应面设计原理,
综合单因素试验结果,以草本水杨梅多酚提取率
(Y)为响应值,通过响应曲面分析法优化提取条件。
以影响多酚提取率的 3 个因素:乙醇浓度(A)、超
声时间(B)、液固比(C)为自变量,采用三因素五水
平的响应面分析试验。试验因素与水平设计见表 1,
响应面分析方案与结果见表 2,其中 1 ~ 12 组为析因
试验,13 ~ 17 组为中心试验,用来分析试验误差。
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表 1 草本水杨梅多酚提取工艺响应面分析试验因素与水平
因素 代码
水平
- 1. 682 - 1 0 1 1. 682
乙醇浓度(%) A 0 12 30 48 60
超声提取时间 /min B 20 26 35 44 50
液固比 /mL·g - 1 C 100∶1 130∶1 175∶1 220∶1 250∶1
表 2 草本水杨梅多酚提取工艺响应面分析
试验设计及结果(n = 3)
实验号 A B C Y提取率(%)
1 30(0) 35(0) 175(0) 9. 38 ± 0. 28
2 30(0) 35(0) 175(0) 9. 78 ± 0. 68
3 30(0) 35(0) 175(0) 9. 58 ± 0. 38
4 48(1) 44(1) 220(1) 8. 65 ± 0. 25
5 48(1) 44(1) 130(- 1) 7. 40 ± 0. 29
6 48(1) 26(- 1) 220(1) 9. 19 ± 0. 36
7 48(1) 26(- 1) 130(- 1) 8. 00 ± 0. 32
8 12(- 1) 44(1) 220(1) 8. 43 ± 0. 33
9 12(- 1) 44(1) 130(- 1) 7. 69 ± 0. 38
10 12(- 1) 26(- 1) 220(1) 7. 26 ± 0. 36
11 12(- 1) 26(- 1) 130(- 1) 7. 65 ± 0. 23
12 0(- 1. 682) 35(0) 175(0) 6. 68 ± 0. 26
13 60(1. 682) 35(0) 175(0) 7. 60 ± 0. 38
14 30(0) 20(- 1. 682) 175(0) 8. 55 ± 0. 25
15 30(0) 50(1. 682) 175(0) 9. 20 ± 0. 27
16 30(0) 35(0) 100(- 1. 682) 8. 42 ± 0. 34
17 30(0) 35(0) 250(1. 682) 9. 05 ± 0. 27
2. 3. 2 响应面分析 利用 SAS Server7. 0 统计软件对
试验数据进行回归拟合,得到回归模型参数估计值,
见表 3,方差分析表见表 4,脊岭分析表见表 5。
表 3 回归系数显著性检验表
参数 自由度 预测值 标准差 t值 Pr > | t | 显著性
截距 1 - 1. 954 309 2. 465 960 - 0. 79 0. 4541 N
A 1 0. 189 579 0. 031 358 6. 05 0. 0005 **
B 1 0. 240 719 0. 079 443 3. 03 0. 0191 *
C 1 0. 040 483 0. 015 889 2. 55 0. 0382 *
A2 1 - 0. 002 790 0. 000 238 - 11. 72 < 0. 0001 **
AB 1 - 0. 001 812 0. 000 559 - 3. 24 0. 0142 *
B2 1 - 0. 003 442 0. 000 952 - 3. 62 0. 0086 **
AC 1 - 0. 000 323 0. 000 112 2. 90 0. 0231 *
BC 1 0. 000 366 0. 000 223 1. 64 0. 1454 N
C2 1 - 0. 000 162 0. 000 038 - 4. 26 0. 0038 **
注:**影响极显著,P < 0. 01;* 影响显著,P < 0. 0 5;N 影响
不显著,P > 0. 05。下同。
由表 3 可得,草本水杨梅多酚的提取量对所选 3
个因素的二次多项回归模型 Y = - 1. 954309 +
0. 189579A + 0. 240719B + 0. 040483C - 0. 002790A2 -
0. 001812AB - 0. 003442B2 + 0. 000323AC +
0. 000366BC - 0. 000162C2。在一次项的预测中,乙
醇浓度(A)对多酚提取率的影响最大(P < 0. 01) ,达
到极显著水平。超声提取时间(B)和液固比(C)对多
酚提取率的影响较大(P < 0. 05) ,达到显著水平,
三者影响大小顺序为:乙醇浓度(A)>超声提取时
间(B)>液固比(C) ;在二次项的预测中,A、B 和
C都达到了极显著水平(P < 0. 01) ;在交互项中,A
乘以 B、A乘以 C都达到了显著水平(P < 0. 05) ;截
距和交互项中的 B乘以 C均影响不显著(P > 0. 05) ,
删除不显著项,形 成 校 正 的 回 归 方 程: Y =
0. 189579A + 0. 240719B + 0. 040483C - 0. 002790A2 -
0. 001812AB - 0. 003442B2 + 0. 000 323AC -
0. 000162C2,其对提取率的预测值与实测值误差较
大。因此,放弃对回归方程的校正,在 P < 0. 5 水平
上接受所有系数及截距的假设。最终确定多酚提取
率的回归方程为:Y = - 1. 954309 + 0. 189579A +
0. 240719B +0. 040483C - 0. 002790A2 - 0. 001812AB -
0. 003442B2 +0. 000323AC +0. 000366BC -0. 000162C2。
表 4 回归模型的方差分析
项目 自由度 总离差平方和 相关系数 r F值 Pr > F 显著性
总模型 9 12. 68 0. 965 1 21. 51 0. 000 3 **
线性项 3 9. 059 682 0. 168 0 11. 23 0. 004 6 **
平方项 3 9. 059 682 0. 689 5 46. 10 0. 002 8 **
交互项 3 1. 414 115 0. 1076 7. 20 0. 015 2 *
总误差 7 0. 458 581
失拟项 5 0. 378 581 1. 89 0. 380 8 N
纯误差 2 0. 080 000
表 4 回归方程的方差分析可以看出,总模型、
线性项、平方项的 P < 0. 01,表明总模型和方程的
线性项、平方项对多酚提取率的影响极显著;而方
程的交互项的 P < 0. 05,表明其对提取率的影响显
著。相关性分析中,总模型的复相关系数 r =0. 965 1,
表明回归方程对多酚提取率的预测值与实测值有较
好的相关性。失拟性检验分析中,P > 0. 05,表明失
拟性不显著,该回归方程无失拟因素存在,回归方
程与实测值能较好地拟合。
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表 5 模型岭脊回归分析
编码
半径
响应预
测值
标准差
因子预测值
A B C
0. 0 9. 586 974 0. 147 283 30. 000 000 35. 000 000 175. 000 000
0. 1 9. 642 318 0. 146 345 31. 588 227 35. 329 596 181. 145 629
0. 2 9. 677 995 0. 143 683 32. 576 258 35. 741 508 188. 029 668
0. 3 9. 696 870 0. 139 787 33. 261 343 36. 276 779 194. 975 452
0. 4 9. 700 129 0. 135 559 33. 756 368 36. 943 233 201. 784 449
0. 5 9. 688 485 0. 132 416 34. 111 410 37. 732 881 208. 374 929
0. 6 9. 662 458 0. 132 301 34. 356 003 38. 629 801 214. 711 729
0. 7 9. 622 457 0. 137 412 34. 511 678 39. 615 314 220. 787 572
0. 8 9. 568 805 0. 149 584 34. 595 620 40. 671 405 226. 612 798
0. 9 9. 501 758 0. 169 699 34. 621 778 41. 782 481 232. 207 461
1. 0 9. 421 518 0. 197 667 34. 601 384 42. 935 889 237. 595 622
岭脊分析结果,见表 5,回归方程预测的多酚
最佳提取条件:乙醇浓度为 33. 76%,超声提取时间
36. 94 min,液固比为 201. 78 mL·g -1。为验证模型
的有效性,在上述条件下,进行了验证试验,3 次
重复性试验结果分别为:9. 65%、9. 67%、9. 52%,
试验值与预测值拟合良好,进一步说明模型的可
行性。
根据回归方程,作响应曲面图,考察所拟合的
响应曲面的形状,分析乙醇浓度、超声提取时间、
液固比对提取量的影响。响应曲面及其等高线如图
4 ~ 6 所示。等高线的形状可反映出交互效应的强
弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与
之相反[17]。图 4 ~ 6 直观地反映了各因素对响应值
的影响。
对图进行分析可得出,乙醇浓度对多酚提取量
影响极为显著,超声时间和液固比对多酚提取量的
影响较为显著。由图 4 的等高线图可知,超声提取
时间应在 30 ~ 40 min 选择,液固比应该在 160 ~
240 mL·g -1选择;由图 5 的等高线图可知,乙醇浓
度应在 30% ~ 45% 选择,液固比应该在 170 ~
230 mL·g -1选择;由图 6 的等高线图可知,乙醇浓
度应在 25% ~50%选择,液固比应该在 25 ~ 45 min
选择。以上响应面图和等高线图的分析结果也进一
步验证了通过岭脊分析而获得的最佳工艺参数。
2. 4 草本水杨梅多酚抗氧化活性测定
2. 4. 1 草本水杨梅多酚对 DPPH 自由基的清除能力
由图 7 可知,草本水杨梅多酚与 Vc 和 BHT 一样具
有较好的清除 DPPH 自由基的能力。在试验浓度范
图 4 Y = f(B,C)响应面图形(固定 A =30)
图 5 Y = f(A,C)响应面图形(固定 B =35)
围内,随着浓度的增加,其清除能力也逐渐增强,
呈现较好的量效关系。因此,草本水杨梅多酚提取
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液具有较强的清除 DPPH自由基能力。
图 6 Y = f(A,B)响应面图形(固定 C =175)
图 7 草本水杨梅多酚对 DPPH自由基的清除能力
2. 4. 2 草本水杨梅多酚的还原能力 由图 8 可以发
现,草本水杨梅多酚的还原能力低于对照组 Vc 和
BHT。整体来看,草本水杨梅多酚的还原能力随提
取液质量浓度的增加而提高,有较好线性对应关系。
图 8 草本水杨梅多酚还原能力测定
3 结论
3. 1 响应面分析法得到的超声波辅助提取草本水杨
梅多酚最优工艺:乙醇浓度为 33. 76%,超声提取时
间为 36. 94 min,液固比为 201. 78 mL·g -1,多酚提
取量为 9. 67%。乙醇浓度、超声提取时间、液固比
对草本水杨梅多酚的提取率有显著影响,影响大小
顺序为:乙醇浓度 >超声提取时间 >液固比。
3. 2 通过测定 DPPH自由基清除力和铁氰化钾还原法
两种体外抗氧化评价试验,发现草本水杨梅多酚具
有较强的自由基清除力及还原能力,在一定的浓度
范围内,提取液质量浓度与抗氧化活性呈现出较好
的线性关系。随着近几年对植物抗氧化成分研究的
不断深入,植物性抗氧化物质在医药、食品行业等
领域的使用日益增多。本研究为草本水杨梅资源的
开发和利用提供了理论依据。
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(下转第 166 页)
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择绿原酸为指标,通过测定其含量来评价归藤通管
灌肠剂的内在质量。
流动相选择上考察了甲醇和乙腈两种流动相,
乙腈紫外吸收小,产生的噪声小,适合在进行紫外
短波长上的高灵敏度分析。乙腈作为流动相压力较
小,对色谱柱的损害小,洗脱能力强且比甲醇出峰
早,因此选择了乙腈作为本试验的流动相。
临床上,归藤通管长期以汤剂给药,疗效确切,
未发生毒副作用。但汤剂煎煮、携带、服用不方便,
久置易霉变,故将其研制成灌肠剂,既保持了汤剂
的综合疗效,又解决了其不便之处。
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(收稿日期 2014-06-10
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