全 文 ：野生红花隔距兰根部内生真菌研究
王 琼， 谭志琼， 张荣意
（海南大学环境与植物保护学院， 海南 海口 570228）
摘 要：为了解内生真菌在红花隔距兰根部的种类多样性以及受生境的影响，采用组织培养法，对海南霸王岭
地区不同生境下的野生红花隔距兰根部进行内生真菌分离与鉴定。 结果共分离到内生真菌 145株，确定为 15属，其
中子囊菌门的 Penicillium 16 株，Aspergillus 12 株、Pestalotiopsis 5 株、Fusarium 19 株、Neonectria 2 株、Chaetomium 4
株、Calonectria 5 株、Xylaria 5 株，半知菌类的 Paecilomyces 7 株、Alternaria 2 株、Phomopsis 8 株、Colletotrichum 32 株，
接合菌门的 Rhizopus 5株、Mucor 7 株, 卵菌门的 Albugo 6 株， 有 10 株菌经 ITS 序列比对分别与 Botryosphaeria sp.、
Beltraniella sp.相似度较低，有待进一步鉴定研究确定其分类地位。 发现 Colletotrichum sp. 、Penicillium sp. 、Fusarium
sp.为优势真菌，生在于热带针叶林的植株根部分得的内生真菌最多，生物多样性最丰富。
关键词：红花隔距兰； 内生真菌； 分离； 鉴定
中图分类号：S682.31； Q949.32 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2014）22-0079-04
Endophytic fungi in root of wild Cleisostoma williiamsonii
WANG Qiong, TAN Zhi-qiong, ZHANG Rong-yi
(College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China)
Abstract: As an epiphytic orchid, Cleisostoma williiamsonii is a very beautiful ornamental plant, and plays an
important role in tropical forest ecosystems. In this paper, tissue culture method was used to isolate endophyte in root of
wild C. williiamsonii from Bawangling, Hainan. The total 145 isolates were identified into 15 genera, including Penicillium
16 strains, Aspergillus 12 strains, Pestalotiopsis 5 strains, Fusarium 19 strains, Neonectria 2 strains, Chaetomium 4 strains,
Calonectria 5 strains, Xylaria 5 strains, Paecilomyces 7 strains, Alternaria 2 strains, Phomopsis 8 strains, Colletotrichum 32
strains, Rhizopus 5 strains, Mucor 7 strains; Albugo 6 strains. Acorrding to the ITS sequences, another 10 strains needed
more identification, which had low degree of similarity with Botryosphaeria sp., Beltraniella sp.. It showed that
Colletotrichum sp., Penicillium sp., Fusarium sp. were the predominant species, and had the richest biodiversity in tropical
coniferous forests.
Key words: Cleisostoma williiamsonii; endophyte; isolation; identification
内生真菌是指一类在其部分或全部生活史中存活
于健康植物组织内部， 而不使宿主植物表现出明显感
染症状的一类真菌[1-3]。 其种类繁多，分布广泛，一般认
为与植物存在一种共生关系。 兰科（Orchidaceae）植物
就是有着这种共生关系的特殊类群， 内生真菌能提供
或增加兰花的有机或无机营养[3]，促进兰科植物种子萌
发；扩大兰科植物的根际范围，增强植株吸收养分的能
力；产生植物激素和维生素，促进植株生长 [4]；还可作为
真菌诱导子增强兰科植物的抗性。
红花隔距兰（Cleisostoma williiamsonii）是兰科隔距
兰属植物，植株通常悬垂，茎细圆柱形，花期 4~6 月，总
状花序或圆锥花序密生许多小花。 分布于不丹、印度东
北部、越南、泰国、马来西亚、印度 尼西亚，我国广东、海
南、广西、贵州、云南等地有分布 [5]。 红花隔距兰种质资
源稀少，被列为国家重点保护野生植物名录。 由于其叶
形独特，花朵色泽鲜艳，属于花叶兼具类的观赏植物，
有较高的观赏价值。 同时红花隔距兰全草可清热解毒，
治疗咽喉肿痛。 为了解红花隔距兰的内生真菌多样性，
为红花隔距兰的保护、 繁育工作提供理论依据和技术
指导，我们对其内生真菌类群进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试植株 海南霸王岭野生红花隔距兰， 采集
了 6 株植株的根部组织，分别编号为 A~F。
收稿日期：2014-03-12
基金项目：海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教
育部重点实验室开放基金 （2011hckled-05）；海南大学 “211 工
程”建设项目；海南大学环境与植物保护学院研究生创新平台
作者简介：王琼（1989-），女，在读硕士生， E-mail：melodyb
www@163.com
通讯作者：谭志琼（1969-），女，教授， E-mail：tanzhiqiong20
02@163.con
广东农业科学 2014年第 22期 79
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.22.004
表 1 不同消毒时间的分离结果
样品
A
B
C
D
E
F
合计
平均
株数
7
5
6
12
5
9
44
7.33
分离率（%）
50.00
35.71
42.85
85.71
35.71
62.30
312.28
52.05
种类
2
1
3
2
4
3
15
2.50
株数
15
8
9
17
8
5
62
10.33
分离率（%）
107.14
57.14
64.29
121.42
57.14
35.71
442.84
73.81
种类
2
3
5
6
4
5
25
4.17
株数
8
4
5
8
1
13
39
6.50
分离率（%）
57.14
28.57
35.71
57.14
7.14
92.86
278.56
46.43
种类
3
2
2
1
1
4
13
2.17
3min 5min 7min
1.1.2 培养基 培养基Ⅰ：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、
琼脂 20 g、氯霉素 300 mg、蒸馏水 1000 mL，用于真菌
分离；培养基Ⅱ：马铃薯 200 g、葡萄糖 15 g、琼脂 20 g、
蒸馏水 1 000 mL，用于菌种纯化与保存。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集 在海南霸王岭国家级自然保护区内
采集取样。 采集时挖开红花隔距兰根表面土壤，取其部
分营养根段。 为保持植物组织的新鲜度，将所采集的根
同周围的土样一起收集，用湿润的滤纸包裹，编号。 具
体采样点及样品编号如下：A、B： 热带低地雨林 （海拔
500~700 m）；C、D： 热带针叶林 （海拔 680~800 m）；E、
F：山地雨林（海拔 900~1 200m）。
1.2.3 内生真菌的分离 将采集的新鲜植物的根，用
自来水冲洗，室内晾干后进行常规组织表面消毒。 内生
真菌的分离采用平皿点种法并加以改进。 具体操作：取
新鲜营养根 75%酒精表面消毒 30 s，切成约 2 cm 长的
小段，0.1%升汞溶液消毒，消毒时间分别为 3、5、7 min，
后无菌水冲洗 4~5 次， 再将根切成厚约 2 cm 长的小
段，竖立于培养基Ⅰ平板，每个培养皿放 4段，置于26℃
恒温箱中黑暗培养。 待菌丝从根段内长出后，及时用接
种针小心挑取菌落边缘的尖端菌丝， 将其转移至培养
基Ⅱ平板，编号记录，再做进一步纯化。 获得纯菌株后，
转移至纯化培养基试管斜面保存备用[6-7]。
试验设 2 个对照， 进行外植体表面灭菌是否彻底
的检验。 将消毒后不做切割的材料分别压进 3 种供试
皿内培养基，20 min 取出，该皿正常培养，观察是否有
菌长出；将表面消毒最后一次无菌水涂抹于培养基，正
常培养， 观察是否有菌长出。 如任何 1 个对照有菌长
出，视为试验失败，重新进行分离[8]。
1.2.3 内生真菌的鉴定 挑取菌丝接种于 PDA 培养
基上 ，26℃恒温培养 ， 观察菌落形状 、 颜色和质地
(Pornpimon Athipunyakoml 等, 2004)。 另取一接种后的
平皿，待菌体长到一定程度，挑取菌丝，水玻片法，用光
学显微镜观察分生孢子梗的形态特征及孢子着生情况
等。 采用《真菌词典(第九版)》提出的分类系统，参考有
关文献，按照常规的真菌鉴定方法进行鉴定[9-10]。
将未产孢的菌株接种于各种诱导培养基上诱导产
孢， 包括用黑光灯和散射光交替照射、4 ℃和常温交替
培养、在培养过程中人为切断生长的菌丝等。 将仍未产
孢的真菌纯培养物转移至 4 ℃冰箱中，4~5 个月后再进
行观察[11]。
1.2.4 内生真茵的 rDNA-ITS 克隆与测序 挑取经活
化的菌丝，接种在 PDA 液体培养基摇床 110 r/min振荡
培养 5~7 d，收集菌丝体，用真菌提取试剂盒提取基因
组； 以内生真菌总 DNA 为模板， 以通用引物 ITS1 和
ITS4 进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系为 50 μL，其中 2×
PCR-Mixture 25 μL，ITS1 和 ITS4 各 1 μL， 总 DNA 2
μL，ddH2O μL；PCR 反应条件： 预变性：94℃ 5 min；变
性：94℃ 30s；退火：50℃ 30 s；延伸：72℃ 1 min，共 35
个循环；终止延伸：72℃ 10 min；4℃保存。
取 5 μL PCR扩增产物在 1％琼脂糖中进行凝胶电
泳检测， 将结果良好的样品送到上海生工生物工程技
术服务有限公司测序。 所得序列与 GenBank 上的序列
进行相似性比较并提交序列。
1.2.5 内生真菌生物多样性计算 采用多样性指数
（H）和优势度指数（D）描述内生真菌的群落多样性 [14]，
并利用 DPS进行数据分析。
H=-∑|ni/Nln(ni/N)|
D=1-∑(ni/N)2
式中，ni 为第 i 个物种的个体数，N 为群落中所有种的
个体数。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间的分离结果
3 种不同消毒时间下 ，2 个对照均无菌长出 ，表
示根部表面杂菌已完全杀死，分离结果见表 1。 从 6
个样品中共分离得到 145 株内生真菌， 平均每个样
品分离出 24.17 株菌， 其中以 5 min 分离效果最好，
占总数的 42.76%。 3 种时间下分离得到的菌种数存
在显著差异。
80
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表 3 不同生境分离出的真菌与生物多样性
真菌
Albugo laibachii
Xylaria sp.
Penicillium sp.
Pestalotiopsis sp.
Aspergillus sp.
Phomopsis asparagi
Beltraniella portoricensis
Fusarium sp.
Calonectria hongkongensis
Botryosphaeria sp.
Rhizopus sp.
Mucor sp.
Chaetomium sp.
Neonectria sp.
Paecilomyces sp.
Beltraniella sp.
Alternaria sp.
Colletotrichum sp.
菌株总数
总属数
多样性指数
优势度指数
A
1
2
5
0
4
2
0
3
1
2
1
1
0
0
2
0
0
6
30
11
2.30
0.087
B
1
0
3
2
1
1
1
2
0
0
0
1
0
1
0
1
0
3
17
11
2.28
0.059
C
1
2
0
0
1
2
1
4
1
0
0
2
2
0
0
1
1
2
20
12
2.37
0.058
D
2
0
3
2
4
1
1
4
1
2
4
2
0
0
2
0
0
9
37
13
2.35
0.093
E
1
1
2
1
1
0
0
2
0
0
0
1
1
0
1
0
0
3
14
10
1.81
0.200
F
0
0
3
0
1
2
0
4
2
0
0
0
1
1
2
1
1
9
27
12
2.08
0.137
低地雨林 热带针叶林 山地雨林
菌株数
表 2 红花隔距兰内生真菌形态学与 ITS 序列鉴定
分离物
A101 B102 C103
A102
A103
B102
B103
C101 F103
C102
C104
D101
D102 F104
D103
D104
D105
F101
F102
E102
E106
F105
F106
F107
形态鉴定结果
Albugo sp.
未定属
Penicillium sp.
Pestalotiopsis sp.
Aspergillus sp.
Phomopsis sp.
未定属
Fusarium sp.
Fusarium sp.
Calonectria sp.
未定属
Rhizopus sp.
Mucor sp.
Chaetomium sp.
Fusarium oxysporum
Neonectria sp.
Paecilomyces sp.
未定属
Alternaria sp.
Colletotrichum sp.
数量
6
5
16
5
12
8
3
5
6
5
4
5
7
4
8
2
7
3
2
32
ITS 比对结果
Albugo laibachii
Xylaria sp.
Penicillium sp.
Pestalotiopsis sp.
Aspergillus sp.
Phomopsis asparagi
Beltraniella portoricensis
Fusarium nematophilum
Fusarium solani
Calonectria hongkongensis
Botryosphaeria sp. WF137
Rhizopus sp.
Mucor sp.
Chaetomium sp.
Fusarium oxysporum
Neonectria sp.
Paecilomyces sp.
Beltraniella sp.
Alternaria sp.
Colletotrichum sp.
相似度（%）
99
99
99
99
99
99
94
99
98
99
80
99
99
99
100
99
99
93
99
99
2.2 菌株鉴定结果与序列号
通过菌落特征、子实体形态、孢子形态等常规鉴定
方法，初步判断菌种分类地位，再结合 ITS 序列鉴定结
果，比对后加以确定，结果见表 2。
从采自海南霸王岭的野生红花隔距兰根的 84 个
根组织段中共分离得到 145 株内生真菌， 按形态学归
为 17 个分类单元，包括 9 种有性型和无性型子囊菌、5
种半知菌、2 种接合菌、1 种卵菌。 分离出的内生真菌
中，Colletotrichum、Penicillium、Fusarium 为优势真菌，分
别占总菌株数的 22.07%、11.03%、13.10%。
将测序得到的序列在 GenBank 上比对， 并通过
clustalx1.8 多重比对并由 mega6.0 建立系统发育树，鉴
定真菌的分类地位。 其中有 3个种属的菌株经比对，与
Beltraniella portoricensis、Botryosphaeria sp.、Beltraniella
sp.相似度为 94%、80%、93%，相似度较低，有待进一步
鉴定研究确定其分类地位。 在 NCBI 上注册，获得序列
号为 KJ512143~KJ512165。
2.3 内生真菌多样性
从生长于 3 种不同生境的红花隔距兰中分离真
菌， 每个样品中均分离得到 Aspergillus sp.、Fusarium
sp.、Colletotrichum sp.， 说明内生真菌在同种植物内的
分布存在普遍性；也有比较少见的真菌，如 Neonectria、
Calonectria sp.、Chaetomium sp.、Beltraniella sp.、
Botryosphaeria sp.。 但同时每个生境分离出的菌株数存
在较大差异，分别为 47、57、41 株，分离得到的真菌种
类也各不相同，热带针叶林分离的菌株最多，同时 C、D
81
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样品的多样性指数最高，为 2.37 和 2.35，与其他生境存
在显著差异。 其次是热带低地雨林，山地雨林的生物多
样性最低。
3 结论与讨论
通过对野生红花隔距兰根部内生真菌的分离，共
分离得到内生真菌 145 株，按形态学归为 17 个分类单
元，包括 9 种有性型和无性型子囊菌，5 种半知菌、2 种
接合菌 、1 种卵菌 。 子囊菌门的 Penicillium 16 株 、
Aspergillus 12 株 、Pestalotiopsis 5 株 、Fusarium 19 株 、
Neonectria 2 株 、Chaetomium 4 株 、Calonectria 5 株 、
Xylaria 5 株； 半知菌类的 Paecilomyces 7 株、Alternaria
2 株、Phomopsis 8 株、Colletotrichum 32 株；接合菌门的
Rhizopus 5株、Mucor 7株；卵菌门的 Albugo 6株。 分离
出的内生真菌中 ，Colletotrichum sp.、Penicillium sp.、
Fusarium sp.为优势真菌，分别占总菌株数的 22.07% 、
11.03%、13.10%。 其中有 3 个种属的菌株经比对，与
Beltraniella portoricensis、Botryosphaeria sp.、Beltraniella
sp.相似度为 94%、80%、93%，相似度较低，有待进一步
鉴定研究确定其分类地位。 将所有测序菌株得到的序
列 在 NCBI 上 注 册 ， 获 得 序 列 号 为 KJ512143 ~
KJ512165。
试验中对根组织样品采用 3、5、7 min 3 种消毒时
间，均能彻底杀死组织表面杂菌，以 5 min 分离效果最
好， 占总数的 42.76 。 红花隔距兰根样品采自低地雨
林、热带针叶林、山地雨林 3 种生境，分别分离出 47、
57、41株真菌，鉴定归类有 15、16、14 个不同的属，说明
不同生境下同种植物内生真菌的丰富程度有差别。 热
带针叶林分得的真菌多样性指数最高，平均达到 2.36，
低地雨林和山地雨林次之， 说明热带雨林中根组织内
生真菌复杂程度最高；而山地雨林中优势度最高，平均
达到 0.168，热带针叶林和山地雨林次之，说明山地雨
林中根组织内生真菌数量分布最不均匀， 优势种即
Colletotrichum sp.的地位最突出。
本试验首次对国家重点保护野生植物红花隔距兰
根部内生真菌进行了分离和鉴定， 分得的内生真菌较
为丰富。 发现不同生境下内生真菌种群差别很大，绝大
多数为子囊菌，多样性存在显著差异，说明地理环境的
不同可能影响同种兰科内生真菌的侵染几率。
本试验采用传统组织培养法分离内生真菌， 由于
人工培养条件的限制以及菌的自身特性等问题， 有很
多真菌不能被培养出来[10-11]。 传统分离方法获得的微生
物只占环境微生物的 0.1~10[12]。 近年来，分子生物学方
法逐渐广泛应用于内生菌的分离鉴定。 如能快速高效
地提取植物内生菌特异性 DNA 片段，直接用于分析处
理，基于 PCR技术和生物信息技术结合，获得内生菌多
样性及群落结构信息[13-14]。
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（责任编辑 杨贤智）
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