全 文 ：辣木内生真菌产生抗菌物质的生物学特性研究
柯　野 , 　黄志福 , 　曾松荣 , 　郑秋桦
(韶关学院 生物工程系 ,广东 韶关 512005)
摘　要:从辣木 (Moringa sp. )中分离得到一株内生真菌(Asperg illus sp. ),其发酵液对金黄色葡
萄球菌和绿脓杆菌的生长有很强的抑制作用 。曲霉 ly14发酵液抑菌效果的最适碳源是麦芽
糖 ,最适氮源是玉米浆 ,最适初始 pH为 5,最适装液量为 50mL和最适培养时间 160 h,但生长
因子 (叶酸和 VB12除外)和无机盐离子并不促进发酵夜得抑菌效果。
关键词:内生真菌;抗菌活性物质;生物学特性
中图分类号:S718. 81　　文献标识码:A　　文章编号:1001-7461(2007)01-0031-03
B iolog ica lCharacteristics of Endophy tic Fungi fromMoringa sp.
on Producing A ntibioticA ctive Substance
KE Ye, 　HUANG Zhi-fu, 　ZENG Song-rong, 　ZHENG Q iu-hua
(D epartm ent o fB iotechnology, Shaoguan Un iversity , Shaoguan, Guangdong 512005, China)
Abstract:An Asperg illus sp. strain of endophy tic fung iw as iso la ted fromMoringa sp. . The fermented broth of the
strain strongly inhibited the g row th o fS taphy lococcus au reus and Pseudomonas ae rug inosa. Itw as proved in our test
that the optimum C - souce, N - source, in itia l pH , med ium capacity and cultu re period w erem alto se, corn steep
liquor, 5. 0, 50mL and 160h for inh ib iting effect o f the fermented b ro th, but the g row th factors (excep t FH4 and
VB12) and ino rganic ions couldnt promote the antibio tic ac tiv ity of the fermented bro th.
key word:endophy tic fungus;antibiotic ac tive substance;biolog ical charac te ristics
　　辣木 (Moringa sp. )是多年生的多用途速生乔
木植物 ,原产于热带 、南亚热带的干旱或半干旱地
区;在我国的部分地区引种获得了成功 [ 1] 。辣木叶
片 、果荚营养全面而丰富且富含多种矿物质 、维生
素 ,作为蔬菜和食品有增进营养和食疗保健功能;种
子含有活性凝结成分 ,有净化水的特殊功能 ,因此辣
木又被誉为 “神奇之树 ”和 “母亲最好的朋友 ”。有
退热 、消炎 、排石 、利尿 、降压 、止痛 、强心和催欲等多
方面的医疗保健功能 [ 2] 。
植物内生菌 (endophy tic fungi)是指一类在其部
分或全部生活史中存活于健康植物组织内部 ,而不
使宿主植物表现出明显感染症状的微生物[ 3] 。研
究发现植物内生真菌能够产生多种生物活性物质
(如抗癌物质 、抗菌类物质 、分解酶与酶抑制剂与植
物生长调节物质等)[ 4] 。植物内生真菌是一类潜在
的产生生物活性物质的巨大资源。我国对辣木的研
究主要集中于生长繁殖方面 ,而对其内生菌方面的
研究未见报道 。本文对辣木中分离出的内生真菌产
生抗菌活性物质的菌株进行了分离鉴定 ,并对其产
生抗菌物质的生物学特性进行了研究 ,为培养条件
的优化 ,提供理论依据;也为其他植物内生真菌的生
物学特性研究提供参考 。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植株来源　新鲜植株辣木采自广东省粤北
山区 。
1. 1. 2　受试菌株　革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌
(S taphy lococcus aureus);革兰氏阴性菌:绿脓杆菌
(P seudomonas aeruginosa)
1. 1. 3　培养基　内生真菌的分离培养基:马铃薯葡
萄糖琼脂培养基;发酵基础培养基:豆芽汁葡萄糖
培养基 ,查氏液体培养基;受试菌培养基:牛肉膏蛋
白胨培养基[ 5] 。
西北林学院学报　2007, 22(1):31 ～ 33
Journal o fNo rthwe st Fo restry Un ive rsity
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期:2006-02-28　　修回日期:2006-03-09
基金项目:首届香港铭源基金研究资助项目(20050202)
作者简介:柯野(1977-),男,四川泸州人 ,理学硕士 ,讲师 ,主要从事微生物学教学和科研工作。
*　通讯作者:曾松荣。
1. 2　方法
1. 2. 1　内生真菌的分离和纯化　按照参考文献
[ 6]进行 。
1. 2. 2　内生真菌的鉴定　按常规鉴定方法进行
(参见文献 [ 7, 8] )
1. 2. 3　不同碳源的发酵液对抑菌效果影响的试验
　将豆芽汁葡萄糖培养基中的葡萄糖分别换成 5%
的其他碳源 ,配制成不同的培养液;接种内生真菌 ,
25℃, 130 r m in-1摇床培养 7 d,收集发酵液备用。
将 37℃培养 24 h的受试菌株 ,以平板活菌计数
法定量其菌液浓度为 106 CFU mL -1 ,在直径 9 cm
灭菌培养皿中加入 18 ～ 20 mL已融化冷却至 50℃
的牛肉膏蛋白胨培养基 ,立即旋转混匀。待琼脂凝
固后 ,在培养皿底部画线 ,将平板分为均匀的三个区
域;并取 106 CFU mL - 1的菌悬液均匀的涂布在培
养基上 ,静置 15 m in,往每个区域里轻放一个已灭菌
的牛津杯 ,取发酵液 200 μL分别加到牛津杯中 ,
37℃培养 24 h,观察抑菌效果 ,并用游标卡尺测量抑
菌圈直径。重复三次 [ 9] 。
1. 2. 4　不同氮源的发酵液对抑菌效果影响的试验
　将查氏培养液的 NaNO3分别换成 0. 2%的其他氮
源 ,配制成不同的培养液;按 1. 2. 3的方法测定发酵
液的抑菌圈直径 。
1. 2. 5　不同 C /N的发酵液对抑菌效果影响的试验
　以查氏培养液为基础培养基 , (NH4 )2 SO4 代替
N aNO 3作氮源 ,变化其在培养基中的含量来构成不
同的 C /N比 ,按 1. 2. 3的方法测定不同发酵液的抑
菌圈直径。
1. 2. 6　不同培养液量的发酵液对抑菌效果影响的
试验　将查氏培养液 ,分装在 500 mL的三角瓶 ,每
瓶分别装不同量的培养基 ,按 1. 2. 3的方法测定不
同发酵液的抑菌圈直径。
1. 2. 7　不同无机盐离子的发酵液对抑菌效果影响
的试验　以 (NH 4)2 SO4作氮源制备查氏培养液体
(去除 Mg2+、Fe2+,其它无机离子浓度减半 ),分别
加入不同离子为受试离子 ,浓度为 10 ～ 4 moL
L
- 1 ,以不加无机离子为对照 ,按 1. 2. 3的方法测定
不同发酵液的抑菌圈直径 。
1. 2. 8　不同生长因子的发酵液对抑菌效果影响的
试验　以(NH4)2 SO 4作氮源制备查氏培养液 (各无
机离子浓度减半 ),分别加入不同的生长因子 ,浓度
为 2mg /100 mL,以不加生长因子为对照 ,按 1. 2. 3
的方法测定不同发酵液的抑菌圈直径。
1. 2. 9　不同初始 pH值的发酵液对抑菌影响的试
验　以玉米浆为氮源制备查氏培养液 ,将培养液调
至为不同的初始 pH , 以未调 pH 值的为对照 , 按
1. 2. 3的方法测定不同发酵液的抑菌圈直径。
1. 2. 10　不同时间段的发酵液对抑菌影响的试验　
按麦芽糖 5%,玉米浆 0. 2%,起始 pH 5. 0的方法配
制培养液 ,分装在 500 mL的三角瓶 ,装 50 mL培养
液 ,按 1. 2. 3的方法测定不同时间段的发酵液的抑
菌圈直径 。并将相应时间段的菌丝体过滤 ,烘干至
恒重 ,称量 。
2　结果与分析
2. 1　菌株的分离鉴定结果
分离得到一株具有抗菌活性的内生真菌曲霉
(Asperg illus sp. )。
2. 2　不同碳源对抑菌效果的影响
表 1表明 ,不同碳源对抑菌圈的影响较大 ,以麦
芽糖的抑菌圈最大 ,表明产生的抗菌物质最多。
表 1　不同碳源的发酵液对细菌生长的抑制效果
Table 1　The inh ib iting effect of ferm en ted b roth of
d ifferen t carbon sou rces on th e grow th of bacteria
碳源 蔗 糖 葡萄糖 淀粉 麦芽糖 乳糖
金黄色葡
萄球菌 /mm 23. 67 21. 73 22. 33 25. 83 24. 25
绿脓杆菌 /mm 23. 68 19. 53 20. 53 24. 77 22. 64
　　注:抑菌圈直径为 3次重复平均值 ,以下表同。
2. 3　不同氮源对抑菌效果的影响
表 2表明 ,氮源对抗菌物质的产生影响较大 ,尿
素的抑菌圈最小 ,玉米浆的抑菌圈最大 。
表 2　不同氮源的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 2　The inh ib iting effect of ferm en ted b roth of d ifferent
n itrogen sou rces on th e grow th of bacteria
氮源 尿素 NaNO 3 (NH 4)2 SO 4蛋白胨 玉米浆 酵母粉 黄豆粉
金黄色
葡萄球
菌 /mm
12. 03 19. 49 21. 00 20. 59 22. 25 21. 67 21. 13
绿脓杆
菌 /mm 12. 00 18. 85 19. 27 19. 98 23. 87 21. 26 21. 64
2. 4　C /N比对抑菌效果的影响
表 3表明 ,较低或较高的 C /N比均不利于抗菌
物质的产生;当 C /N比为 30∶1时 ,抗菌物质产生
量最大。
表 3　不同 C /N比的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 3　The inh ib iting effect of ferm ented broth of differen tC /N. on the grow th of b acteria
C /N比 2∶1 10∶1 20∶ 1 30∶ 1 40∶1 50∶1 60∶1 70∶ 1 80∶ 1 100∶1
金黄色葡萄球菌 /mm 无 无 14. 56 20. 64 17. 35 16. 25 16. 15 11. 73 11. 24 无
绿脓杆菌 /mm 无 无 14. 40 19. 82 16. 25 15. 50 14. 21 13. 79 11. 89 无
32　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　西北林学院学报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
2. 5　装培养液量对抑菌效果的影响
表 4表明 ,不同的装液量对抑菌效果影响显著 ,
装培养基量越少 ,抑菌效果越好 。装培养基量为 50
mL时 ,产生的抗菌物质最多。
表 4　不同培养基装液量的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 4　The inh ib iting effect of ferm en ted broth of differen t
medium capacity on the grow th of b acteria
装培养基量 /m L 50 100 150 200 250
金黄色葡萄球菌 /mm 24. 74 21. 09 20. 18 11. 80 11. 0
绿脓杆菌 /mm 23. 47 19. 47 18. 09 13. 20 12. 70
2. 6　无机盐离子对抑菌效果的影响
表 5表明 ,无机盐离子和对照的抑菌圈没有显
著的变化 ,这表明无机盐离子并不促进抗菌物质的
产生。
表 5　不同的无机离子的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 4　The inh ib iting effect of ferm en ted broth of differen t
inorgan ic ions on th e grow th of bacteria
金属离子 ck M g2+ Fe2+ Zn2+ Mn2+ C a2+
金黄色葡萄球菌 /mm 20. 05 20. 75 19. 75 20. 40 20. 53 20. 45
绿脓杆菌 /mm 19. 78 19. 50 20. 00 19. 45 19. 89 19. 780
2. 7　不同生长因子对抑菌效果的影响
表 6表明 ,叶酸和 VB12的抑菌圈显著的大于对
照 ,而其他没有显著的变化 ,这表明叶酸和 VB12能
促进抗菌物质的产生 。
表 6　不同生长因子的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 7　The inh ib iting effect of ferm en ted broth of differen t
grow th factors on the g row th of bacteria
生长因子 ck 叶酸 VB1 VB6 VB12 VC
金黄色葡萄球菌 /mm 21. 35 23. 50 21. 24 20. 69 24. 88 21. 33
绿脓杆菌 /mm 20. 00 21. 50 19. 98 20. 12 21. 68 20. 13
2. 8　不同 pH对抑菌效果的影响
表 7表明 ,初始 pH对抗菌物质的产生影响显
著 ,在初始 pH5时 ,抑菌效果最好(图 1)。
表 7　不同初始 pH的发酵液对细菌生长的抑制效果
Tab le 7　Th e inh ib iting effect of fermented broth of
differen t in itial pH on the grow th of b acteria
pH值 对照 pH 5 pH 6 pH 7 pH8 pH9
金黄色葡萄球菌 /mm 24. 30 27. 17 24. 12 25. 42 22. 25 23. 11
绿脓杆菌 /mm 23. 15 23. 65 22. 79 23. 05 19. 55 22. 48
2. 9　发酵时间对产生抗菌物质的影响
表 8表明 ,培养 40 h时没有抑制效果 ,但从 40
～ 169 h抑菌效果就逐渐的增强 , 160 h发酵液对两
种菌的抑制效果最强 ,随着时间的推移抑菌效果逐
渐的减弱。
表 9表明 ,培养至 136 h过程中菌体生物量逐
渐增强 , 136 h菌体生物量最大 ,随着时间的推移 ,
菌丝体出现了自溶现象 ,菌体生物量逐渐的减少。
图 1　不同初始 pH的发酵液对细菌生长的抑制作用
Fig. 1　The inh ib iting effect of ferm en ted b roth of
di fferen t in itial pH on th e grow th
表 8　不同发酵时间段的发酵液对细
菌生长的抑制效果
Table 8　The inh ib iting effect of ferm en ted b roth of
d ifferen t cu ltu re period on the grow th of bacteria
时间 /h 40 64 88 112 136 160 184 208 232 256
金黄色葡
萄球菌 /mm无 20. 1923. 6725. 5728. 6730. 9829. 9128. 9626. 7723. 55
绿脓杆
菌 /mm 无 17. 9123. 2124. 6526. 9430. 0927. 0126. 6426. 3124. 67
表 9　不同发酵时间段的曲霉生物量
Tab le 9　The effect of differen t cu ltu re period on the
b iom ass ofA sperg il lus sp.
时间 /h 40 64 88 112 136 160 184 208 232 256
菌丝体
干重 /g 0. 28 0. 34 0. 43 0. 47 0. 51 0. 48 0. 45 0. 44 0. 40 0. 35
3　结论与讨论
从辣木中分离出这样一株抗 G +和 G -的内生
真菌 ,说明该菌具有一定的潜在价值 ,有可能成为抗
菌新药的研究开发利用提供一条途径 ,也为辣木的
进一步利用提供参考。
通过该内生曲霉发酵液的抑菌试验发现 ,该曲
霉产生抗菌物质受环境因素的影响较显著 ,特别是
碳源 、氮源 、初始 pH、装液量和培养时间等方面 ,但
是无机盐离子的影响较小。麦芽糖和玉米浆是较好
的碳源和氮源 、初始 pH为 5、装液量 50 mL和培养
时间 160 h时 ,发酵液的抑菌效果最好 ,则产生的抗
菌物质最多。有待于进一步研究培养条件之间的互
作 ,进一步探讨最佳的培养条件。
136 h时曲霉的生物量最大 ,抑菌效果最佳的
是 160 h,这说明抗菌物质是一种次生代谢产物 ,但
(下转第 42页)
33第 1期　　　　　　　　　　　　柯 野 等　辣木内生真菌产生抗菌物质的生物学特性研究　　　　　　　　　　　　
散 , 5种以下的小属和极小属共 562个 ,占属总数的
91. 23%。说明本区系植物种类组成较为分散 ,属 、
种的多样性较高 。
仙居县种子植物区系地理成分复杂 ,过渡性明
显 ,分布区类型多样。属的分布区类型可划分为 14
类 ,它包括了我国种子植物除中亚分布外的所有分
布区类型。其中以温带性成分为主 , 占 53. 08%;热
带性成分的比例也较高 , 占 44. 57%,但典型的热带
成分较少 ,多为热向亚热带延伸的成分。这表明仙
居地处亚热带 ,为热带向温带过渡地区 ,植物区系明
显地具有热带 、亚热带与暖温带的双重性质 ,以亚热
带性质为主 。
仙居长期受相对稳定的亚热带气候的影响 ,境
内地形比较复杂 ,未受第四纪冰川的严重影响 ,因而
保留了较多的单型属 、少型属和古老孑遗植物 ,说明
本区系历史悠久 ,起源古老 。本区系中有我国特有
属 13属 ,列为国家首批保护的珍稀濒危植物 14种。
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(上接第 33页 )
对其具体的结构和抗菌机理还需进一步的研究;建
议进一步研究抗菌物质是否相同或相似于辣木的成
分 ,还是一种新的抗菌物质 ,并评价其应用前景 。
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42　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　西北林学院学报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷