全 文 ：黑穗醋栗花中 RNA提取方法的比较研究
收稿日期：2010-01-04
基金项目：公益性行业科研专项基金项目（nyhyzx07-028，2006-G25）
作者简介：赵慧（1983-），女，硕士研究生，研究方向为果树分子生物学。
*通讯作者：于泽源，教授，博士生导师，研究方向为果树生理与分子生物学。E-mail: yzy@neau. edu. cn
赵 慧，李兴国，于泽源*
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：以黑穗醋栗花为试验材料，利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较了 Trizol 法、硼砂-SDS 法、
CTAB法、植物 RNA提取试剂盒等 4种方法提取总 RNA 的质量和纯度。结果表明，利用硼砂-SDS 法提取的
RNA，28S和 18S两条带型清楚，两条带之间无弥散现象，且纯度最高，D260/D280达到 2.06，经计算得出总 RNA
产率达 61.60 μg·g-1，反转录条件下可得 500～1 000 bp之间的弥散 cDNA条带，进一步证明硼砂-SDS法提取得到
的总 RNA具有很高的纯度，可以满足进一步分子生物学研究的需要。
关键词：黑穗醋栗；花；总 RNA；RNA提取
中图分类号：S663.9；Q522 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2010）09－0072－04
Analysis and improvement of high-quality RNA extraction in flower of
blackcurrant/ZHAO Hui, LI Xingguo, YU Zeyuan (College of Horticulture, Northeast Agricultural
University, Harbin 150030, China)
Abstract: CTAB method, Borax-SDS method, Trizol method, Plant RNA out Kit method were
employed to extract total RNA in flower of the ripe blackcurrant. Through UV spectrometer and gel
electrophoresis indicated such as the total RNA extracted from four kinds of quality and purity. The results
showed that the use of Borax-SDS extraction ofRNA, 28S and 18S two banding patterns clearly between the
two with no dispers ion phenomenon, and the highest purity, D260/D280 to 2.06, calculated that the total RNA
yield of 61.60 μg·g-1, reversed the transcriptase underthe conditions of the available 500-1 000 bp dispers ion
among the cDNA bands, the further evidence of Borax-SDS method of total RNA were extracted with high
purity, to meet the need forfurthermolecularbiology research.
Key words: blackcurrant; flower; total RNA;RNA extraction
从植物中提取较高质量的总 RNA是顺利进行
基因表达模式，克隆基因等各种分子生物学研究
的基础。常用的 RNA提取方法有异硫氰酸胍法[1]、
盐酸胍法[2]、苯酚法[3]、SDS法[4]、CTAB法[5]、LiCi
尿素法[6]、热硼酸法[7]、改良 Bugos法[8-9]等。植物组
织中的多酚、多糖和蛋白质以及其他代谢物质均
能影响 RNA 的提取 [10]。由于不同植物不同组织，
甚至同一植物不同发育期，植物所含化学成分不
同，影响植物 RNA提取的因素亦不同，因此应该
针对植物材料的具体特点选择适宜的总 RNA提取
方法。黑穗醋栗是虎耳草科茶 子属小灌木，从当
前的研究来看，关于黑穗醋栗分子生物学领域的研
究报道较少，本研究的宗旨是筛选出适合黑穗醋栗
花中总 RNA的提取方法，为黑穗醋栗分子生物学
领域的研究提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
在黑穗醋栗（布劳得）盛花期，采摘完整的花
第 41卷 第 9期 东 北 农 业 大 学 学 报 41(9): 72~75
2010年 9月 Journal of Northeast Agricultural University Sep. 2010


朵，迅速投入液氮中冷冻备用。
1.1.2 试剂
CTAB、DEPC、SDS、氯化锂、β-巯基乙醇、
醋酸钠、EDTA、Tris苯酚等购自上海生物工程公
司；琼脂糖为西班牙原装；DNaseⅠ、RNase抑制
剂、反转录试剂盒等购于 PROMEGA 公司；其他
的化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 试验耗材及仪器
所用试剂瓶和塑料耗材均预先用 0.1% DEPC
水处理 24 h 以上，50～60 ℃烘干，并高压灭菌
20 min。研钵 150 ℃烘干 4 h后低温冷冻，所需试
剂均用 0.1% DEPC水配制，并湿热灭菌 20 min避
免 RNase污染。仪器为琼脂糖水平电泳槽，琼脂
糖电泳仪，高速低温冷冻离心机，电子天平，超
低温冰箱，电热恒温水浴锅，漩涡振荡器，超净
工作台等。
1.2 方法
1.2.1 CTAB法
参照温鹏飞葡萄果皮中 RNA的提取[5]。
1.2.2 植物 RNA提取
RNA提取试剂盒（天泽公司植物 RNA out编号
3080-10的试剂盒，略有改动）。
取 0.2 g样品液氮研磨成粉后迅速放入预冷离
心管中后加入 1 mL A溶液匀浆，加入 0.3 mL溶液
B和 0.2 mL氯仿。充分振荡混匀。12 000 r·min-1
离心 3 min后移入新的离心管中，加入 0.5 mL溶
液 C和 0.2 mL氯仿充分振荡混匀。12 000 r·min-1
离心 3 min后移入新的离心管中，加入 1/2体积的
溶液 D，振荡混匀后离心 20 min，弃上清 75%乙
醇洗涤 2次，沉淀用 40 μL DEPC水溶解待用。
1.2.3 硼砂-SDS法
参照许平等总 RNA的提取[11]，略有改动。1.5
mL 离心管中加入 0.6 mL SDS 提取液，0.06 mL
β-巯基乙醇，0.4 mL Tris苯酚和 0.3 mL氯仿，取
样品 0.2 g液氮研磨后迅速加入离心管中，用漩涡
振荡器振荡约 3 min， 10 000 r·min -1 离心
5 min，取上清，加入 0.3 mL Tris苯酚和 0.3 mL氯
仿，用漩涡振荡器剧烈振荡 2 min，10 000 r·min-1
离心 5 min，取上清。等体积氯仿重复抽提一次取
上清，加入等体积 10 mol·L-1氯化锂和 1/2 体积
的无水乙醇，冰浴 10 min，1 000 r·min-1离心 10
min，沉淀 RNA。沉淀加 300 μL DEPC水，30 μL
3 mol·L-1 醋酸钠和 900 μL 无水乙醇，冰浴 10
min，12 000 r·min-1离心 10 min，弃上清，75%乙
醇洗涤 2次，沉淀用 40 μL DEPC水溶解待用。
1.2.4 Trizol法
取 0.2 g样品液氮速冻研磨后，迅速加入 1 mL
Trizol 试剂，充分摇匀，室温放置 5 min，加入
0.2 mL氯仿：异戊醇（24： 1）剧烈震荡 15 s，室温放置
2 min。4 ℃ 12 000 r·min-1离心 15 min，取上清，
弃沉淀，上清转入新离心管中。加入 0.5 mL异丙
醇，混匀，室温放置 10 min。4 ℃ 12 000 r·min-1离
心 10 min，弃上清，沉淀用 75%乙醇洗涤 2 次，
40 μL DEPC水溶解待用。
1.2.5 合成
按照 PROMEGA反转录试剂盒的说明对硼砂-
SDS法提取的总 RNA进行反转录，方法如下：在
tube -1 中加入总 RNA， 8.0 μL 和 oligo dT（20
μmol·L-1）2.0 μL，70 ℃水浴 5 min后直放到 42 ℃
水浴 1～2 min。在 200 μL tube-2中加入下列成分：
5.0 μL，M-MLV（5×Buffer）；1.25 μL，10 mol·L-1 d
NTP mix；1.0 μL， rRNAsin（40 U）；1.0 μL，M-
MLVRT（200 U）；4.75 μL，DEPC和 tube-1体系相
加为 25 μL。42℃水浴 1～2 min。保持 42℃，两管混
合 42 ℃，60 min；70 ℃，15 min。最后-20 ℃保存。
2 结果与分析
2.1 凝胶电泳分析
2.1.1 不同提取方法的黑穗醋栗花朵 RNA样品的
凝胶电泳分析
取 3 μL RNA样品与 2 μL 6×Loading buffer混
合后进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压为 120 V，
电流 100 mA，功率 256 W 的条件下电泳 15 min，
在紫外凝胶成像系统上观察 RNA条带的清晰度和
完整性并拍照。可见利用 CTAB提取的总 RNA可
以看出 18S和 28S条带，但是降解严重（见图1-A）。
Plant out RNA 试剂盒琼脂糖凝胶电泳检测后呈现
两条清晰的条带，分别为 28S 和 18S RNA，二者
亮度比约为 2： 1，条带无明显降解（见图 1-B）。利
用硼砂-SDS法提取的 RNA，28S和 18S两条带型
清楚，而且 28S rRNA 无论在质量和亮度上均是
18S rRNA的两倍。两条带之间无弥散现象，排除
RNase 污染，未发生明显降解现象（见图 1-C）。
Trizol法提取黑穗醋栗花的总 RNA无任何条带，表
赵 慧等：黑穗醋栗花中 RNA提取方法的比较研究第 9期 ·73·
明该方法不适用于黑穗醋栗花总 RNA 提取（见图
1-D）。
2.1.2 cDNA检测
进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压为 120 V，
电流 100 mA，功率 256 W 的条件下电泳 30 min，
在紫外凝胶成像系统上观察 cDNA 条带并拍照。
反转录可得 500～1 000 bp 之间的弥散 cDNA 条
带。
A-CTAB法；B-Plant out RNA试剂盒法；C-硼砂-SDS 法；D－Trizol法；M-DL2000 Marker；1-试验样品
A-CTAB; B-Plant RNA out Kit; C-Borax-SDS; D-Trizol; M-DL2000 Marker; 1-Experimental sample
图 2 反转录
Fig. 2 cDNA
2.2 RNA样品的质量检测分析
紫外分光光度计定量测定和纯度分析见表 1。取 2
μLRNA样品稀释 50倍，在紫外分光光度计测定 230、
260和 280 nm波长下 OD值，计算出 OD260/OD280和
OD260/OD230的值以确定提取的黑穗醋栗RNA的纯度。
通过如下公式计算产率：
RNA样品的产率（μg·g-1）=OD260×N（样品稀释
倍数）×40（μg·mL-1）×V（mL）/样品重（g）。
排除 Trizol 法未提取出黑穗醋栗花朵中的
RNA，分别对其他 3种方法所得的 RNA的 OD值
进行比较，CTAB 法所得的 RNA 的纯度较低，
D260/D280为 1.62，植物 RNA 提取试剂盒法提取的
RNA纯度较高，OD260/OD280为 1.9，硼砂-SDS法提
取的纯度最高，OD260/OD280 达到 2.06，这说明用
此方法提取的总 RNA纯度高，经计算得出总RNA
图 1 黑穗醋栗花朵总 RNA电泳
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of blackcurrant flower total RNA isolated with different methods
M-DL2000 Marker；1～2-反转录结果 cDNA
M-DL2000 Marker; 1-2-Experimental result cDNA
M 1
A
M 1
B
M 1
C
M 1
D
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
提取方法
Isolated method
植物 RNA提取试剂盒
Plant RNA out Kit
OD值（UV absorbance）
230 nm
0.036
Trizol法
Trizol method -
260 nm
0.074
-
RNA得率
（μg·g-1）
Yield
0
59.20
280 nm
-
0.039
CTAB法
CTAB method 0.022 0.047 37.600.029
硼砂-SDS
Borax-SDS method 0.035 0.077 0.037 61.60
注：“-”表示无。
Note: - means no.
表 1 不同提取方法得到黑穗醋栗花朵中
总 RNA的 OD值和得率
Table 1 OD value and yield of the blackcurrant total
flower RNA isolated with different methods
2000 bp
1000 bp
2000 bp
1000 bp2000 bp
1000 bp
2000 bp
1000 bp
·74· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 41卷
产率达 61.60 μg·g-1，说明硼砂-SDS 法提取的黑
穗醋栗花朵中的总 RNA 可用于分子克隆试验
研究。
综合纯度，完整性和产量等因素，认为硼砂-
SDS法最适合黑穗醋栗花朵中总 RNA的提取。其
余方法提取出的总 RNA OD260/OD280 和 OD260/OD230
的值都小于 2.0，说明存在蛋白质、酚类、多糖的
污染，总 RNA得率不足 60 μg·g-1。
3 讨 论
RNA提取的影响因素有很多，不同植物或者
同一植物不同器官的组分和含量就有很大的差异。
酚类化合物、多糖、蛋白质和未知次级代谢产物是
影响植物组织 RNA 提取的几个主要干扰因素 [12]。
近年来有关木本植物 RNA提取的方法有很多的文
献报道[10, 13-15]，但是在植物材料匀浆时，这些富含
酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，
并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化
效应（Browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌
类）能与 RNA稳定地结合，从而影响 RNA的分离
纯化。黑穗醋栗花朵和其他的木本植物相似，体内
含有较多的次级代谢物质，严重影响 RNA的提取，
因此去除酚类化合物是该样品 RNA提取的一关键
因素。
常用的 RNA提取方法 CTAB法很适合于糖类
含量高[5]，富含酚类化合物多的样品[16]，但试验发
现 CTAB 法提取的时间较长，虽然可以提取出
RNA，但该方法操作复杂繁琐，需 2 d才能完成而
且降解严重。Trizol提取过程简单方便，适用于提
取很多种植物叶片的 RNA，但是却不适合去除次
生代谢物含量高的样品，在黑穗醋栗的花朵中没有
明显的效果，不适合该种样品的 RNA 提取。而
Plant out RNA试剂盒用时较短，但纯度较 SDS法
低，且价格相对昂贵。
4 结 论
硼砂-SDS法，结合了各种方法的优点，用硼
砂取代 Tris-HCL，克服了 Tris 对 DEPC 的敏感，
无法用 DEPC处理的缺憾。其次利用高盐 LiCl 可
以选择沉淀总 RNA使部分多糖留在溶液中而不随
RNA 沉淀下来，这样极大地降低了沉淀中多糖的
含量。而试验中 SDS、氯仿等又是蛋白质变性剂，
可以明显的使 RNase 丧失活性 [11]。并且硼砂-SDS
法试验成本较低，试剂配制简单。可为其他果树花
期次级代谢物含量较高的花朵的总 RNA提取提供
参考。
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