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藏药榜嘎中的双酯型和内酯型生物碱分析方法研究



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3 讨论
配制十二烷基硫酸钠-正丁醇-正辛烷-水微乳流
动相,将该流动相分别稀释成表面活性剂的浓度为
0.14,0.10,0.069,0.052,0.042,0.026,0.020和
0.17mol·L-1,考察不同十二烷基硫酸钠浓度对丹
参2个有效成分的洗脱和分离情况。结果表明,当十
二烷基硫酸钠的浓度降低到0.052mol·L-1以下时,
隐丹参酮和丹参酮ⅡA不能被洗脱;对比0.14,0.10
和0.069mol·L-1,随着十二烷基硫酸钠浓度的降
低,脂溶性成分的理论板数都降低,而保留因子都增
大,并且当十二烷基硫酸钠浓度为0.14mol·L-1
时,2个脂溶性成分都可以达到基线分离,出峰时间
适宜,可以在35min内完成对2个成分的分析。故
确定十二烷基硫酸钠的浓度为0.14mol·L-1。
本研究对不同提取方法效果进行了考察,比较甲
醇超声提取、微乳超声提取和甲醇加热回流提取3种
方法。结果显示,在3种提取方法中,隐丹参酮加热
回流提取的含量最高,而丹参酮ⅡA是甲醇超声提
取的含量最高。加热回流提取含量降低的原因可能
是,丹参酮ⅡA对热不稳定,长时间的高温会使丹参
酮ⅡA部分分解。因此,选用甲醇超声进行提取。
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(收稿日期:2014-04-08)
藏药榜嘎中的双酯型和内酯型生物碱分析方法研究
康 慧1,骆桂法2*,杨凤梅2(1.青海省人民医院,西宁 810007;2.青海省食品药品检验所,西宁 810016)
摘要:目的 建立藏药榜嘎中双酯型和内酯型生物碱的测定方法,为榜嘎的质量标准提高提供参考。方法 采用高效液相色谱
法。色谱柱为:Phenomenes luna C18(250mm×4.6mm,5μm);流速:1.0mL·min
-1。双酯型生物碱的流动相为:A为乙腈-四
氢呋喃(25∶15),B为0.1mol·L-1醋酸铵溶液(每1 000mL加冰乙酸0.5mL),梯度洗脱;检测波长为235nm;柱温为室温。
内酯型生物碱的流动相为甲醇-水-氯仿-三乙胺(70∶30∶2∶0.1);检测波长230nm;柱温30℃。结果 榜嘎中均不含新乌头
碱、乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱;内酯型生物碱:阿替新在2.024~20.24μg范围内线性关系良好,线性方程:Y=1.918×
104 X-678(r=0.999 9),平均回收率97.3%,RSD=0.9%;异叶乌头碱在2.008~20.08μg范围内线性关系良好,线性方程:Y
=1.602×104 X-215(r=0.999 9),平均回收率98.6%,RSD=1.4%。结论 该方法准确,可靠,专属性强,可用于榜嘎的质量
控制。
关键词:榜嘎;唐古特乌头;船形乌头;阿替新;异叶乌头碱;高效液相色谱
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2014.05.002
中图分类号:R284   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2014)05-0443-04
Study on the analytical method of diester-type and lactone-type alkaloids in Tibetan
medicine Bangga
KANG Hui 1,LUO Guifa2*,YANG Fengmei 2(1.Qinghai Provincial People′s Hospital,Xining 810007,China;2.Qinghai Institu-
te for Food and Drug Control,Xining 810016,China)
Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of diester-type and lactone-type alkaloids in Bangga(a
Tibetan traditional medicine).Methods The column was Phenomenex luna C18(250mm×4.6mm,5μm),and the flow rate was
1.0mL·min-1.The diester-type mobile phase was A acetonitrile-tetrahydrofuran(25∶15),B 0.1mol·L-1 ammonium acetate
solution(add 0.5mL glacial acetic acid per 1 000mL),gradient elution,the detection wavelength was 235nm,and the column
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temperature was at room temperature.The lactone-type mobile phase was methanol-water-chloroform-triethylamine(70∶30∶2∶
0.1).The flow rate was 1.0mL·min-1,the detection wavelength was 230nm,and the column temperature was at 35℃.Re-
sults There is no double that ester alkaloids such as aconitine,new aconitine,and hypaconitine exist in Bangga.The linearity range
of atisine was 2.024-20.24μg,Y=1.918×10
4 X-678(r=0.999 9),and the average recovery was 97.3%,RSD=0.9%;The lin-
earity range of hetisine was 2.008-20.08μg,Y=1.602×10
4 X-215(r=0.999 9),and the average recovery was 98.6%,RSD=
1.4%.Conclusion The method is accurate,reliable and specific.It could be used for the quality control of Bangga.
Key words:Bangga;Herba aconite Tangutici;Aconitum naviculare Stapf;atisine;hetisine;HPLC
基金项目:国家民族药标准提高项目(编号:2011-713)
作者简介:康慧,女,主管药师
*通信作者:骆桂法,男,主任药师
  历代藏医药书籍对榜嘎均有记载。《蓝琉璃》[1]
记载:“本品基生叶三、四片,茎叶稍小,或深裂为七、
八片,茎小而柔,花白色有蓝红光泽。解时疫毒,清胆
热。”《晶珠本草》[2]记载:“榜嘎性凉,解瘟毒,清胆热,
洗毒蛇咬伤;生高山碎石隙和高山草甸,其块根状如
小象犬牙,叶翠绿,花螺状,甚美”。现藏医所用榜嘎,
原植物为毛茛科植物唐古特乌头Aconitum tanguti-
cum (Maxim.)Stapf和船盔乌头(船形乌头)Aconi-
tum naviculare(Bruhl.)Stapf,以全草入药,与上述
记载相符,收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》
藏药第一册[3]。唐古特乌头和船形乌头为多年生直
立草本,青海、甘肃、云南、四川、西藏少部分地区等地
多用唐古特乌头,西藏大部分地区用船形乌头,在《部
颁标准》和《中国药典》藏药成方制剂中约有41个品
种处方中含有榜嘎,约占20%左右,是常用的藏药材
之一。据文献报道[4],榜嘎全草含阿替辛、异叶乌头
碱、杂阿替辛、唐乌碱等毒性较小的内酯型生物碱。
本文经过实验研究也证明榜嘎中不含剧毒成分的双
酯型生物碱,同时对这2种植物特征性成分进行了研
究,为榜嘎的质量标准制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 日本岛津SIL-20A型高效液相色谱仪
(二极管阵列检测器);KQ5200B型超声波清洗器(40
kHz,200W,昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试药 乌头碱对照品(中国药品生物制品检定
院,批号110720-200410);次乌头碱对照品(中国药
品生物制品检定院,批号110798-20040412);新乌头
碱(中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 院,批 号 110799-
200404);阿替新(Sigma公司);异叶乌头碱(Sigma公
司);乙腈、甲醇(进口色谱纯);其他试剂为分析纯。
药材收集10批,见表1。
2 方法与结果
2.1 榜嘎药材中双酯型生物碱乌头碱类成分的
HPLC分析
表1 不同产地榜嘎药材
Tab.1Bangga of different origins
编号 供 样 产 地
1 自采样品(青海)唐古特乌头 Aconitum
tanguticum (Maxim.)Stapf
青海互助县
2 西藏藏医学院藏药厂船盔乌头(船形乌
头)Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf
西藏
3 西藏那曲地区唐古特乌头Aconitum tan-
guticum (Maxim.)Stapf
西藏
4 金诃藏药股份有限公司唐古特乌头Aco
nitumtanguticum (Maxim.)Stapf
青海
5 青海久美藏药药业有限公司唐古特乌头
Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf
西藏
6 青海东格尔药业有限公司提供唐古特乌头
Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf
青海
7 四川成都荷花池药材市场船盔乌头(船形乌
头)Aconitum navicuLare(BruhL.)Stapf
四川
8 青海晶珠藏药股份有限公司唐古特乌头
Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf
西藏
9 青海格拉丹东藏药有限公司船盔乌头(船形
乌头)Aconitum navicuLare(Bruhl.)Stapf
青海
10 青海柴达木药业有限公司唐古特乌头
Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf
青海
2.1.1 色谱条件与系统适用性实验 Phenomenex
luna C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相
[5]:
A为乙腈-四氢呋喃(25∶15),B为0.1mol·L-1醋酸
铵溶液(每1 000mL加冰乙酸0.5mL)按表2梯度洗
脱;检测波长:235nm;柱温:室温;理论板数按乌头
碱峰计算大于3 000。
表2 梯度洗脱方法
Tab.2Gradient elution program
时间/min 流动相A比例/% 流动相B比例/%
0→48  15→26  85→74
48→49  26→35  74→65
49→58  35  65
58→65  35→15  65→85
2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取乌头碱对
照品7.15mg、次乌头碱对照品16.75mg、新乌头碱
对照品7.35mg,置于50mL量瓶中,加二氯甲烷溶
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解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液(每1mL含乌
头碱0.143mg·mL-1、次乌头碱0.335mg·mL-1、
新乌头碱0.147mg·mL-1)。
2.1.3 供试品溶液的制备 取榜嘎药材粉末(过三
号筛)约3g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加氨水
6mL湿润,加入乙醚50mL,超声5min,放置过夜,
再超声5min,放冷,滤过,残渣用乙醚10mL分3次
洗涤,合并乙醚液,40℃挥干,残渣用二氯甲烷溶解并
定容至2mL,摇匀,经微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
在上述色谱条件下,分别精密吸取药材溶液各
20μL、对照品溶液10μL,注入色谱仪。榜嘎药材色
谱图中,在与乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品色谱
图相应保留时间处,无相同的色谱峰。结果表明,榜
嘎药材(唐古特乌头和船形乌头)不含双酯型乌头碱
类成分。
2.2 榜嘎药材中内酯型生物碱阿替新、异叶乌头碱
的 HPLC分析
2.2.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱:Phe-
nomenex C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相
为甲醇-水-氯仿-三乙胺(70∶30∶2∶0.1)[6];流速
1mL·min-1;柱温30 ℃;检测波长230nm。按
阿替新计,色谱柱理论板数不低于 3 000。色谱
图见图1。
图1 HPLC图
A.阿替新对照品;B.异叶乌头碱对照品;C.样品1(唐古特乌
头,自采,经鉴定);
D.样品3(船形乌头,企业提供);1.阿替新;2.异叶乌头碱
Fig.1HPLC chromatograms
A.reference substance of atisine;B.reference substance of he-
tisine;C.sample 1(Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf);
D.sample 3(Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf);1.atisine;
2.hetisine
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取阿替新、异叶
乌头碱适量,分别加二氯甲烷制成1mL约含1.012和
1.004mg的对照品储备溶液。分别精密吸取储备液
1mL,置于具塞试管中,精密加入0.01mol·L-1硫
酸溶液1mL,涡旋2min,离心5min,取上清液,
即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号
筛),约5g,精密称定,置于100mL锥形瓶中,加氨
水6mL,湿润,加乙醚50mL,超声处理5min,浸泡
过夜,放冷,再超声处理5min,放冷,滤过,滤渣用乙
醚洗涤3次,合并乙醚液,滤液在60℃下挥干,残渣用
二氯甲烷溶解并定量转移至5mL量瓶中。精密吸取
1mL,置于具塞试管中,精密加入0.01mol·L-1硫酸
溶液1mL,涡旋2min,离心5min(5 000r·min-1),
取上清液经微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
2.3 线性考察 精密吸取上述阿替新和异叶乌头碱
对照品溶液2,4,6,8和10μL,注入液相色谱仪,在
上述色谱条件下,测定峰面积,以对照品进样量为横
坐标、对照品峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,求得回
归方程。阿替新进样量在2.024~20.24μg范围内
线性关系良好,线性方程:Y=19 176 X-678(r=
0.999 9);异叶乌头碱进样量在2.008~20.08μg范
围内线性关系良好,线性方程:Y=16 018 X-215
(r=0.999 9)。
2.4 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液5μL,
连续进样5次,阿替新峰面积的RSD为0.84%,异
叶乌头碱峰面积的 RSD为0.67%,表明精密度
良好。
2.5 重复性实验 取榜嘎药材粉末5份,分别按
2.2.3项下的供试品溶液制备方法制成供试品溶液,
精密吸取5μL注入液相色谱仪,在上述色谱条件下
测定,计算阿替新、异叶乌头碱的含量,结果阿替新平
均含量为0.637mg·g-1,RSD为0.97%;异叶乌头
碱平均含量为0.494mg·g-1,RSD为0.54%,表明
该方法重复性良好。
2.6 稳定性实验 取同一供试品溶液5μL,每隔
2h进样,测得峰面积值,阿替新RSD=0.86%,异叶
乌头碱RSD=0.93%。结果表明:供试品溶液在8h
内所测得结果基本稳定。
2.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品
(青海金诃药业有限公司提供)6份,约2.5g,分别精
密加入混合对照品溶液1.5mL,低温挥干,按2.2.3
项下的方法制成供试品溶液,并按上述色谱条件测定
阿替新、异叶乌头碱含量,计算回收率。结果阿替新
和异叶乌头碱平均回收率分别为97.32%(RSD=
0.93%)和98.56%(RSD=1.37%),结果表明,该方
法准确。见表3。
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表3 回收率实验结果
Tab.3Results of the recovery test
样品含量/mg 对照品加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
阿替新 异叶乌头碱 阿替新 异叶乌头碱 阿替新 异叶乌头碱 阿替新 异叶乌头碱 阿替新 异叶乌头碱 阿替新 异叶乌头碱
1.577  1.223  1.518  1.506  3.048  2.709  96.90  98.67
1.593  1.235  1.518  1.506  3.079  2.729  97.89  99.20
1.608  1.247  1.518  1.506  3.098  2.761  98.16  100.53  97.32  98.56  0.93  1.37
1.588  1.232  1.518  1.506  3.042  2.684  95.78  96.41
1.579  1.225  1.518  1.506  3.067  2.703  98.02  98.14
1.601  1.242  1.518  1.506  3.076  2.726  97.17  98.41
2.8 样品测定 取10个厂家提供的样品10批,按
2.2.3项下的方法制成供试品溶液。精密吸取上述
对照品溶液与供试品溶液各5μL,分别注入色谱仪,
按上述色谱条件测定,计算阿替新、异叶乌头碱的含
量。结果样品编号为1,2,3,4,5,6,7,8,9和10的阿
替新含量分别为0.84,0.52,0.78,0.64,0.46,0.64,
0.46,0.63,0.42和0.57mg·g-1;异叶乌头碱含量
分别为0.65,0.45,0.54,0.50,0.51,0.62,0.55,
0.62,0.46和0.74mg·g-1。
3 讨论
采用回流提取和超声提取,提取效率相当,故采
用较为简单的超声提取方法。
曾用《中国药典》制草乌项下的方法与文献报道
的提取方法,在色谱分离上无大的差异,但采用《中国
药典》项下的流动相梯度洗脱,耗时且在分离过程中
易向上漂移;后经摸索用文献报道的流动相,将对照
品和样品酸化后进样,峰形尖锐,对称性好。
藏药榜嘎为藏文音译名“榜阿嘎保”的简称,所用
药材为唐古特乌头和船形乌头,另一种藏药榜玛的音
译名“榜阿玛保”所用药材为褐紫乌头;还有一种藏药
榜那的音译名为“榜阿那保”,所用药材为铁棒锤和工
布乌头等,前2种有解毒作用,后一种有大毒,应加以
区别。
榜嘎是属于唐古特乌头系,植物化学分类上可将
此系称为内酯型二萜生物碱类群。此类群植物花粉
粒形态有一定差异[7],其毒性在乌头属中最小,所含
生物碱成分是以内酯型二萜生物碱为主,实验也表
明,榜嘎不含毒性较大的双酯型生物碱(乌头碱类)成
分,这与《蓝琉璃》和《晶珠本草》记载及藏医用以解时
疫毒、清胆热相符合。
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(收稿日期:2014-04-16)
黄翘HPLC指纹图谱研究
崔誉文1,杨黎彬1,杨 静1,许苗苗2,程茜菲2,宋小妹2*,崔九成2(1.西安医学院,西安 710021;2.陕西中医学院,咸
阳 712046)
摘要:目的 建立黄翘 HPLC指纹图谱,为黄翘的质量控制提供理论依据。方法 色谱柱:Thermo C18 Column(250mm ×
4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水,梯度洗脱;检测波长:203nm。结果 生成了黄翘的对照指纹图谱,标定了17个共有峰,并确
定连翘苷、连翘酯苷A和表松脂素各峰的归属。结论 黄翘的 HPLC指纹图谱稳定,重复性良好,信息涵盖量大,为进一步科学
评价黄翘的质量提供依据。
关键词:黄翘;连翘苷;连翘酯苷A;表松脂素;HPLC;指纹图谱
doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2014.05.003
中图分类号:R284.1   文献标志码:A   文章编号:1004-2407(2014)05-0446-04
644 西北药学杂志 2014年9月 第29卷 第5期