全 文 ：基金项目:重大新药创制国家科技重大专项(编号:2014ZX09304307001-014;2014ZX09301308-007);国家科技支撑计划(编号:
2015BAI05B02);国家科技计划港澳台合作专项(编号:2015DFM30030)
通信作者:李西文，副研究员，研究方向:中药栽培与鉴定，Tel:(010)84084107，E-mail:xwli@ icmm. ac. cn
藏药材榜嘎及其混伪品的 DNA条形码鉴定研究
郭豪杰1，2 丁 钰1 陈维武3 刘海涛2 边巴次仁3 李西文1
(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100700;2 中国医学科学院药用植物研究所，北京，100193;
3 西藏奇正藏药股份有限公司，林芝，860000)
摘要 目的:利用 DNA条形码技术对榜嘎及其混伪品进行鉴别，为藏药榜嘎的鉴定提供准确可靠的依据。方法:通过分
析榜嘎及其混伪品 ITS和 ITS2 序列的遗传距离、种内种间变异并构建 NJ 系统发育树，以评价 ITS2 和 ITS 序列的鉴定效
率。结果:本研究中 ITS2 和 ITS序列扩增效率相同，在 blast 比对和遗传距离距离分析上，ITS 序列表现出更强的鉴定能
力;通过 K2P距离构建 NJ树，ITS2 和 ITS序列在榜嘎与混伪品间的种间变异无统计学意义，但 ITS 序列对易混物种的鉴
定效率较高。结论: ITS序列可作为鉴定榜嘎及其混伪品的有效条形码。
关键词 藏药榜嘎乌头属;ITS
Identification of Herba Aconiti Bonga and Its Adulterants Using DNA Barcode
Guo Haojie1，2，Ding Yu1，Chen Weiwu3，Liu Haitao2，Bianba Ciren3，Li Xiwen1
(1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;
2 Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical
College，Beijing 100193，China;3 Tibet Cheezheng Tibetan Medicine Co.，ltd.，Linzhi 860000，China)
Abstract Objective:To select an effective barcode for identifying Herba Aconiti Bonga and its adulterants using DNA barcoding
technology. Methods:This study compared ITS and ITS2 sequences and analyzed genetic distances，the variations of inter-and intra-
species. Neighbor-joining tree was also constructed for evaluate their identification efficiencies based on the sequences from experi-
mentaland GenBank database. Results:The results showed that ITS and ITS2 sequences had the same amplication efficiency. ITS
sequence had a better performance than ITS2 on species identification efficiency using blast and nearest distance methods. The two
barcodes showed no significant difference on the identification uing NJ tree to distinguish Herba Aconiti Bonga and its adultra-
nts. However results demonstrated that ITS can also identify all species among adultrants of Herba Aconiti Bonga. Conclusion:ITS
sequence can be used as the effective barcode to identifyHerba Aconiti Bonga and its adulterants．
Key Words Tibetan medicine;Herba Aconiti Bonga;Aconitum;ITS
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1673 － 7202． 2016． 01． 003
藏医药是中国传统医药的重要组成部分，具有
悠久的历史、独特的医疗和研究价值及市场开发潜
力［1］。榜嘎是藏医习用藏药材，为毛茛科乌头属植
物船盔乌头 (Aconitum naviculare)或甘青乌头
(A. tanguticum)的干燥全草，味苦，性凉，具有清
热解毒与燥湿之功效，主要用于治疗热病等［2］。船
盔乌头在我国主要分布于西藏南部 3200 ～ 5000 m
的山坡草地或灌木丛中，甘青乌头分布于西藏东
部、云南西北部、四川西部等地 3200 ～ 4800 m 的
山地草坡或沼泽草地［3］。《晶珠本草》将乌头属分
为“白、黄、红、黑”四种，其中榜嘎属于白乌
头。
乌头属药材形态相似，榜嘎有较多混用和代用
品，西藏地区用叉苞乌头，青海用祁连乌头，川西用
刷经寺乌头作为榜嘎使用。同时，由于地域上的差
异，同名异物或同物异名的现象也是造成榜嘎混用
乱用原因之一［1］。榜嘎在不同著作中曾出现多个藏
语名，《蒙药正典·美丽日饰》中记载用百合科麦冬
(Ophiopogon japonicus)作为榜嘎的来源植物［4］。传
统鉴别方法受地域差异、活性成分和亲缘关系等因
素影响，存在鉴定局限性。乌头属植物大多具有毒
性，为保障临床用药安全，寻求一种榜嘎药材快速准
确的鉴定方法则显得尤为迫切。
DNA条形码技术具有通用性强、鉴定结果可
靠、重复性良好等优点，被广泛用于中药材鉴定
中［5］。ITS2 是中国学者通过大量样本的系统研究，
提出的可以作为鉴定药用植物和近缘种的通用条形
码［6］。ITS / ITS2 是中国植物 DNA 条形码研究组提
·367·世界中医药 2016 年 5 月第 11 卷第 5 期
出可作为种子植物核心条形码的序列［7］。目前榜嘎
的鉴别主要是传统的性状和显微鉴别，我们在本文
通过多种数据分析方法分析 ITS和 ITS2 对榜嘎及其
混为品的鉴别能力，为建立合适的榜嘎 DNA 条形码
技术奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器 实验物种包括工布乌头(Aconi-
tum kongboense)、铁棒锤(A. pendulum)和甘青乌头
(A. tanguticum)、麦冬(Ophiopogon japonicus)等。植
物基因组 DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech Co. ，中
国)，2 × Tag PCR Master Mix(北京艾德莱生物科技
有限公司，中国)，引物由生工生物工程(上海)股份
有限公司合成。scientz-48 高通量组织研磨仪(宁波
新芝生物科技股份有限公司，中国)，2720PCR 仪
(Applied Biosystems ，USA)，1-14K 高速离心机
(SIGMA，Germany)。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA提取 取药材样品约 50 mg，用高通量
组织研磨仪研磨 2 min(50Hz)后，利用植物基因组
DNA提取试剂盒提取总 DNA。
1. 2. 2 PCR扩增及测序 反应体系为 2 × Tag PCR
Master Mix 12. 5 μL，正反向引物(2. 5 μM)各 1. 0
μL、模板 DNA2. 0 μL，加 ddH2O 补至 25 μL。各条
形码的引物序列和 PCR 反应程序见表 1。1%琼脂
糖电泳检测 PCR扩增情况，由测序公司进行双向测
序。
表 1 引物序列和 PCR反应程序
序列 引物 引物序列(5＇－ 3＇) PCR反应程序
ITS2 S2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT 94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 cycles;72 ℃ 10 min
S3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT
ITS 5F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1. 5 min + 3 s /cycle，30 cycles;72 ℃ 7 min
4R TCCTCCGCTTATTGATATGC
表 2 Genbank数据
物种名 Genbank登录号
A. alboviolaceum JF975782 JF975783 JF975785
A. apoiense KJ078593 KJ078594 KJ078595
A. austroyunnanense JQ350821 JQ350822 JQ387580
A. barbatum JF975798 JF975802 JF975804 JF975805
A. ferox KM887357 KM887365 KM887381
A. forrestii AY164644 AY189783
A. henryi KF022318 KF022319
A. kongboense KM079168 KM079169 KM079170
A. longecassidatum JF975807 JF975809 JF975810 JF975811
A. ludlowii KM079165 KM079166 KM079167
A. lycoctonum AF216537 AF216539 AF216541 AF216542
A. nagarum AY189790 AY571347
A. naviculare KM097993 KM097994 KM097995 KM097996
A. pentheri JF331905 JF331909 JF331913 JF331917
A. pulchellum KM079162 KM079163 KM079164
A. richardsonianum KM098011 KM098013 KM098024 KM098026
A. rockii KF022320 KF022321 KF233840
A. sachalinense KJ482006 KJ482007 KJ482008 KJ482009 KJ482010
A. scaposum AY150231 JF975815 JF975816 JF975818
A. shennongjiaense JF975819 JF975820
A. sinomontanum KF022322 KF022323 KF022324
A. sungpanense AY189795 AY189796
A. tanguticum KM098040 KM098042 KM098043 KM098046 KM098049
A. variegatum KF219805 KF219812 KF219824
Paeonia suffruticosa JN572149 EU369007 EU224272 FJ528285
Paeonia veitchii JN622190 KC821539 KC821540 JN622191 U27695
Paeonia lactiflora JN572150 EU591986 FJ514502 JQ743067 U27682
Ophiopogon japonicus EU930854 KF671258 KF671255 KF671252 KF671250
1. 2. 3 数据处理 将测序峰图用 Codon Code A-
ligner软件进行拼接，将每个片段两端引物及低质量
序列切除，得到所需片段并对 ITS2 进行注释剪切。
同时从 GenBank 数据库中搜集并下载榜嘎及其混
伪品 ITS序列(表 2)，注释剪切后得到 ITS2，结合实
验样品序列，运用 MEGA 6. 0 建立 NJ 树，计算遗传
距离，分析榜嘎及其混伪品亲缘关系;采用 Perl 语
言统计不同序列种内种间遗传差异;运用最近距离
法(K2P nearest distance)和相似性搜索法(BLAST1)
考察序列的鉴定效率［8］。
2 结果与分析
2. 1 序列信息和鉴定效率 各序列数量、长度范
围、GC 含量、遗传距离、鉴定效率等信息见表 3。
ITS2 由 ITS 注释而来，所以 ITS2 与 ITS 数量相等，
都为 148 条。ITS2 的长度范围为 194 ～ 227bp，ITS
的长度在 605 ～ 777bp 之间。平均 GC 含量，ITS2 为
62. 15%，ITS 为 59. 26%。ITS2 和 ITS 的最小遗传
距离相同，都为 0. 0000;平均遗传距离 ITS 较小，为
0. 1702，ITS2 为 0. 2815;最大遗传距离 ITS2 较大，
为 0. 8423，ITS为 0. 5351。从鉴定效率看，ITS 表现
较好，BLAST1 和 Nearest distance 鉴定效率都为
100%，ITS2 的 BLAST1 和 Nearest distance 鉴定效率
都为 98. 04%。综上所述，虽然 ITS2 最大遗传距离
比 ITS大，但是 ITS最小遗传距离要小于 ITS2，并且
ITS的鉴定效率高于 ITS2，所以从序列信息和鉴定
效率方面考虑，ITS 更适合作为榜嘎及其混伪品的
DNA条形码。
·467· WORLD CHINESE MEDICINE May． 2016，Vol． 11，No． 5
图 1 NJ系统发育树
2. 2 不同序列种内种间差异 利用 perl 语言统计
ITS2 和 ITS 序列的 6 个值:种内变异(Theta)、种内
最大变异(Coalescent depth)、平均种内变异(All in-
tra-specific distance)、种间变异(Theta prime)、种间
最小变异(Minimum inter-specific distance)、平均种
间变异(All inter-specific distance)(表 4)。ITS2 和
·567·世界中医药 2016 年 5 月第 11 卷第 5 期
ITS序列的种间最小变异均大于种内最大变异，ITS2
的种内变异、平均种内变异、种间变异和平均种间变
异与 ITS 相似。综上所述，在种内种间差异方面，
ITS2 和 ITS序列对榜嘎及其混伪品鉴定方面都有很
好表现，无明显差别。
表 3 序列信息和鉴定成功率
序列特性 ITS2 ITS
序列数 102 102
长度 /bp 194 ～ 227 605 ～ 777
平均 GC含量 /% 62. 15 59. 26
遗传距离 最大值 0. 8423 0. 5351
最小值 0. 0000 0. 0000
平均值 0. 2815 0. 1702
鉴定效率 BLAST1 /% 98. 04 100
Nearest distance /% 98. 04 100
表 4 种内种间差异分析
参数 ITS2 ITS
种内变异 0. 0042 ± 0. 0060 0. 0044 ± 0. 0062
种内最大变异 0. 0080 ± 0. 0126 0. 0082 ± 0. 0148
平均种内变异 0. 0067 ± 0. 0103 0. 0069 ± 0. 0126
种间变异 0. 0679 ± 0. 0170 0. 0584 ± 0. 0138
种间最小变异 0. 0195 ± 0. 0206 0. 0185 ± 0. 0165
平均种间变异 0. 0676 ± 0. 0395 0. 0603 ± 0. 0325
2. 3 NJ 树鉴别分析 基于 K2P 遗传距离建立 NJ
树，可以用来分析不同物种间的亲缘关系，以达到鉴
别物种的目的。如图 1 所示，ITS2 和 ITS 序列都可
以将榜嘎及其混伪品分开，但 ITS2 序列对乌头属其
他物种的鉴定效率相对较差。ITS 序列表现出良好
的鉴别能力，能够将不同的物种分到不同的分支上，
更适合作为鉴定榜嘎及其混伪品的条形码序列。
3 讨论
乌头属植物作为有毒植物及药用植物一直倍受
广泛的关注，全属约有 350 种植物，我国约有 167
种，其中 53 种可作药用［2-3，9］。乌头属植物种间系
统发育复杂，该属的分子生物学研究报道较少，多集
中于生物多样性的研究，如 ISSR 分析、RAPD 分
析［10-12］，鲜有生药学的分子鉴定研究。He等利用条
形码技术对乌头属的 19 个物种 134 份样品进行鉴
定研究，但其研究仅用到 psbA-trnH 序列，没有对
ITS / ITS2 序列进行分析［13］。榜嘎，藏名榜阿嘎保，
全草均可入药，有小毒，历代藏医药书均有记载，具
有清热解毒之功效，多用于各种热病的治疗，属于多
基原藏药材，同时同属混伪品较多，多有毒性，传统
方法鉴定困难，给临床用药带来诸多隐患。
传统藏药植物药缺乏系统分类基础研究，多采
用手摸、眼看、奔闻、嘴尝、水试、火试等表观鉴定方
法。藏药的使用也多依赖经验和古书记载，地区差
异大，如《晶珠本草》中榜嘎为乌头属植物，《蒙药正
典·美丽日饰》记载以百合科麦冬作为榜嘎的基原
植物［3］，因此建立一种科学快速的藏药基原物种鉴
定方法迫在眉睫。DNA 条形码在物种鉴定上具有
快速、有效、操作简便、通用性强以及易于形成标准
化等特点，已有广泛的研究和应用基础。本研究针
对榜嘎及乌头属常见混伪品的 ITS2 和 ITS 序列进
行比较分析，结果显示，ITS2 和 ITS扩增效率无统计
学意义。Blast1 和 Nearest distance 2 种分析方法上，
ITS序列鉴定效率优于 ITS2;通过 K2P 遗传距离构
建 NJ树，ITS序列表现出更好的鉴定能力。综合分
析，ITS序列可以作为榜嘎及其混伪品鉴定的候选
条形码序列。本研究为藏药材榜嘎的鉴定提供了新
的分子生物学方法，可保障其临床用药安全。
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( 2016 － 04 － 12 收稿 责任编辑:洪志强)
·667· WORLD CHINESE MEDICINE May． 2016，Vol． 11，No． 5