全 文 ： 药物定性定量研究
HPLC法测定藏药材铁棒锤 、榜嘎中酯型生物碱的含量
四川省中医药科学院(成都 610041) 陈 燕 易进海 ＊ 刘云华
西藏自治区藏医院(拉萨 850000) 德 吉 扎 西
摘 要:目的:建立 RP-HPLC法测西藏不同产地的铁棒锤 、榜嘎中酯型生物碱的含量方法。方法:采用高效液相色谱法。色
谱柱为 AichromC18分析柱(4.6mm×150mm, 5μm);柱温:35℃;流动相:甲醇 -0.05mol· L-1磷酸二氢钾 -醋酸 -异丙醇(67:
173:4:4);检测波长:230nm;流速:1.0mL· min-1。结果:乌头碱在 0.04816 ～ 0.09632μg(r=0.9998)范围内呈线性。乌头碱
加样回收率为 96.3%, RSD为 1.87%(n=6)。结论:方法可控 , 结果稳定 ,为乌头类药材含量测定提供一个参考方法。
关键词:榜嘎;铁棒锤;乌头碱;苯甲酸;酯型生物碱;高效液相色谱法
中图分类号:R291.4 文献标识码:B 文章编号:1006-6810(2009)06-0047-03
藏药材铁棒锤 、榜嘎分别为毛茛科乌头属铁棒锤 Aco-
nitumszechenyianumGay.的干燥根和船形乌头 Aconitumna-
viculareStapf或甘青乌头 Aconitum tanguticum(Maxim.)
Stapf干燥全草 , 主产于西藏 、甘肃南部 、青海 、四川西部等
地 , 为藏族习用药材 , 具有活血祛瘀 ,祛风除湿 ,止痛消肿的
功效。用于腰肌劳损 , 风湿关节痛等疾病的治疗 〔1〕。收载
于 2005版药典附录Ⅲ中 ,其同属植物有川乌和附子等, 该属
植物的主要毒性成分为二萜双酯型生物碱 , 为了有效控制原
药材质量 ,保证临床用药安全有效, 应对其进行限量测定, 本
文曾采用现行版药典中制川乌项下的酯型生物碱限量检查
方法(比色法)进行测定 ,操作过程中发现干扰因素多 , 样品
的重复性 、稳定性不够理想, 对药材限量标准的制定有一定
局限性。本文根据酯型生物碱的主要毒性成分为乌头碱(a-
conitine)、次乌头碱(hypaconitine)和新乌头碱(mesaconi-
tine)〔2〕 ,其化学结构的共同特征是含有苯甲酰酯基 , 可定量
地水解生成苯甲酸 〔3〕 , 以苯甲酸为标识成分 ,按乌头碱计作为
本品酯型生物碱的含量 ,制定含量限度 ,控制本品的质量。
三种二萜生物碱的结构式
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:Waters1525泵 , 2487双通道紫外检测
器 , Waters柱温箱 , Breeze液相色谱工作站;Brasson超声清
洗仪;塞多利斯十万分之一电子天平。
＊通讯作者:易进海:研究员 , 博士 , 主要从事中药新药研发工
作 , Tel:(028)85210843, E-mail:yicy64@163.com
铁棒锤和榜嘎药材由西藏自治区藏医院提供 , 经四川省中
医药科学院舒光明研究员鉴定为毛茛科乌头属铁棒锤 Aco-
nitumzechenyianumGay.的干燥根和船形乌头 Aconitumna-
viculareStapf或甘青乌头 Aconitumtanguticum(Maxim.)
Stapf干燥全草 ,乌头碱(批号 110720-200409)由中国药品
生物制品检定所提供。苯甲酸 ,分析纯 ,纯度大于 98%。甲
醇为美国 Tedia色谱纯 , 水为超纯水 ,其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验:色谱柱为 AichromC18分
析柱(4.6mm×150mm, 5μm);柱温:35℃;流动相:甲醇 -0.
05mol·L-1磷酸二氢钾 -醋酸 -异丙醇(67:173:4:4);检测
波长:230nm;流速:1.0mL· min-1。进样量 10μl。理论板数
按苯甲 不低于 2000。在此色谱条件下 , 乌头碱对照品 、苯甲
酸对照品 ,铁棒锤 、榜嘎药材的 HPLC图谱见图 1、2、3、4。
2.2 对照品溶液的制备:精密称取乌头碱对照品 6.02mg,
加 5%氢氧化钾甲醇溶液 10ml, 加热回流 1h, 回收甲醇 , 冷
却 ,加 0.5mol· L-1硫酸溶液约 9ml调 pH值至 3 ～ 4, 转入
分液漏斗中 ,用乙醚 10ml分次洗涤容器 , 并入分液漏斗中 ,
振摇 ,分取乙醚层 , 再用乙醚提取 2次 ,每次 10ml合并乙醚
472009年 6月第 6期 中国民族医药杂志 DOI :10.16041/j.cnki.cn15-1175.2009.06.028
液 , 低温(35℃)减压回收乙醚 , 残渣加甲醇使溶解 , 转入
25ml量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 精密量取 2ml置
10ml量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 , 作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备:取药材铁棒锤粗粉约 1g, 船形乌
头约 5g,分别精密称定 ,置具塞锥形瓶中 , 加乙醚 50ml与氨
试液 4ml,密塞 , 摇匀 ,放置过夜 , 滤过 , 药渣加乙醚 50ml, 连
续振摇 1h,滤过 , 药渣再用乙醚洗涤 3 ～ 4次 , 每次 15ml, 滤
过 , 洗液与滤液合并 , 低温蒸干。残渣加 5%氢氧化钾甲醇
溶液 10ml, 加热回流 1h,回收甲醇 ,冷却 , 加 0.5mol· L-1硫
酸溶液约 9ml调 pH至 3 ～ 4, 转入分液漏斗中 ,用乙醚 10ml
分次洗涤容器 ,并入分液漏斗中 , 振摇 ,分取乙醚层 , 再用乙
醚提取 2次 , 每次约 10ml合并乙醚液 ,低温(35℃)减压回
收乙醚 , 残渣加甲醇超声溶解 , 分次转至 10ml量瓶中 , 加甲
醇稀释至刻度 , 摇匀 ,作为供试品溶液。
2.4 标准曲线的绘制:分别精密吸取乌头碱对照品溶液 2.
0、4.0、6.0、8.0、10.0μl进样测定 , 以峰面积为纵坐标 , 进样
量为横坐标 , 绘制标准曲线 , 得回归方程为 Y=6.974 ×
105X-28.1, r=0.9998;表明乌头碱在 0.04816 ～ 0.
09632μg范围内进样量与峰面积呈良好线性关系。
2.5 精密度试验:精密吸取同一对照品溶液重复进样 5
次 , 测其峰面积 , 计算 RSD为 1.04%, 表明仪器精密度良
好。
2.6 重复性试验:取同一铁棒锤药材粉末(批号:01)5份 ,
分别照 2.3项下方法制备供试品溶液 ,进样测定乌头碱的
峰面积 , 计算样品中酯型生物碱(以乌头碱计)质量分数平
均为 0.72mg· g-1 , RSD为 1.83%。表明含量测定方法的
精密度良好。
2.7 稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液(批号:01)
10μl, 于室温 0、2、4、6、8、 24h进样测定乌头碱峰面积 , 计算
其 RSD为 1.26%,表明供试品溶液在 24h内稳定。
2.8 加样回收率试验:精密称取 6份已知酯型生物碱含量
的铁棒锤药材粉末(批号:01, 含量 0.72mg· g-1)各 0.5g,
分别精密加入乌头碱对照品溶液(0.2408mg· ml-1)1.5ml,
照 2.3项下方法制备供试品溶液 ,进样测定 , 计算平均回收
率为 96.3%, RSD为 1.87%。
2.9 水解条件的选择:以 5%氢氧化钠甲醇溶液为水解介
质 , 考察水解时间对测定结果的影响 , 照样品测定项下方法
操作 , 回流水解时间分别为 0.5, 1和 2h, 测定样品(批号:
01)中酯型生物碱含量 , 分别为 0.64mg· g-1 , 0.73mg·
g-1 , 0.71mg· g-1。故选择水解时间为 1h。
2.10 样品含量测定:取不同产地的铁棒锤 8批 、榜嘎 5
批 , 分别照 2.3项下方法制备供试品溶液 , 进样测定 , 用外
标两点法计算样品中酯型生物(以乌头碱计)含量 , 同时 , 按
《中国药典》 2005版一部制川乌项下的紫外 -可见分光光
度法方法测定铁棒锤和榜嘎中的酯型生物碱含量 〔4〕 , 结果
见表 1。
表 1 不同产地铁棒锤和榜嘎中酯型生物碱的测定结果
批号 品名(产地西藏) 酯型生物碱含量(HPLC)mg· g-1
酯型生物碱含量
(UV)mg· g-1
01 铁棒锤(山南桑那县) 0.72 11.13
02 铁棒锤(山南隆孜县) 0.81 11.74
03 铁棒锤(山南措那县) 0.76 11.42
04 铁棒锤(堆隆) 0.56 9.38
05 铁棒锤(加查) 0.61 10.03
06 铁棒锤(加查) 0.69 10.21
07 铁棒锤(加查) 0.49 7.97
08 铁棒锤(林芝) 0.44 7.63
08 榜嘎(山南桑那县) 0.19 2.31
09 榜嘎(山南隆孜县) 0.17 2.16
10 榜嘎(羊己井) 0.22 3.11
11 榜嘎(羊己井) 0.11 1.98
12 榜嘎(墨竹贡卡) 0.08 1.22
3 讨 论
参照 05版药典 P27川乌中酯型生物碱的提取方法。
对样品采用氨乙醚冷浸提取样品中生物碱 , 这是由于乌头
类生物碱在碱性环境下以游离型存在 , 能充分溶于有机溶
剂而被萃取出来。
曾采用 HPLC法同时测定乌头碱 、次乌头碱和新乌头
碱 ,试验发现由于大多流动相中均需含有二乙胺或三乙
胺 〔5〕 ,检测过程中柱效逐渐降低 , 基线漂移 , 分离度差 ,峰形
影响较大。
通过 HPLC检测证明氨 -乙醚不能从药材中提出苯甲
酸 , 即是苯甲酸单体也不被氨 -乙醚提出 , 显示样品中水
解所得的苯甲酸为含有苯甲酰酯基键的双酯型生物碱提
供。
试验中发现碱水解优于酸水解 , 苯甲酸在酸性条件下
不稳定 ,游离的苯甲酸在较高温度下易升华 ,因此样品提取
过程中最后一步采用乙醚而非氯仿 , 并注意在低温下减压
回收制备样品。
参考文献
〔1〕国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准藏药
〔S〕.第一册.1995.79, 85.
〔2〕王慕邹 , 等.乌头中主要生物碱的高效液相色谱测定
〔J〕.药学学报 , 1983, 18(9):689.
〔3〕陈幸 , 等.对中国药典附子中乌头碱限量检查的商榷
48 中国民族医药杂志 2009年 6月第 6期
〔J〕.药物分析杂志 , 1995, 15(4):6.
〔4〕国家药典委员会.中华人民共和国药典〔S〕.一部.化学
工业出版社 , 2005.27.
〔5〕孙婷婷 , 等.HPLC法分离测定四逆汤中三种酯型生物
碱及其 6种水解产物〔J〕.中国中药杂志 , 2006, 31(19):
1634.
2009年 1月 14日收稿
Determinationofester-alkaloidsinAconitumszechenyianum
andnavicularebyRP-HPLC
ChenYan, YiJin-hai＊ , LiuYu-hua
(SichuanAcademyofChineseMedicineSciences, Chengdu610041)
(TibetMedicalHospitalofTibetAutonomousRegion, Lasa850000)
Abstract:Objective:Toestablishdeterminationmethodsofester-alkaloidsinAconitumszechenyianumandAconi-
tumnaviculare.Methods:ThechromatographicmethodwascariedoutonAichromC18 columnusingCH3OH-0.
05mol·L-1KH2PO4-CH3COOH-(CH3)2CHOH(67:173:4:4)asamobilephase.Thedetectionwavelengthwas
setat230nm.Theflowratewas1.0mL·min-1.Thecolumntemperaturewas35℃.Results:Theaconitinecali-
brationcurveswerelinearattherangesof0.04816 ～ 0.09632μg(r=0.9998)Theaveragerecoveriesofaconitine
was96.3%withRSD=1.87%.Conclusion:Thismethodissimple, reliableandprovidesareferencestandardfor
thequalitycontrolofaconitumalkaloids.
Keywords:aconitumszechenyianum;aconitumnaviculare;aconitine;benzoicacid;ester-alkaloids;RP-HPLC
镰形棘豆外敷治疗跟骨痛 21例
青海省海西州蒙藏医院(871000) 尕 贝
关键词:跟骨痛;藏药;外敷
中图分类号:R291.4 文献标识码:B 文章编号:1006-6810(2009)06-0049-01
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1 一般资料
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疼痛明显减轻 ,占 24%;1例无效 ,占 5%;总有效率 95%。
4 典型病例
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里疼痛加剧 ,影响劳动 , 摄片显示为双跟骨骨刺。用镰形棘
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症状完全消失。随访 1年未复发。
2009年 4月 13日收稿
492009年 6月第 6期 中国民族医药杂志