全 文 ：第 28卷第 3期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 28, No. 3
2006年 6月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis June, 2006
文章编号:1000 - 2286(2006)03 - 0440 -04
酸性染料比色法测定断肠草
总生物碱的含量
陈志慧 ,宋光泉 ,周家容
(仲恺农业技术学院 化学与化工系 , 广东 广州 510225)
摘要:建立了断肠草总生物碱含量的酸性染料比色测定法 ,并考察了各种因素对测定结果的影响。以溴甲酚绿
作为测试用酸性染料 ,在总生物碱与其形成稳定络合物时间范围内 , 利用比色法测定了断肠草总生物碱的含
量。此方法快速简便 、准确易行。
关键词:断肠草;总生物碱;酸性染料比色法
中图分类号:Q949. 776. 3　　文献标识码:A
Determ ination of TotalA lkaloid ofGelsem ium elegans Benth
by Bromophenol B lue Colormi etry
CHEN Zhi - hui, SONG Guang - quan, ZHOU Jia - rong
　　(Department of Chem istry and Chem ica l Eng inee ring, Zhongka i Co llege of Agricu lture and Techno logy,
Guangzhou 510225, China)
　　Abstract:An acid - dye co lorime try method w as deve loped fo r the de term ination of tota l a lkaloid ofGel-
sem ium elegans Ben th. The in fluence of various affecting the resu lt of determ ination w as investigated. The con-
tent of tota l alkalo id o fGelsem ium elegans benth w as determ ined by bromecresol g reen. It could be concluded
that th is is a specific, qu ick and simp le method for the determ ination of to tal a lkaloid o fGelsem ium elegans
Ben th.
Key words:Gelsem ium elegans Benth;tota l a lkaloid;bromopheno l blue co lorimetry
断肠草 (Gelsem ium elegans Benth ),中草药名钩吻 ,又名毒根 、大茶药 、胡蔓藤 、野葛等 ,为马钱科 ( lo-
ganiaceae)胡蔓藤属的全草 [ 1] ,药用其根 、茎 、叶 ,性温味辛 、苦 ,有大毒 [ 2] 。主产于亚洲和北美 ,我国主
要分布于浙江 、福建 、广东 、广西 、湖南 、贵州 、云南等省的山地灌木丛中[ 3] ,是世界著名的剧毒植物。国
内外学者研究表明 ,断肠草具有多方面的药理作用 ,如抑制呼吸中枢和心脏收缩作用 ,松弛平滑肌 、镇
痛 、散瞳 、促进巨噬细胞吞噬功能 ,抗炎 、抗肿瘤 、抑制血小板聚集作用等 。断肠草主要含生物碱 ,为其重
要的有毒成分。国产断肠草中所含生物碱 ,又以钩吻素子含量最高 ,为其主要成分 [ 4] 。由于断肠草毒
性较大 ,且其治疗剂量与中毒剂量接近 ,使其推广应用受到限制。近年来 ,在断肠草临床效果的诱惑下 ,
研究又日趋活跃 ,目前已从过去的仅供外用发展为酊剂 、浸膏 、合剂 、注射剂等多种剂型 ,应用范围也逐
步扩大 。对断肠草总生物碱的含量测定方法进行了较为详细的研究 ,建立了利用酸性染料比色法测定
总生物碱含量的方法 ,使其能更好地应用于临床。
收稿日期:2005 - 12 - 07　　修回日期:2006 - 03 -23
基金项目:仲恺农业技术学院科研基金资助项目(G3052722)
作者简介:陈志慧 (1966 -),女 , 实验师 ,主要从事实验教学及应用化学研究工作, E -ma il:chen1966@ zhku. edu. cn。
第 3期 陈志慧等:酸性染料比色法测定断肠草总生物碱的含量
　　图 1　3种酸性染料的空白液紫外光谱图
　　F ig. 1　UV - v is spectra o f three ac ticdyess blank so lution
　　图 2　对照品与溴甲酚绿 、溴酚蓝络合物紫外光谱图
　　F ig. 2　UV - v is spectra of contrast and b rom opheno l, brom cre so l g reen comp lexes
1　材料与方法
1. 1　仪器 、试剂与材料
752C紫外 -可见分光光度计 (上海第三分析析仪器厂 ), ZD - 2型酸度计(上海大中分析仪器厂 ),
FA1004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
实验所用药材采自粤东地区 ,经生药学方法鉴定为为马钱科 (Logan iaceae)植物断肠草 (Gelsem ium
elegans Benth)的干燥根茎。钩吻素子标准对照品(中国生物制品检定所 )。其他试剂均为国产分析纯 。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　对照品溶液的制备　精密称取钩吻素子对照品 0. 051 3 g,加入少量 1 mo l /LHC l溶解 ,用无水
乙醇定容于 100mL容量瓶中 ,摇匀 ,制成 0. 513 mg /mL的溶液 ,冰箱贮存 ,备用。
1. 2. 2　供试样品溶液的制备　采用文献方法 [ 5]提取得到总生物碱浸膏。用减量法精密称出 0. 117 3 g
浸膏 ,用少量 1mo l /LHC l溶解后 ,用无水乙醇定容于 100mL容量瓶中(1. 173 mg /mL),摇匀备用。
1. 2. 3　酸性染料 、缓冲溶液的配制　pH3. 5, pH4. 0, pH5. 0醋酸 -醋酸钠缓冲液均按中国药典配制。
酸性染料选择常用的溴麝香草酚蓝 、溴酚蓝 、溴甲酚绿作为筛选对象 ,其溶液均按药典方法配制 。
2　结果与分析
2. 1　酸性染料种类及测定波长的选择
在分液漏斗中加入 pH4. 0醋酸 -醋酸钠缓冲液 5. 0 mL,然后分别加入溴麝香草酚蓝 、溴酚蓝 、溴甲
酚绿 3种酸性染料溶液各 1. 0 mL,摇匀 ,加入 10 mL氯仿萃取 ,氯仿萃取液作为 3种酸性染料的空白溶
液 ,分别进行波长扫描 ,随行氯仿作空白 ,波长扫
描图谱如图 1所示。在 300 ～ 500 nm范围内 ,溴
酚蓝和溴甲酚绿空白溶液的吸光值较小 ,而溴麝
香草酚蓝空白溶液的吸光值较大 ,所以放弃不用。
在分液漏斗中分别精密加入钩吻素子对照品
溶液 20 μL,挥干乙醇 ,然后加入 pH4. 0醋酸 -醋
酸钠缓冲溶液 5. 0 mL,再分别加入溴酚蓝 、溴甲
酚绿两种酸性染料溶液各 1. 0 mL, 摇匀 ,加入
10 mL氯仿萃取 ,氯仿萃取液分别进行紫外扫描。
随行氯仿作空白 ,紫外扫描图谱如图 2所示。从
图 2分析 , 溴酚蓝络和物的最大吸收波长为
425 nm ,溴甲酚绿络和物的最大吸收波长为 410 nm。因此 ,选择在 425 nm 处测定与溴酚蓝络和物的
吸光值 ,在 410 nm 处测定与溴甲酚绿络和物的吸光值 。
2. 2　络合物稳定性考查
分别吸取钩吻素子对照品溶液及样品溶液各 20 μL,加入 pH4. 0醋酸 -醋酸钠缓冲溶液 5. 0 mL,
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
再分别加入溴酚蓝 、溴甲酚绿两种酸性染料溶液各 1. 0 mL,摇匀 ,加入 10mL氯仿萃取 ,分别在不同时
间测定吸光度值 。标准品溶液以及样品溶液与溴甲酚绿络合物的稳定性考查结果如表 1所示 (测定波
长为 410 nm)。对照品溶液以及样品溶液与溴酚蓝络合物的稳定性考查结果如表 2所示(测定波长为
425 nm)。由吸光值可以看出 ,对照品溶液以及样品溶液与溴酚蓝形成的络合物基本上不太稳定 ,而与
溴甲酚绿形成的络合物在 30 ～ 60 m in范围内比较稳定 ,故选择溴甲酚绿作为测试用酸性染料 ,测定时
间为 40 m in。
表 1　对照品和样品与溴酚蓝络合物稳定性考查结果
Tab. 1　Exper im en t resu lts of comp lexing stab ility of contrast and sample w ith brom ophenol b lue
时间 t /m in 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
对照品 0. 192 0. 202 0. 213 0. 221 0. 229 0. 232 0. 239 0. 228 0. 219 0. 220
样品 0. 201 0. 198 0. 194 0. 184 0. 189 0. 177 0. 172 0. 183 0. 179 0. 181
表 2　对照品和样品与溴甲酚绿络合物稳定性考查结果
Tab. 2　Experim en t resu lts of com p lexing stab ility of con trast and sam ple w ith brom cresol green
时间 t /m in 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
对照品 0. 165 0. 179 0. 196 0. 184 0. 187 0. 189 0. 189 0. 207 0. 199 0. 201
样品 0. 122 0. 128 0. 103 0. 124 0. 132 0. 130 0. 136 0. 141 0. 121 0. 127
2. 3　最佳测试条件的选择
根据可能影响本实验吸光值的实验条件 ,采用正交设计实验法 ,选择水相 pH值 ,缓冲溶液用量 ,酸
性染料用量 ,氯仿用量进行条件筛选 ,以吸光度值为考察指标 ,选用正交表 L9(34),设计四因素三水平 9
个实验 。实验结果如表 3所示(测定波长为 410 nm)。
表 3　正交试验结果
Tab. 3　Resu lts of orthogona l te st
实验号 pH值(A)
/mL
缓冲溶液用量(B)
/mL
溴甲酚绿用量(C)
/m L
氯仿用量(D)
/mL
吸光度
1 1(3. 5) 1(2. 0) 1(0. 5) 1(3. 0) 0. 197
2 1(3. 5) 2(5. 0) 2(1. 0) 2(5. 0) 0. 201
3 1(3. 5) 3(7. 0) 3(2. 0) 3(7. 0) 0. 208
4 2(4. 0) 1(2. 0) 2(1. 0) 3(7. 0) 0. 227
5 2(4. 0) 2(5. 0) 3(2. 0) 1(3. 0) 0. 281
6 2(4. 0) 3(7. 0) 1(0. 5) 2(5. 0) 0. 273
7 3(5. 0) 1(2. 0) 3(2. 0) 1(3. 0) 0. 244
8 3(5. 0) 2(5. 0) 1(0. 5) 3(7. 0) 0. 288
9 3(5. 0) 3(7. 0) 2(1. 0) 2(5. 0) 0. 187
K 1 0. 606 0. 668 0. 758 0. 722
K 2 0. 781 0. 770 0. 615 0. 661
K 3 0. 719 0. 668 0. 733 0. 723
R 0. 175 0. 102 0. 143 0. 062
表 3中由极差分析可知:影响吸光度的因素作用由大到小依次为:pH值 >溴甲酚绿用量 >缓冲溶
液用量 >氯仿用量。各因素中以 A2B2C1D3为优水平 ,吸光度最大。综合考虑选择 A 2B2C1D3为最佳实
验条件 ,即:加入 pH 值为 4. 0醋酸 -醋酸钠缓冲溶液 5. 0mL, 0. 5 mL溴甲酚绿染料 , 7. 0 mL氯仿萃
取 。
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第 3期 陈志慧等:酸性染料比色法测定断肠草总生物碱的含量
表 4　样品含量测定结果
Tab. 4　Measurem ent of sam p le con ten t
编号 样品浓度
/m g m L - 1 吸光度
含量
/%
1 1. 173 0. 287 0. 515
2 1. 173 0. 293 0. 517
3 1. 173 0. 281 0. 519
表 5　回收率试验结果
Tab. 5　The resu lts of recovery te st(n=3)
样品中含量
/μg
加标量
/μg
测出总量
/μg
回收率
/%
平均回收率
/% RSD /%
0. 503 0. 513 1. 012 99. 61
0. 517 1. 026 1. 491 96. 63 99. 09 1. 79
0. 521 1. 539 2. 081 101. 02
2. 4　线性关系考查
精密称取钩吻素子对照品 0. 050 9 g,加入少量 1 mo l /LHC l溶解 ,用无水乙醇定容于 100 mL容量
瓶中 ,摇匀 ,分别精密吸取此对照品溶液 20, 40, 60, 80, 100, 120 μL置于分液漏斗中 ,挥干乙醇 ,然后按
照 2. 3中最佳实验条件操作 ,即分别加入 pH为 4. 0的醋酸 -醋酸钠缓冲溶液 5. 0 mL,加入 0. 5 mL溴
甲酚绿酸性染料溶液 ,摇匀 ,加入 7. 0 mL氯仿萃取 ,在 40 m in时终止反应 ,将氯仿层放出 ,在 410 nm处
测定吸光值 ,以对照品用量为横坐标 ,以吸光值为纵坐标 ,进行线性回归 ,得以下线性方程:Y =0. 109 5
+0. 009 X , r=0. 997 6。此结果表明当标准用量在 19. 78 ～ 59. 60 μg范围内 ,吸光度与对照品用量呈
现良好的线性关系。
2. 5　样品含量测定
分别吸取供试品液 3份 ,每份 50 μL,置于分液
漏斗中 ,挥干乙醇 ,然后分别按照 2. 3中最佳实验条
件操作 ,在 410 nm处测定吸光值 ,并依据 2. 4中线
性方程计算生物碱的含量 。结果见表 4, 3次测定平
均值为 0. 517%,RSD =1. 87%。
2. 6　加样回收率实验
精密吸取已知含量样品溶液 3份 ,每份 50 μL,置于分液漏斗中 ,分别加入浓度为 0. 513 mg /mL对
照品溶液 10, 20, 30 μL,挥干乙醇 ,然后按照 2. 3中最佳实验条件操作 ,在 410 nm处测定吸光值 ,并计
算平均回收率。结果如
表 5所示。
3　讨　论
(1)断肠草中总生
物碱含量为 0. 517%。
关于生物碱的含量测
定 , 主要有液相色谱
法 [ 6] 、双波长薄层扫描法[ 7]以及非水滴定法 [ 8]等 ,这些方法各有优缺点 。液相色谱法准确度高 ,但仪器
较昂贵 ,基层单位不易普及;双波长薄层扫描法可减少其它成分或背景干扰 ,但由于不同薄层板间差异
较大 ,所以重现性欠佳;非水滴定法具有简便快捷 、既特效又有选择等优点 ,但其滴定过程中所需标准品
量过多 ,且滴定条件苛刻 ,很难把握。本实验对酸性染料比色法进行了比较详细的研究 ,确定了最佳测
试条件 ,建立了利用酸性染料比色法测定断肠草总生物碱含量的方法。此方法快速简单 ,准确易行。
(2)本法中如果氯仿对生物碱的萃取不完全 ,会导致结果偏低 。另外 ,测定中对水相 pH值要严格
控制 ,离子对用氯仿提取后静置时间要在 20 m in以上 ,使氯仿层与水层分开 ,严防水中染料混入氯仿
层 ,而使测定结果偏高 。
(3)溴甲酚绿试液应新鲜配制。必要时 ,用氯仿洗脱染料中有色杂质 ,以免干扰测定。
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