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混合均匀试验优选飞龙掌血散剂总生物碱提取工艺



全 文 :中国药房 2012年第23卷第39期 China Pharmacy 2012Vol.23No.39
(P=0.0006<0.01)。
以黄芪甲苷为指标,采用Student T-Test分析表2中蜜炙黄
芪、盐制黄芪、醋制黄芪相同炮制条件下黄芪甲苷含量的差
异,结果蜜炙黄芪、盐制黄芪、醋制黄芪下黄芪甲苷含量未见
显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
文献记载黄芪有多种炮制方法,其中以蜜炙应用较多,而
醋炙黄芪的记载较少。本试验结果表明,盐炙黄芪水溶出物
溶出率显著高于醋炙品(P<0.01),这与文献报道的盐麸炙黄
芪中水溶出物含量最高的结果一致。黄芪具有显著的利水、
退肿功效,盐炙走肾,其利水作用增强,而盐炙后水溶出物含
量增加,且显著高于其他炮制品,这一结果对黄芪现代炮制研
究具有一定意义。
均匀设计用于提取工艺研究应用较多,近年来也用于炮
制工艺优化,但在黄芪炮制工艺优化方面应用较少。本试验
发现,加辅料倍数对总评分影响最大,而浸泡时间影响最小。
蜜炙、盐炙、醋炙黄芪最优条件分别为加蜜、盐、醋倍数1∶7、
1∶1、1∶1(均为 V/V),炒制时间13、5、5min,炒制温度70、
240、70℃,浸泡时间均为0.5h。经3批样品验证试验,优化的
工艺条件稳定、可靠。
试验中要注意因素与水平数的合理选择,若残差 n-m-
1=0(n为水平数,m为因素数),数据将无法进行多元一次回
归,从而导致试验失败,因此要在单因素试验的基础上合理建
立因素水平表。
参考文献
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(收稿日期:2011-10-06修回日期:2012-01-08)
混合均匀试验优选飞龙掌血散剂总生物碱提取工艺Δ
张振巍*,石 磊 #,白丹丹,姬志强(解放军第155中心医院,河南 开封 475003)
中图分类号 R284.2;R283.6 文献标志码 A 文章编号 1001- 408(2012)39-3681-03
DOI 10.6039/j.issn.1001- 408.2012.39.12
摘 要 目的:优选飞龙掌血散剂中总生物碱的提取工艺,并建立总生物碱含量测定方法。方法:以加水量、提取时间和提取次数
为考察因素,以总生物碱含量为评价指标,采用混合均匀试验优选提取工艺,并采用酸性染料比色法测定总生物碱含量。结果:最
佳提取工艺为加入12倍量水,提取2次,每次90min,该工艺下总生物碱含量为1.53%。结论:所选工艺和含量测定方法合理、可
行,可为飞龙掌血的进一步研究提供参考。
关键词 飞龙掌血散剂;总生物碱;酸性染料比色法;混合均匀设计
Optimization of Extraction Technology of Total Alkaloids of Toddalia asiatica Powder by Mixture Uniform Ex-
perimental Design
ZHANG Zhen-wei,SHI Lei,BAI Dan-dan,JI Zhi-qiang(No. 155Central Hospital of PLA,Henan Kaifeng 475003,
China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To optimize the extraction technology of total alkaloids from Toddalia asiatica,and to establish meth-
od for the content determination of total alkaloids. METHODS:The extraction technology of total alkaloids of T. asiatica was opti-
mized by mixture uniform experimental design with amount of added water,extraction time and extraction times as factors using
the content of total alkaloid as index. The content of total alkaloid was determined by acid dye colorimetry. RESULTS:The opti-
mized extracting process was as follows:12times of water,extracting for 2times and extracting for 90min per time. The content
of total alkaloid was 1.53%. CONCLUSION:The optimized technology and determination method are reasonable and feasible,and
it can provide reference for the further study of T. asiatica.
KEY WORDS Toddalia asiatica powder;Total alkaloid;Acid dye colorimetry;Mixed uniform experimental design
Δ 济南军区后勤科研计划项目(CJN10L067)
*药师。研究方向:中药新药及质量标准。E-mail:zhenwei_
981@163.com
# 通讯作者:主任药师。研究方向:中药制剂与医院药学。电话:
0378-3958759。E-mail:155sl@163.com
􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛􀤛
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China Pharmacy 2012Vol.23No.39 中国药房 2012年第23卷第39期
飞龙掌血,别名见血飞、大救驾、郎昌等,为芸香科植物飞
龙掌血Toddlia asiatica(L.)Lam.的干燥根或根皮,具有舒筋通
络、活血散瘀、消肿止痛的作用,常用于治疗风湿痹痛、胃痛、
痛经、跌打损伤等[1]。在飞龙掌血药材分离得到的化合物中生
物碱占54.5%[2],并且药理学实验证明,总生物碱作为一个有
效部位群,具有明显的镇痛、抗炎、止血活性[3],因此本文在此
基础上首次采用混合均匀试验设计对总生物碱进行提取,优
选其提取物制成散剂的工艺,为其制剂的深入研究打下基
础。
1 仪器与试药
UV-2401PC 紫外 -可见分光光度计(日本岛津公司);
DZTW调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);AS10200ADT
超声波清洗器(广州北锐精密仪器有限公司);AB135-S双量程
电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
飞龙掌血于2007年8月采集于贵州都匀地区,由黔南州
民族师范学院郭志友副教授鉴定为真品,标本存放于河南大
学中药研究所。白屈菜红碱对照品(中国食品药品检定研究院,
批号:111718-200501);甲醇(色谱纯,美国J.T.Baker公司,批号:
9093-68);水为自制反渗透超纯水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 总生物碱含量测定
通过查阅相关文献[4],笔者选取了飞龙掌血总生物碱中化
学结构相近,便于定量分析的白屈菜红碱成分作为分析指标,
并以白屈菜红碱含量作为总生物碱含量。
2.1.1 供试品溶液的制备 精密吸取2.00mL提取溶液,置于
分液漏斗中,加入 pH4.1的缓冲溶液15mL和2mL溴麝香草
酚蓝显色剂,量取氯仿10mL至分液漏斗中,剧烈振摇2min,
静置10min,待完全分层后,分取下层,反复用氯仿萃取3次,
每次10mL,合并氯仿液于50mL 量瓶中,加入氯仿定容、摇
匀,即得供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥后的
白屈菜红碱对照品1.5mg,置于50mL 量瓶中,甲醇溶解、定
容,再精密吸取此溶液2.00mL于蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加
pH 4.1的缓冲溶液15mL 和2mL 溴麝香草酚蓝显色剂,照
“2.1.1”项下方法制备对照品溶液。
2.1.3 空白溶液的制备 精密吸取2.00mL超纯水,按“2.1.1”
项下方法制得空白溶液。
2.1.4 测定波长的选择 取供试品、对照品和空白溶液适
量,分别在200~400nm波长范围内扫描。结果,供试品和对
照品溶液均在243nm波长处有最大吸收,故选择此波长为检
测波长。紫外吸收光谱见图1。
2.2 混合均匀试验优选提取工艺
2.2.1 试验设计 结合飞龙掌血生物碱化学性质和大生产实
际需求,选择对提取工艺影响较大的加水量(X1)、提取时间
(X2)和提取次数(X3)作为考察因素,采用U12(12×6×3)混合均
匀试验设计表进行设计[5]。因素水平见表1。
2.2.2 试验结果 采用DPS7.05数据处理系统对试验数据点
的分布进行优化,以降低数据点的相关性和中心化偏差(CD),
增加数据拟合的准确度。采用优化后的数据点序列,安排提
取试验,每次提取药材50g,提取后合并溶液,按“2.1”项下方
法测定总生物碱含量,并计算观测值(Y)、预测值(Ye)和拟合
误差(ei,Y=(实际测得总生物碱含量/饮片中总生物碱含量)×
100%;Ye为模型方程拟合结果;ei=Y-Ye),以此为评价指标
优选工艺。混合均匀试验结果见表2。
表2 混合均匀试验结果
Tab 2 Results of mixed uniform experimental design
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
X1
1
10
5
11
6
3
9
12
7
4
8
2
X2
5
1
6
3
2
1
4
5
2
4
6
3
X3
2
3
1
1
2
1
1
2
2
3
3
3
总生物碱含量
Y/%
0.640 6
0.923 6
0.160 6
1.099 9
1.487 6
1.039 1
0.504 5
1.048 6
1.352 9
0.918 7
1.461 2
1.274 4
Ye/%
0.630 8
0.916 0
0.174 1
1.104 2
1.414 0
1.046 7
0.479 1
1.058 4
1.426 5
0.944 1
1.447 7
1.270 1
ei
0.009 8
0.007 6
-0.013 5
-0.004 3
0.073 6
-0.007 6
0.025 4
-0.009 8
-0.073 6
-0.025 4
0.013 5
0.004 3
采用 STATISTICA8.0数据处理系统对试验数据进行分
析,并采用二次多项式逐步回归的方法对试验模型进行拟
合 [6],其拟合方程如下:Y=-1.0963+0.5013X1-1.8402X2+
3.3673X3-0.0060X120.1991X22-0.5459X32+0.008X1X2-
0.2140X1X3+0.128X2X3(r=0.9963,F0.05(9,2)=30.1515,P=
0.0325,S=0.0801)。将各因素与指标进行标准化处理后作
三维效应面图(图2)和二维三角能级图(图3),发现各因素对
提取工艺均有显著性影响,结合实际大生产,确定最佳提取工
艺为加入12倍量水,提取2次,每次90min。
2.3 工艺验证试验
200 250 300 350 400nm
A
B
图1 紫外吸收光谱图
A.对照品;B.供试品
Fig 1 UV absorption spetrum
A. substance control;B. test sample
Abs
0.01
0.60
0.40
0.20
表1 因素水平
Tab 1 Factors and levels
因素
X1/倍
X2/min
X3/次
水平
1
5
30
1
2
6
60
2
3
7
90
3
4
8
120
5
9
150
6
10
180
7
11
8
12
9
13
10
14
11
15
12
16
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中国药房 2012年第23卷第39期 China Pharmacy 2012Vol.23No.39
分别称取药材3份,每份50g,按上述优选的工艺进行提
取,并测定总生物碱含量。结果,平均总生物碱含量为1.53%,
高于均匀试验中最高值,表明所选工艺合理、可行。
3 讨论
飞龙掌血散剂在前期研究中分为2部分,一部分散剂即直
接将药材进行粉碎,制成散剂形式;另一部分即是采用本文中
所描述的提取工艺,将其提取物进行适当粉碎,制成速效散
剂。从其化学成分上来说,生物碱类成分和三萜类化合物水
溶性较好,在制成药材散剂时,有利于其速效止血作用的体
现;另外,通过前期的有效部位药效学研究证实,飞龙掌血中
的香豆素类成分有止血活性,虽然生物碱类成分用酸水提取
效果较好,但因考虑到2大类成分的提取效果,故而考虑采用
水提的方法,最大程度的将其水溶性成分提取出来,再进行适
当处理将其制成提取物散剂。而其提取物散剂的止血效果与
药材散剂的止血效果对比将在下一步的实验中深入分析。
从图2、图3可看出,虽然各因素对主效应都存在显著性影
响,当提取次数为2的时候,拟合模型存在最大值,而在提取1
次或者3次时出现了谷值,这可以看出飞龙掌血的总生物碱中
含有热稳定性较差的成分,导致了长时间连续的加热总生物
碱的含量降低;对加水量而言,从三角能级图中所反映的情况
来看,加水量在标准化值为0.6~0.75时存在极值。
在采用氯仿进行萃取时一定要注意,先是轻轻向一个方
向振摇,然后再剧烈振摇,酸性染料比色法有时测定的含量值
低于非水滴定法[7],可能是因为形成离子对时氯仿的萃取不完
全导致,试验证明萃取3次已可以萃取完全。在萃取后放置
时,要等到两相液面清晰时再进行分液处理,因为在剧烈振摇
时可能产生中间乳化层,故而稍等待一段时间才可以分离萃
取。
笔者曾分别考察了溴酚蓝、溴麝香草酚蓝2种染料溶液作
显色剂,结果溴麝香草酚蓝扣除空白后吸光度较大,故选择溴
麝香草酚蓝作为显色剂。笔者曾分别考察了加入5、10、15、
20、25mL的缓冲液对试验的影响,结果当缓冲液加入体积为
25mL时,吸光度最大,从溶液吸光度变化趋势上来看,当缓冲
液加到15mL时,溶液吸光度趋于平缓,考虑到溶液加入量的
关系,选择缓冲液加入15mL为最佳体积。笔者也考察了 pH
值分别为3.2、3.5、3.7、3.9、4.1、4.3、4.5、4.7、4.9、5.1、5.3、5.5、5.7
的缓冲溶液对试验的影响,结果当加入 pH为4.1的缓冲溶液
时,测试液的吸光度最大,故选择pH为4.1的缓冲溶液。
参考文献
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(收稿日期:2012-06-12修回日期:2012-09-03)
10
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
-160
-180
-200
-220
0.23
0.50
0.75
0.25
0.50
0.75
0.15 0.20
0.25
提取次数/次
图2 三维效应面图
Fig 2 Three-dimensional response surface map
含量
/%
1
2
3
加水
量/倍
提取时
间/m
in
0.00 0.00
提取次数/次
0.25 0.75
0.500.50
0.75 0.25
1.000.00 0.25 0.50 0.75 1.00
提取时间/min
图3 二维三角能级图
Fig 3 Two- dimensional triangle energy level map
加水量/倍
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