全 文 ：第 32 卷 第 5期
19 93 年 9 月
厦门大学学报 〔自 .然科学版 )
Jo
u r n歌 1 o f X la m o n U n i v e r s i ty ( N a t。 , a l S e i e n e e )
V 。 二. 3 2
头 .P 涤。
蓖麻蚕蛹 m t D N A 的限制性内切酶图谱 健’
凌建华 陈元 霖
(细胞生物学研究室 )
摘要 采用喊变性法制 备蓖麻 蚕蛹 mt D N A ,经九种限制性内切酶单酶和双酶酶解后 ,琼
脂糖凝胶电泳检测酶切位点数和酶切片段长度 . 根据片段的大小确定消失片段 与新生片段关系 ,
通过对片段重叠 、 拼接 、 判断各片段邻近位置 ,从而构建了 9 种限制性内切酶 、共 2 4 个酶切位点蓖
麻蚕蛹 。 tD N A 酶切图谱 .
关键词 蓖麻蚕 , mt D N A , 限制性 内切酶图谱 . 蛹
动物线粒性 D N A 〔m t D N A )是闭环双链结构 、分子量范围 15~ 19 kb , 处于限制性内切酶
最理想的分析范围之内 , 它还具有分子结构简单 、 母系遗传 、 进化速度快 、 易提取和纯化等特
点 、因而一般认为是分子遗传学 、 分子进化生物学及群体遗传学研究的理想对象 . 动物m t D N A
的基因组织和功能在进化上具有保守的一面 、 但一级结构存在着快速歧异 ( di v er g e n c e ) ’` 」 . 这
种现象不仅存在于不同物种之间 , 而且也存在同一物种的不同群体之间 . 因此 ,根据 。 t O N A
歧异程度能鉴别物种的亲缘关系 ,
蚕是具有重要经济价值的绢丝昆虫 ,也是传统的遗传学研究材料 . 但是 ,有关蚕 m t DN A
研究尚开展不多 . 曹阳“ 了观察了家蚕 m t D N A 的超微结构 , 陈智毅 ! “ 初步构建了二化性类型家
蚕 m t D N A 酶切图谱 , 而非桑蚕 m t D N A 的研究未见报道 .
1 材料和方法
蓖麻蚕四个品种 : 斑马 、 素白 、 桂虎斑和 A T Y一 2 . A T Y 一 2 是由家蚕 D N A 直接导人蓖麻蚕
后选育出来的变异品系 {名〕 . 材料均由广东农科院蚕业研究所提供 .
m t D N A 制 备 : 主要参照 K o i e h i r o T a m u r a 碱变性法 { 5」. 取羽化前的蚕蛹 、 置 SE ( 0 . 2 5
m o l / L S u g a r
一
20 m m o l / L T r i s一 m m o l / L N a : ED T A 一 2 . 5 m m o l / L C a C I: p H 7 . 5 )中剪碎 、 过滤 、
匀浆 , 经差速离心制备线粒体 . 然后 , 加适量的 S T E ( 10 m nt o l / L T ir s 一 I m 。 。 州I J N a Z E D T A -
1 0 m nr o l / L N a C I p H 7
.
5 )溶解线粒体 . 再加 2 倍体积 N S ( 0 . 18 m o l / L N a O H 和 l肠 S D S ) ,冰
浴 I Om in , 变性 . 随后加入 1 . 5 倍体积 5 m d / L K A C 冰浴 l h 以上复性 . 以 12 0。。 x g 离心 功
m in
、 上清液加等体积苯酚一氧仿抽提数次 . 水相层加入 2 倍体积无水乙醇于一 20 ℃过液 . 以
1 5 0 0 0 又 g 离心后沉淀溶于 S T E 中 , 加不含 D N A 的纯 R N a s e 至终浓度 25 0 卜g / m 〔, 3 7 亡处理
l h 再加等体积苯酚 一抓仿抽提 ,水相层加入 3 m ol / L N a A 。 至终浓度 0 . 1 m ol / L ,再加 0 . 6 体
积异丙醉 , 于 4 ℃放置 ` h . 离心后用 70 % 乙醇洗涤两次 ,抽干 ,最终溶解在适量的 T E ( 10
m m
o l / L T
r
i
s
一
1 m m o l / I
时
N a
Z
E D T A p H S
.
o )中 经检测所提 m t D N A 已达限制酶要求纯度 .
限制性内切酶 : 所用 9 种限制酶分别是 B a fn H I 、 B g l l 、 E e o R V 、 E e o R I 、 H a e : 、 H i n d , 、
本文 1 9 92 一 1 1一。 5 收到 , 本实验工作在中科院昆明动物研究所细胞与分子进化开放室完成
厦门大学学报 (白然科学版 ) 1 9 9 3年
P , t l
、
S o c l 和 X b a l , 由华美生物公司生产 .
脑解条件 : “ : 单酶完全消化的反应总体积 20 川 , 含 m t D N A 0 . 3~ 0 . 5 户g ,酶 1~ 5 个单位 、
3 z C 处理 2一 3 h , 双酶完全消化总体积为 3 0 拼l , 含 m r D N A O . 5一 1 . 0 拜9 . 3 7 ℃处理 5一 6 h .
凝胶 电泳 : 配制 1 . 0 %琼脂糖凝胶 , 电泳缓 冲液为 貂 m m ol / L 硼酸 , 2 . 5 m m ol / L N a :
E D T A
,
8 9 rn m o { / I
护
T r ; s p } 18
.
0
,电压 Z V / e m , 室温下电泳 14 h 后 ,紫外检测仪上拍照 .
2 结 果
2
·
1 m lt ) N A 单酶酶解片段长度测定
制备的 m t D N A 用 9 种限 制酶单酶完 全酶解后 , 经 l %琼脂糖凝胶电泳 、 得到 电泳图
(图 1) . 以标准的 人 D N A 的 H in d . 或 iH nd . 十 E co R I 酶解片段作为分子量标准 , 根据各片段
的迁移率与其分子量的对数成反 比的关系绘制标准曲线 , 测定各酶切片段的分子量 . 片段大小
见表 1 .
表 l 蓖麻蚕蛹 。 t D N A 单酶完全酶解片段大小
T a b
,
1 S i
z e o f
r e s t r i e t i o n f r a g m
e n t s o f s i n g l e di s
e s t o f m t D N A f
r o m t he p u p a s o f e
r i s j l k w o r m
s
片段 Ba m HI B g l 1 E e o R 玉 E c o R V H a e I H毛。 d 皿 P、 t 1 S a o I X七a l
A 1 4
.
9 7 7
.
4 6 1 4
.
9 6 5 8 2 6
.
3 1 15
.
10 5 19 5 0 1
7 46 49 3
.
8 8
9 1 1
,
9 5
4
.
17
3
,
0 2
Où4110
68 1 6 5
l
,
3 2
1
.
9 1
0
.
6 0
l
,
5 9
1 3 1
没酶有点切
合计 1 4 . 9了 l 基. 92 14 9 6 14 . 90 15 . 1 1 1 5 . 1 0 14 . 9 3 1 5 . 1 0
在 图 l 中 , 蓖麻蚕 m t D N A (斑马 、 桂虎斑 、 素 白 ) 经 s a 。 一 、 X b a 一 、 H a e . 、 H in d . 、
E eo R v
、
E co R I 酶切带型一致 , A T Y 一 2 的酶解带型表现与以上之品种一致 . B a m H I 在 。 t D -
N A 上没有切点 、 B g 1 1 、 E e o R V 和 P s t l 在 m t D N A 上仅有一个切点 , X b a l 、 S a 。 I 和 H i n d ,
各有五个切点 , E co R I 和 H ae l 分别有两个和四个切点 .
2
.
2 m tD N A 双酶解片段长度测定
双酶解 m , D N A 并测定各片段的大小是建立蓖麻蚕 m t D N A 酶切图谱的必要 手段 . 依酶
切国 i普构建的需要 、 我们对 B g 1 1 、 p s t l 、 E e o R v 、 E e o R I 、 H i n d . 、 H a e 一 、 x b a l 和 s a c l 分
别进行了两两酶切 . 双酶切电泳图谱见图 2 . 两两双酶切片段大小及相互关系 , 见表 .2
.2 3 m tD N A 酶切图谱构建
采用双酶法构建酶切图谱 } 7 ’ , 九种酶单酶完全酶解 , 分别两两酶解 , 求得各片段大小 , 从而
确定消失片段与新生片段关系 ,再进行片段间重叠 、 拼接 , 判断各酶解片段的相对位置 :
1 ) B a m H I 在 m t D N A 上没有酶切位点 , E co R V 仅一个切点 ,选择它的酶切位点为零点 、 以
确定其它酶的酶切位点 .
2 ) B g l l
、
P时 I 酶切位点定位 : B g l l 、 sP t 工分别单酶解时 ,仅有一个酶解位点 ,分别与
E o o R V 双酶切时 . B g l l 与 E o o RV 双酶解产生两个片段 ,大小分别是 g 飞k b 和 5 . g k b , 而 P s t l
与 E co R V 双酶产尘两个片段 , 是 9 . gk b 和 5 . kI b . 另外 , B g l l 与 P st l 双酶解也产生两个片
第 5 期 凌建华等 :蓖麻蚕蛹 m t D NA的限制性内切酶图潜
段 1 1 .ok b和 4ok b .由此 , 根据 B g l l 、 p s t l 和 E e o R V 两两酶解片段关系 、 可以确定 P s t l
的酶切位点距零点 9 . 9 k b 、 而 B g l l 酶切点距零点 5 , 9 k .b
3 )E co R 王酶切位点定位 : E co R I 单酶解产生两个片段 , 而与 E co R V 双酶解时 , 一个片段
切成 5 . 3 k b 和 2 . 2 k b ,而 Eco R I 与 B gl l 双酶解时 ,其中一个酶切片段被切成 3 . 8 k b 和 3 . 7
k b 两个片段 , 根据已确定的 E co R v 、 B g l l 酶切位点 ,可以推断 E co R I 的两酶切位点分别在
2
.
2 k b 和 9 . 7 k b 处 ,再进一步利用 E e o R I 与 P s t l 进行双酶切结果 , E e o R I 与 P s t l 进行双酶
切时 ,其中一个片段被切成 7 . 3 k b 和 0 . kZ b 两个片段 ,进一步证实了上述结果 .
按照上述方法 ,同理可以推断 H i n d . 、 H a e . 、 X b a l 、 和 S ac l 的酶切位点分布 ,得到蓖麻
蚕蛹 m t D N A 酶切图谱 (图 3) .
表 2 蓖麻蚕蛹 m tD N A 双醉解片段大小及其相互关系
T a b
.
2 5 1沈 a n d r e l a t i o n s h ip o f r e s t r i e t i o n f r a g m e n t s o f d o u b l e s d ig e s t s o f m t D N A f r o m
t h e p u p a
s o f e
r i s i lk w o
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E e o R 1 x B g l 1 X E e o R v X P
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6
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.
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64 4
· 厦门大学学报 (白然科学版 ) 1 99 3年
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3 讨 论
蓖麻蚕原产于印度 , 19 52 年两次引人我国进行驯养繁殖 ,成为我国夭然丝生产的主要蚕
种之一 我国现有的蓖麻蚕品种都是 50 年代以来通过杂交选育成功的 . 本试验中采用的斑马 ,
桂虎斑和素白三个品种 ,育成的时间短 ,亲缘相近 ,因此 . 它们在 m tD N A 一级结构上表现出高
度 一致性 ,是在预料之中 . 从 已报道或我们自己的试验 (另发表 )结果表明 ,家蚕与蓖麻蚕
m t D N A 的酶切图谱差异极为显著 , 而由家蚕 D N A 直接导入的蓖麻蚕的变异个体中选育出来
的新 品系 A T Y 一 2 . 虽然在表型性状上与受体明显不同 ,经过 80 个世代繁育后 , 变异性状代代
相传稳定不变 ,但在 m山 N A 图谱仍与受体相一致 ,这表明 ,由外源 D N A 引起的性变异 ,并没
有反映在其 m t DN A 的一级结构上 ,这一点我们在导人蓖麻蚕 D N A 的家蚕新品系 ,进行 m t D -
N A 酶切图谱的测定结果得到了证实 .
本实验工作 在中科院昆明动物所细胞与分子进化开放实验室完成 , 并承蒙施主明研究员的亲切指导 , 得
到兰宏 、 王文等同志大力协作 . 广东农科院蚕业研究所提供了全部实验材料 谨此 , 表示诚挚的谢意 ,
第 S期 凌建华等 : 蓖麻蚕蛹 m, D N A 的限制性内切酶图谱 6 4 5
参 考 文 献
B
r o w W M
犷 t a l
,
R 么p l d e v o le t io n 、o f a n i n l a l
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陈元霖等 . s t o d y 。 。 h。 : ed 丢t a r y v a : i a : i o n , i。 、
d u ie d b y 3 i l k w o
r m D N A S C T E N IT
A
S I N I C A ( S
e r又e s B ) , 1 98 2 , 2 5 ( 2 ) : 1 4 1~ 1 5 1
K o `e h ir o T a m u r a e t a l . R a P id 主5 0 1己: 云o n
m 吧 t h o d o f a n i m a l m i t o e h o dn
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l; n 七 l y s i , p r o e 心d u r e ` 刀。优人。州介a l g e ” et i ` -
,
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a( )线形图谱 . ( b) 环形图谱
F ig
,
3 R e s t r ie t i o n m a p o f m t D N A f
r o m t he
Pu Pa s o f e r i s i lkwo
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)L i n e a
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fo r m (b ) C i
r e u la
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法. 生物化学与生物物理进展 , 1 , 85 , 2 1 ( 5 ) : 6 6~ 7 0
R e s t r i e t i o n E n d o u e le a s e C l e a v a g e M a P s o f
M t D N A f r o m t h e P u P a s o f E r i S i lk w o r m s
I
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i n g J i a n h u a C h e n Y u a n l i n
(八 st . of eC l B ot l . )
A b s t r a e t M i
t o o h o n d r ia 一D N A (m t D N A ) f o r m t h e p u p a s o f E r i s i l kw o r m , w a s
p r e p a r e d b y t h e a lk a li n e ly s i s p r o e e d u r e
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e n t s w o r e e h e e k o d b y a g a r o s e g e l e le e t r o p h o r e s i o
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K e y w o r d s E
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6屯 6厦叮 }、 学学报 (自然 科学 版 , ! 99 3 年
凡」工 蓖麻蚕 (斑马 、 住虎斑和求自 》蛹 。 七D \ A 单酶完全酶切琼脂花电泳黑
凝胶浓度 。 . 7环 ( l ) a 一。 aS 己 消化 (斑马、 佳虎斑和家白 ) ; d一 f X ba l 消化 (斑马 、桂虎斑和 素白 ) ,宫一 i
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图 2 蓖麻蚕蛹 m t n N A 双酶完全酶切琼脂糖电泳图
凝胶浓度 一 。 % ( z )。 . 它。 o R v 二 飞飞g一 消化 ; b . E e 、 ) R V + P s : I 消化 ; 。 . E e o R I + H a e l 消化 ; d .
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、 o R I 牛 E e o R v 消化 . e , E c o 奴 f + p s门 消化 汀 E e o R [ + B g l l 消化 ; ( : ) a , EC O R I + p s t l 消
化 ; b . x b 。 一 + H i n d 一消化 ; c . x 卜。 I 十仁c o R v 消化 ; d . x b 。 I 十 E e o R I 消化 , e . H in d , 十 S a c l 消
化 ; f . 二工〔n d , 十 p 、 t l 护肖化 ; 9 . X l a l + B只一 x 消化 , 11 , H i n d l 斗 B : 1 1 消化
( 3 ) b
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d , 十 P 、 : I 护肖化 ; c . s 。 。 I 一 B ` 1 1 消化 ; d . Hi o d 互 ` E r o R v 消化 ; e . s a。 I + x ba i 消化 ,
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化 ; 。 , E e o R I十 H l n d l + 消化 ; d , E e o R 一+ x ba l 消化 ; 。 ` H i n d 一 + aH e 一消化 , f . H a e 一 + x b。 一消
化 . 9 H a e l + S合 e l 消化
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2 A g a r o 、 e g e l o l o e r : o p 卜o r 七 t l o p a t t o z n s o f d o 。 } , 1七 日i g o s t 。 。 f m 1 D N A f r o m p a p a s o f e r i s i】k w o r印 s