全 文 ：见的自身免疫性疾病 ,以慢性 、对称性滑膜关节炎和
关节外病变(皮下结节 、心包炎 、胸膜炎 、肺炎 、周围神
经炎等)为主要临床表现 。RA 在中国的发病率约为
0.32%～ 0.4%,其发病原因和发病机制至今仍未完
全阐明。当前治疗的主要目标是缓解痛苦 ,减轻和控
制炎症 ,保护肌肉和关节功能 ,治疗和预防严重并发
症 ,包括非甾体类抗炎药 、糖皮质激素 、病情改善药
等。这些疗法易使患者免疫系统受到普遍性抑制而
导致严重感染 ,而且也不能有效的防止疾病复发 。口
服引起 RA的自身抗原如鸡Ⅱ型胶原 ,诱导机体重新
获得对自身抗原的耐受 ,有可能是治疗 RA的一条方
便 、有效而且较为特异 、安全的途径。
在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、Ⅰ型糖
尿病或实验性关节炎的动物实验中 ,我们发现给实
验动物口服相应的抗原如髓鞘碱性蛋白(MBP)、胰
岛素或 Ⅱ型胶原可预防或减轻动物发生相应的病
变[ 1] 。在我们的研究中 ,佐剂型关节炎大鼠经胃管
给予鸡Ⅱ型胶原后 ,关节病变得到明显改善 ,其中以
高剂量治疗组的作用最显著 ,与关节病变的发生发
展关系密切的炎性细胞因子 TNFα的水平也较模型
对照组显著下降 ,接近正常组水平 ,说明口服高剂量
Ⅱ型胶原可有效抑制机体对自身抗原的病理性免疫
应答 。另外 ,与模型对照组比较 ,高剂量治疗组的
CD3
+
T 细胞 、CD4+T 细胞 、CD8+T 细胞均有显著性
变化 , CD4+T 细胞显著下降 , CD8+ T 细胞显著升
高。过去的研究发现 ,RA患者关节滑膜组织中有大
量炎症细胞(T细胞浸润),其中 CD4∶CD8约为 10 ～
15∶1 ,而在 RA 的治疗过程中采用抗 CD4抗体治疗
有明显的效果。有学者认为 ,在关节炎的发病过程
中 CD4+T细胞起致病作用而 CD8+T 细胞具有保护
作用 。近年来的一系列研究表明 ,CD8+T 细胞在自
身免疫病的发病中具有致病性的一面[ 2 ,3] 。由于
CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞由具有不同功能的亚群
组成 ,因此 ,口服Ⅱ型胶原后 T细胞亚群发生变化的
意义有待进一步研究。口服抗原的剂量是影响口服
耐受产生的重要因素 ,普遍认为高剂量抗原诱导自
身反应性淋巴细胞克隆清除(clonal deletion)或克隆
无能(clonal anergy),低剂量抗原诱导主动抑制(ac-
tive suppression),但其口服耐受具有更大的应用价
值 。在我们的研究中 ,低 、中剂量组的疗效不如高剂
量治疗组 ,可能由于我们所用的 Ⅱ型胶原剂量较文
献报道的剂量偏低 ,我们的高剂量治疗组用药两周
的累计剂量(每只 0.3 mg)低于 Friedman等[ 4]报道的
低剂量治疗组的用药剂量(每只 1 mg)。因此 ,不能
有效地诱导口服耐受。
参考文献
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收稿日期:2003-05
基金项目:全军医药卫生科研基金课题资助项目(编号:2000B01)
＊通讯联系人(Correspondent),男 ,教授 ,主任医师 ,博导 ,从事中医药抗肝纤维化研究。Tel:020-61648241
作者简介:赵进军(1978-),男 ,河南偃师 ,硕士 ,医师 ,从事中医药抗肝纤维化的研究。
白背叶根对过氧化氢所致大鼠肝细胞损伤的保护作用
赵进军 ,吕志平＊ ,张绪富
第一军医大学中医系 ,广东 广州 510515
摘要:目的　探讨中药白背叶根对过氧化氢(H2O2)所致大鼠肝细胞损伤的影响。方法　用终浓度为 2 mmol·L-1的 H2O2 对大
鼠肝细胞进行损伤 ,收集肝细胞悬液 , 测定丙氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)的含
量。结果　白背叶根作用肝细胞后 ,能显著降低 H2O2 引起的NO和 MDA水平的升高 , 并提高 SOD活性 , 显著降低肝细胞悬液
中ALT 的浓度。结论　白背叶根对 H2O2所致的大鼠肝细胞氧化损伤有保护作用。
关键词:白背叶根;肝细胞;过氧化氢;抗氧化作用
中图分类号:R965 文献标识码:A 文章编号:1006-0103(2003)04-0257-03
华西药学杂志
W C J · P S 　2003 , 18(4):257～ 259　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
DOI :10.13375/j.cnki.wcjps.2003.04.007
Protective effects of the root of Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg.on rat hepatocytes injury
induced by hydrogen peroxide in vitro
ZHAO Jin-jun , LU··　 Zhi-ping＊ , ZHANG Xu-fu
Department of Traditional Chinese Medicine , the First Military Medical University , Guangzhou 510515 , China
Abstract:OBJECTIVE　To investigate the effects of the root of Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg.on rat hepatocytes injury induced by
hydrogen peroxide(H2O2).METHODS　Rat hepatocytes were prepared.H2O2 was added into the suspension till the final concentration was
2 mmol·L-1.SOD activity , NO and MDA contents , ALT level were detected.RESULTS　The contents of NO and MDA were significantly
decreased.The activity of SOD was increased.The elevated ALT level in the suspension induced by H2O2 was reduced.CONCLUSION　
The root of Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg could protect hepatocytes from oxidative injury induced by H2O2.
Key words:Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg;Hepatocyte;Hydrogen peroxide;Antioxidative effect
CLC number:R965 Document code:A Article ID:1006-0103(2003)04-0257-03
　　白背叶(Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg)是
南方地区的常见草药 ,味微苦 、涩 ,性平 ,具清热解
毒 、收涩消淤的作用 ,民间常用鲜根水煎服治疗急慢
性肝炎。动物实验证实白背叶根具有较好的抗肝纤
维化和抗肝炎作用[ 1] ,但机理尚不清楚。现采用过
氧化氢所致的大鼠肝细胞损伤模型 ,观察中药白背
叶根对肝细胞的作用 ,探讨其抗氧化损伤的机制。
1　材料与方法
1.1　动物 、药品与试剂
　　Wistar大鼠 , ♂,制备药物血清所用大鼠体重为
210±10 g ,8 ～ 10周龄;而取原代肝细胞所用大鼠体
重为 120 g , 1月龄(第一军医大学实验动物中心)。
白背叶根制剂(自制 ,制备出大鼠的相应剂量及 2倍
剂量)。丙氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧
化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)试剂盒(南京建
成生物工程公司 , 批号:010106 、011010 、011019 、
011019);阳性药对照维生素 E(Vit E ,Sigma公司)用
少量二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,配成 250 μg·ml-1溶
液 ,加入到肝细胞悬液后其终浓度为50 μg·ml-1。
1.2　药物血清的制备
　　Wistar大鼠 12只 ,随机分正常血清对照组 、中
药低剂量组和高剂量组 。后两组每日灌药 1次 ,每
次2 ml ,连续 7 d ,正常血清对照组给予相应剂量的
生理盐水 。最后一次灌药(灌药前禁食不禁水 12 h)
1 h后 ,3%戊巴比妥钠(1.5ml·kg-1)腹腔麻醉 ,腹主
动脉采血 , 3000r·min-1离心分离血清 20min , 56℃,
30min水浴灭活 ,0.45μ微孔滤膜过滤 ,冷冻保存 。
1.3　实验方法
1.3.1　肝细胞的分离 　采用 Seglen的改良原位二
步胶原酶灌注法[ 2] 。用 3%戊巴比妥钠(1.5 ml·
kg-1)腹腔注射麻醉大鼠 ,经舌静脉注射 1000 U·
ml-1肝素 1 ml ,酒精浸泡消毒 ,在超净台上打开腹
腔 ,门静脉插管 ,连接上蠕动泵 ,原位灌注 D-Hanks
液 ,剪开下腔静脉 ,灌注约 10 min ,待肝脏变为土黄
色时 ,停止灌注。小心分离肝脏 , 置平皿中 , 灌注
0.25%Ⅳ型胶原酶 10 min ,钝性撕碎肝脏 ,移入 250
ml锥形瓶中 ,再加入 10 ml胶原酶摇晃消化肝组织
20 min ,加入20 ml Hanks液终止消化 ,100目筛网过
滤 。滤液中加 50 ml DMEM ,置 37℃水浴箱中摇晃
15 min ,再冰水浴 10 min。200 目筛网过滤 ,滤液经
200 r·min-1离心 5min ,弃上清 ,Hanks液30ml悬浮 ,
重复 3次。最后用 Hanks 液重新悬浮后 ,调节细胞
数为 5×105 cells·ml-1。实验经台盼兰染色后计数 ,
活细胞数>95%。
1.3.2　分组　分为空白对照组 、模型组 、正常血清
对照组 、Vit E对照组 、中药低剂量组和高剂量组。
将上述肝细胞悬液加入无菌玻璃试管中 ,每管 1.5
ml ,每组设 3个复管。加入药物后置 37℃恒温水浴
箱中孵育 1 h , 然后加入 H2O2 ,终浓度为 2 mmol·
L
-1 ,空白对照管加等量的生理盐水。继续孵育 30
min后 ,取各管细胞悬液测以下指标:ALT 活力 、NO
和MDA含量 、SOD活性。
1.4　统计方法
　　各项指标用 x ±s表示 ,用统计软件 SPSS 10.0
进行单因素变量方差分析和 LSD 两两比较 , P <
0.05认为差异有显著性 。
2　结果
2.1　药物对 ALT水平的影响
　　模型组ALT 水平明显升高 ,与空白对照组相比
258　　　 华 西 药 学 杂 志 第 18卷
有显著性差异(P<0.01)。中药组ALT水平明显下
降 ,与模型组和正常血清对照组相比均有显著性差
异(P<0.01),高剂量组降低 ALT 水平更为明显 。
中药与Vit E组相比 ,无显著性差异(表 1)。
2.2　药物对 NO的影响
　　H2O2的作用使肝细胞悬液中 NO含量较空白对
照组明显升高(P <0.01)。中药组可使肝细胞悬液
中的NO量明显降低 ,与模型组和正常血清对照组
相比均有显著性差异 ,与空白对照组相比也有显著
性差异 。高剂量组在降低 NO 含量上效果反不如低
剂量组好 ,与Vit E相比有显著性差异(表 1)。
表 1　白背叶根对血清中ALT和 NO水平的影响
Table 1　Effects of the root of Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg.
on ALT level and NO contents
Groups ALT level/u·L-1 NO content/μmol·L-1
Normal contro l 62.77±2.55#○ 3.71±1.50★#○
H2O2model 157.19±31.28★ #★ 29.29±2.48★#★
Normal serum control 102.13±20.38★ ★○ 23.50±0.74★
Vitamin E 51.96±4.00○# 8.83±0.65#
Treatment low dose 55.42±20.94○# 7.84±0.89#○★
Treatment high dose 45.68±0.21○# 14.10±1.96★#○★
Comparedwith normal control group:★P<0.05;comparedwith H2O2model
group:○P<0.05;compared with normal serum control group:#P<0.05;
compared with Vit E group:★P<0.05
2.3　药物对MDA和 SOD的影响
　　与空白对照组相比 ,H2O2 模型组肝细胞悬液中
SOD活性明显降低 ,MDA含量明显升高 。中药组可
升高细胞悬液中 SOD活性 ,降低MDA 的含量 ,与模
型组相比均有显著性差异(P <0.01)。中药在升高
SOD活性方面比 Vit E效果好(表 2)
表 2　白背叶根对血清中 SOD活性和 MDA 水平的影响
Table 2　Effects of the root of Mallotus apelta(Lour.)Muell.-Arg.
on SOD activity and MDA contents
Groups SOD activity/NU·ml-1 MDA content/nmol·ml-1
Normal contro l 42.13±0.41★○ 1.85±0.17○#
H2O2model 33.26±0.99★#★ 3.74±0.67★#★
Normal serum control 41.83±0.17★○ 2.74±0.61○
Vitamin E 39.38±0.40○# 2.59±0.61○
Treatment low dose 42.55±0.57★○ 2.63±0.28○
Treatment high dose 42.17±0.62★○ 2.07±0.28○
★, ○, # and★ value are the same as table 1
3　讨论
　　体内的氧化与还原反应在正常生理情况下保持
着平衡状态 ,体内的氧自由基及抗氧化系统是维持
这一平衡的重要因素 。一旦体内的氧自由基大量产
生或抗氧化系统功能减弱 ,都会导致组织细胞的氧
化损伤 。H2O2 是体内最常见的一种氧自由基 ,在多
种组织损伤中起着关键性作用[ 3] 。脂质过氧化反应
是 H2O2 诱导的细胞膜损伤最为常见的反应之一 ,而
SOD则是体内降解 、清除 H2O2 等自由基的主要抗氧
化酶 。实验中 ,2 mmol·L-1 H2O2 作用于肝细胞后 ,
肝细胞内抗氧化酶 SOD活性明显下降 ,脂质过氧化
产物 MDA和NO量显著增多 ,细胞悬液中 ALT 水平
显著上升 ,这表明 H2O2 引起了肝细胞的氧化损伤 ,
导致肝细胞内ALT 大量释放 。
《福建药物志》上记载:白背叶根可以“清热平肝。
治肝炎 , ……” ,经临床验证确有此疗效。白背叶根中
含熊果酸乙酸酯 、古柯二醇-3-乙酸酯 、β-谷甾醇 、
2β ,29-二羟基羽扇烷等多种成份[ 4] ,可以有效地抑
制多种细菌的生长 ,起到抗炎的作用[ 5] 。但白背叶根
对肝胆系统的作用和机制一直未得到进一步的阐明。
文中实验研究表明 ,白背叶根对H2O2 所致的肝细胞
损伤有明显的抗氧化作用 ,并能提高肝细胞的 SOD
活性 ,降低MDA含量 ,减少NO的生成和氧化作用 ,从
而减轻氧化产物对肝细胞的损害 ,明显降低了肝细胞
悬液中ALT 水平 ,表明白背叶根对H2O2导致的肝细
胞氧化损伤具有一定的保护作用。这些作用可能是
白背叶根治疗急性肝炎的机制之一。
文中实验加入正常血清对照组是为了排除大鼠
血清对实验结果的影响 ,通过对中药治疗组和正常
血清对照组及模型组进行对比 ,可以认为白背叶根
确实具有抗氧化作用 ,能够对H2O2所致的大鼠肝细
胞氧化损伤具有保护作用。中药治疗组与阳性药组
Vit E相比显示:白背叶根更能升高 SOD的活性 ,而
在降低ALT 、MDA和NO方面与Vit E作用效果大致
相同 。本实验不足的地方是白背叶根在降低NO含
量和升高SOD活性时没有显示出剂量效应 ,这是否
是因实验误差所致 ,尚需进一步研究 。
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259第 4期 赵进军 ,等。白背叶根对过氧化氢所致大鼠肝细胞损伤的保护作用