全 文 ：遗 传 学 报 , 1 0 ( 6 ) : 弓2 3一斗2 8 , 1 9 8 3
A `拍 G朋 . t i e . 51 . 应`。
蓖麻蚕核糖体 RN A 基因在
大肠杆菌中的无性繁殖` ’
吴样甫 郑仲承 靳嘉瑞 江福美 储美瑾
钱肖贞 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
用 p BR 32 2 作运载休 , 构建了含有蓖麻蚕核糖体 R N A 荃因 ( rD N A ) 完整重复单位的重组
质粒一 pRA 3 。 p从3 含有 1 1 . I K b r DN A 完整重复单位 ,包含有 p R^ I和 p R^ 2 所烤带 的 r 0 N A
片段。 制作了 p A R 3 和 r D N A 的限制性内切酶图谱。 发现限制酶图谱与郑仲承等报道的一致 ,
而与家蚕的 r D N人 的图谱不同。
前文报道在蓖麻蚕 r D N A 2 . 6M d aB o H I 片段中有 乃d 切点山。 进而郑仲承 的工
作证实了该 r D N A 完整重复单位中仅有一个 凡 ,I 切点山 , 用 乃八 酶切片段可以克隆蓖
麻蚕 r RN A 基因的完整重复单位。
近来研究发现 , r D N A 的非转录顺序 ( N T s) 可能与基因的复制起始和转录调控有
关“ ,l0J 。 但对 r D N A 转录调控区的结构至今仍无完整肯定的认识 。 为研究蓖麻蚕 r RN A
基因的表达调控 ,我们克隆了该基因的完整重复单位 ,制作了基 因的限制酶图谱 。 在此基
础上完成了 rR N A ( 28 5 、 1 85 、 5 . 85 ) 各基因的定位 r叹另文报道 ) , 并 ml 定了非转录顺序
的部分核昔酸顺序 ,转录研究和基因改造研究亦在进行中。
材 料 和 方 法
(一 ) 酶和缓冲液 本工作所用限制酶和连接酶均为我室工具酶组提供。 酶反应
采用 B RL 公司介绍的缓冲液 。
(二 ) 蔑麻蚕 D N A 制备和 r D N A , 集 蓖麻蚕 D N A 制备方法见前文报道川。
r D N A富集 : 染色体 D N A经 P,t l酶切 , 琼脂糖凝胶电泳展开后 , 切下分子量为 10 一
12 K b 位置的凝胶 , 在透析袋中电泳洗脱胶中 D N A 片段 。 经苯酚抽取后 , 用乙醉沉淀
D N A
, 沉淀 冻千 , 溶于少里 50 m泪叮 r is 一 H a ( p H 7 .习 、 1m M E D I , A 缓冲液 中备用 , 富
集的 几d 片段 ,电泳后分子最范围仍为 10 一 12 bK ,再与 ` 2 ,rI RN A作翻 u ht er n 杂交鉴定 “ o]
(三 ) 克隆操作和含 r R N A签因的皿组质粒的谛选 克隆操作同前文报道 1[J 。 体
外重组用 8那 g 富集的 D N A P, I片段 , 0 . 5产 9 tP l 酶切的 p BR 3 2 2 。 由于 几 tI 位点插人外
源基因 ,致使 pBR 32 2 的 A rP 基因失活 , 在抗菌素琼脂上可以选择 A P’ T Cr 菌落〔” 。 然后按
G几. t山 等报道的菌落原位杂交法 81[ ,筛选含 r RN A 基因的重组质校 。
本文于 19 8 2年 6 月 2 2 日收到 。
l) 本工作所用连接酶和限制性内切酶由我室工具酶组提供 , 特此致谢。
遗 传 学 报 1 0 卷
(四 ) 分子杂交操作 oS u th e r n 法分子杂交和 G ur sn et in 等的菌落杂交法的实验操
作均按前文报道的操作进行 〔 1J 。
(五 ) 质粒 D N A 的电子显徽位观案 质粒 D N A 电子显微镜观察采用 D va ivst ]报
道的方 法 制 样 。 样品展开液 为 50 拓甲 酞胺 , 0 . IM rT 认一 H。 ( p H S . 5) , 10 m M E D T A ,
.0 O 5m g /m l 细胞色素 C 。 质拉 D N A 浓度为 1产盯m l。 底相液为 15 多 甲酞胺 , 10 1n M T r is -
H CI ( p H S
.
, )
, l m M E D T A
。 磷钨酸染色。 dP : rI 为 8 : 2。 旋转投影 。
(六 ) 甚因限制酶谧的制作 分离纯化的重组质粒 D N A 经各种限制酶解 , 或二种
酶混合酶解后 , 以 几D N A 的 cE o IR 、 aB o H I 酶切片段的分子量为标准 , 在琼脂糖凝胶电
泳展开后 ,求得各酶切片段的分子量 ,从而制作基因的限制酶图谱。 琼脂糖凝胶电泳方法
见前文报道 1[ 。
结 果
(一 ) 皿组质粒 p A R 3
重组 D N A 经转化后获得 18 2 个 A户 T C r 菌株 。 菌落原 位杂交筛选 得 到一株 与
山 1 r RN A 杂交强阳性菌株 ,定名为 p A R 3。 经 cE oR I 、 aB o H I护 Jd 酶切后电泳展开 ,并作
so ut h er
n 法杂交鉴定。 结果证明 , p A R 3 含有能与 `竹 rR N A 专一性杂交的 : D N A 片段 ,
乃 1 的 1 . I K b 片段是插人的 r D N A 分子 , p B R 3 2 的 tP lt 片段不能与 r RN A 杂交。 图 1
为电泳图谱和相应的 oS ut he m 杂交结果 。
(二 ) 蓖麻蚕 r R N A 甚因限栩酶图
PA R 3 的 cE o R I 、 B o m H I 、 stP l 、 gB l 11、 P u , 1 、 衬动 dl l l 、 月户a l 、 5心1 等限制酶切或双
图 1 p A R 3限制酶切琼脂塘凝胶电泳及相应 oS u ht er n 杂交自显影图
F ig
.
1 c l e a v昭 e aP t t e r n . o f p A R3 w i t h r e s tr i e石o n e n z , an a n d e o r r e , p o n d i n g a u ot r a d i o g r如
af t e r S o u ht e r n h yb ir d i , 山 n w i ht 12 5 r R N ^
1
.
p A R 3 ; 2
.
p A R 3 + 即 I: 3· p A R 3 + B a份 H l :
峪. p A R 3 + cE o见 ; 5 . p A R3 + cE o IR、 B a份 H l。
` 期 昊祥甫等 : 蓖麻蚕核塘体 NR 人 基因在大肠杆菌中的无性繁殖
酶协同酶切图谱见图 2。 由图 2 测量所得各片段分子量列于表 1。 由此确定各种限制酶
在 rD N A 上的切点数和位置 , 以及 r D N A 片段与 p B R 3 2 的连接方向。 以 B a o H I为
例 , PA R 3 经 B a o H I酶切产生 7 . 0 、 4 . 5 、 3 . s K b 三个片段 。 除 p B R 3 2 2 只有一个 已 知的
aB o H I 切点外 , 可以确定另二个切点在 r D N A 上 。 从 PA R Z【1J 酶切图中已知 乃 ,I 将 r D N A
的 4 . 2 K b B a , H l 片段切成 o . 6 K b和 3 . 6bK 二段 。 而 p皿 3 2 2被 乃 rl 、 B a二 H l 酶切产生
3
.
2与 l . I K b二段 , 因此只有 r D N A 的 0 . 6 K b 几 ,I 一 aB o H I 片段与 p B R 3 2 2 的 3 . 2 K b乃 tl -
aB m H I 片段相连接才是合理的连接方向和切点分布 。 其他限制酶的定位也按类似方法
狡 1 , 姐段位 p A 3R 和 p A R Z限翻性内切阵切 . 片段大小 ( K b )
T
.目 e 1 T a bl e o f r e s t r i c t io f r呀 x n e n t s i z e o f p ^ R 3 a n d p A ZR
片段大小、 、 ( f r a g m e n t
P A R 3
.…出,je`J内月、一飞一,ù
20J口代少qUǐ1ù曰、才ZJ任n,j
.……dJ`,魂j点,门J内`.!,les.`.reses月t卫,ǎ`Ul、2`成OUQ工J. ..二,了勺/月月.…口.,`月/护61了才`U月峪.,O产.、J勺ō、夕一J1人,月二. .召卫且P了t lB a 用H lB a 那 H l + 尸璐 IF c o孙
cE
o RI + B a份H l
E ` o RI + sP t l
死 111 + 尸“ 1
S a l l
S a l l + P洲 I
H P
a l
H P
a l + 尸,沼1
月矛n dl l l
P 夕一` 11
p A R Z
一
,`门/. .几自
.…d月八,肉j一`J
ōj,自护O沪,白JZ
:…Qé通.斑呢ùJ,口UE c o R IB口份H l尸对 1
B a份 H l + 尸招 1
B g l l l + B a协 H l
衬 P a l
确定 。 刀g宕n 在 r D N A 上有四个切点 。 由 PA R Z 的 aB o H I诏 g才n 双酶切片段分析 , p A丑 2
上有二个间隔为 。 . 38 bK 的 刀g Zn 切点 , 靠近 aB m H I 切点的 介才n 切点距 aB m H I的距离应
为 0 .斗K bo PA R3 的 P,t l一刀岁 11双酶切片段分别为 : 4 . 5、 4 . 3、 2 . 6、 2 . 4、 0 . 7、 o . 4 K b。 由于
PBR 32 2上没有 刀 g才n 切点 , 而 乃 tI 切点为二个 D N A 分子的连接点 , 因此 .0 7bK 应为
rD N A 上另外二个 兔1 切点的距离 。 由此可以定位 死了n 在 r D N A 完整重复单位中的
切点位置 , 为进一步验证死 ln 的酶切位点我们发展了一种新的分析基因限制酶图谱的方
法— 末端片段杂交法 , 进一步确定了 B砂n 的酶切位点 (详见另文报道 )【,ol
遗 传 1 0 卷
10 1 1
k b
1 6
.
3 e
8
.少一
J
. 冬-
; !卜
图 2 p A R 3限制性内切酶切琼脂塘凝胶电泳图谱
F ig
.
2 C l e a v a g e p a t et r n s o f p A R 3
A
.
1
.
p A R 3 + E c o R I + B a用 H I : 2 . p A R 3 + cE o IR : 3
.
p A R 3 + B a份 IH 了
呼. p ^ R 3 + H i” d l l l + 几 t l : 5 . p A R 3 + 价” d l l : 6 . p A R 3 + E c o 即 + rtP l :
7
.
p A R 3 + B a m H I + P,t l ; 8
.
p A R 3 + 尸“ I: 9 . p A R3 + B g l l l + tP l :
1 0
.
p A R 3 + Bg ll l + B a份 H I: 1 1 . p A R 3 + P夕 lu
.
B
.
1
.
p A R3 + s J左 + iH川川 : 2 . p A R 3 + S` 1 + .P, I: 3 . p A R3 + s夕打。
C
.
1
.
p A R3 + H P a l : 2
.
p A R 3 + H P
a l + 几月 。
气 图 3 为 PA R 3的 限 制 酶 图谱 , 图 4 为r D N A 完整重复单位的限制酶 图谱 。
iH耐 111、 p , u n 在 r D N A 上没有切点 。
(三 ) 电子显徽镜观察
图 5 为 PA R 3的 电子显微镜照片。
日` 娜印
图 3
F i g
.
3 R e s
p A R 3限制性内切酶图
tr i e it o n am
P o f Pl as m id p A R 3
讨 论
1
. 由于蓖麻蚕 : D N A 完整 重 复 单 位 的
分子量较大 , 用散弹法克隆 , 效率较低 , 我们
采用了琼脂糖凝 胶 电 泳 法富集 : D N A 几 ,I
片段 , 用于克隆试验 ,获得较好的效果 。
2
.
PA R 3 酶切图谱和 oS u ht e r n 法分子 杂
交证明被克隆的 r D N A P,t l 片段的 分 子 量
为 1 . I K b, 这与郑仲承等山报道的一致 。 由
于 乃 ,I 切点是在 r D N A 内部的 , 重复单位又仅有一个 乃 tI 切点【刀 , 因此应该认为被克隆
的 1 . 1 K b乃 ,I 片段包含一个完整的重复单位 。 PA R I 、 p A R Z 所含 r D N A 片段 都 能 在
` 期 吴祥甫等 : 蓖麻蚕核搪体 R N A 基因在大肠杆菌中的无性繁殖
l工妥日
( kb )
图 4 蓖麻蚕 r R N A 基因的限制性内切醉图
iF ` . 咤 Re 一t i e d o n ma p o f r i bo s o arn l R N A g e 几 e f r o m s i lk w o r m 通“州 t f 蕊`耐
PA 3R 中找到。
3
.
p AR 3 的限制酶图谱及由它绘制的 r D N A 限制酶图谱与 M公 n坛梦, 1 等报道的家蚕
rD N A 限制酶图有明显不同 ,不仅在各种限制酶切位点分布上有差别 , 而且在切点数和有
无切点上都不相同 ,但与郑仲承报道的蓖麻蚕限制酶图谱完全一致 。
在了解 r D N A 限制酶切图谱基础上 , 我们分别把 r D N A 各限制酶切片段组建了次
级克隆 , 这有利于 285 , 1 85 , 5 ` 85 r RN人 基因的定位 、 D N A 核昔酸顺序侧定和转录调控
结构的研究 。
图 弓 p A R 3 电子显微镜照片 (右下角为 p B R 32 2 )
F ig
.
5
参
E l e e tr o n m i
e r o ` ar p h o f p A R 3
考 文 献
奥祥 , 娜 : 19 52 ,生物化学生物物理学报 , l呼( 3 ) : 2 8 7。
郑仲承等 : 19 8 1 ,遗传学报 , 8 ( 3 ) : 2 0 3.
郑仲承等 : 19 83 , 遗传学报 , 1欠 5) : 3 3 3一 3峪0 -
吴祥甫等 : 1 98 3 , 遗传学报 , 10 ( 5 ) : 32 9一 3 3 2 .
B o il
, a r , r
. 眺 al . : 1 9 7 7 G林 e , 2 : 9 5 .
B帕 el 盯 , P . e t al . : 1牙7 9 . 伪了忍, 1 7 : 1 9 .
D a , 1
5 , R
.
W
.
: 1 9 7 1
. 万 e场。面 伽 刀朋夕饥。乙o g y , I : P ar t D , 4 13 .
G r u n s et in
,
M
.
a n d D
.
8
.
H o g n e s s : 1 9 7 5
. 八 0 0 . N a 正云. A e a d S d . U . 8 . 通 . , 7公: 肠6 L
M an n in g
,
R
.
r
.
e t a l
.
: 1 9 7 8
. 口e件 e , 生 : 1 5 3 .
R皿 g g o r , D . e t al . : 1 9 7 9 . J丫。 e . N a l t , A e a ,才. 5成 . U . B . 通 . , 7 6 : 3 9 5 7.
日劝u施 e r n , E . M . : 1 9 7 5 . J . 肚 o l . B该。王. , 98 : 5 0 3 .
23[1[以56[口s佃l0[l1[
弓2 8 遗 传 学 报 1 0 卷
C l o n i n g o f T he R ibO . m
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