全 文 ：第 42 卷 第 1 期
2 0 1 5 年 3 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol. 42 No. 1
Mar.，2 0 1 5
doi:10． 13428 / j． cnki． fjlk． 2015． 01． 015
福建山樱花总 ＲNA提取方法比较分析
荣俊冬1，张迎辉2，薛艺敏2，王珍添2，陈凌艳2，郑郁善1，2
(1. 福建农林大学林学院，福建 福州 350002;2. 福建农林大学园林学院，福建 福州 350002 )
摘要:以福建山樱花嫩叶为试验材料，采用 Trizol法、CTAB法、CTAB － LiCl 法、百泰克试剂盒法和天根试剂盒法 5 种方法
提取福建山樱花叶片 ＲNA，用琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲNA的完整性，以微量紫外分光系统检测总 ＲNA的纯度和浓度。结
果表明:Trizol法和天根试剂盒法不适于福建山樱花叶片 ＲNA 的提取;CTAB 法和百泰克试剂盒法提取的 ＲNA 完整性好，
纯度及浓度高，但百泰克试剂盒法提取的 ＲNA有 DNA污染;CTAB － LiCl法提取的 ＲNA浓度低，且含杂质。ＲT － PCＲ试验
结果进一步表明 CTAB法提取的 ＲNA能够用于后续的分子生物学研究，是福建山樱花叶片 ＲNA提取的最佳方法。
关键词:福建山樱花;总 ＲNA;提取方法
中图分类号:S685. 99;Q522 文献标识码:A 文章编号:1002 － 7351(2015)01 － 0073 － 04
Comparison Study of Different Methods for total ＲNA Isolation from Prunus campanulata Maxim.
ＲONG Jun-dong1，ZHANG Ying-hui2，Xue Yi-min2，WANG Zhen-tian2，CHEN Ling-yan2，ZHENG Yu-shan1，2
(1. College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，Fujian，China;
2. College of Landscape Architecture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，Fujian，China)
Abstract:The performances of five extraction methods of total ＲNA which contain Trizol method，CTAB method，CTAB-LiCl method，
Bio Teke ＲNApure Total ＲNA Plant kit and TIANGEN ＲNAprep Pure Plant Kit from Prunus campanulata Maxim. were compared in
this research. The intrgrity of ＲNA were tested by agarose gel electrophoresis，the yields and quality of ＲNA were tested by micro ul-
traviolet spectrophotometer. It showed that both of Trizol method and TIANGEN ＲNAprep Pure Plant Kit weren’t suitable for total
ＲNA isolation from leaves of P. campanulata. The CTAB and Bio Teke ＲNApure Total ＲNA Plant kit method could provide a high in-
tegrity and high yields total ＲNA，but there were traces of DNA pollution with Bio Teke ＲNApure Total ＲNA Plant kit. A lower total
ＲNA yield and degradeted 18s ＲNA on gel electrophoresis were found in CTAB-LiCl method. ＲT-PCＲ amplification also showed that
the quality of ＲNA isolated from CTAB method can meet the demands of molecular biology experiments.
Key words:Prunus campanulata;total ＲNA;extraction methods
福建山樱花(Prunus campanulata Maxim. )为蔷薇科樱属落叶乔木，花呈钟状下垂开展，颜色浓艳，花
期早，每年春节前后开花，花期长达 50 d，极具观赏价值［1］;且抗逆性强，适应性广，为园林绿化中不可多
得的优良乡土观赏植物［2］。目前对福建山樱花及其近缘种的研究多集中在群落学特征、开花生物学、种
源遗传多样性，以及引种适应区、繁殖技术、观赏性评价等方面［3］。而关于福建山樱花的分子生物学研究
则鲜见报道。从分子水平研究基因变化，进行基因调控和定向分子育种，繁殖和培育出符合人们要求的优
良品种，是福建山樱花今后研究的重要内容。高质量的 ＲNA是 Northern 杂交、cDNA 文库构建、基因表达
分析等分子生物学研究的前提和基础。由于植物组织化学成分的差异，不同植物提取 ＲNA的方法也不尽
相同，关于提取植物 ＲNA的文献很多［4 － 8］，但福建山樱花 ＲNA 的提取尚未见报道。本文对 CTAB、CTAB
－ LiCl、Trizol、百泰克试剂盒、天根试剂盒 5 种方法提取的 ＲNA 进行比较分析，找出适合提取福建山樱花
ＲNA的方法，为后续研究奠定基础。
收稿日期:2014 － 03 － 03;修回日期:2014 － 04 － 25
基金项目:福建省科技重大专项专题基金(2007SZ0001 － 8)
作者简介:荣俊冬(1979—)，男，山东文登人，福建农林大学林学院助理研究员，从事森林培育研究。E-mail:rongjd@
126. com。
通讯作者:郑郁善(1960—)，男，福建永泰人，福建农林大学教授，博士生导师，从事森林培育研究。E-mail:zys1960@
163. com。
福 建 林 业 科 技 第 42 卷
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为 1 年生盆栽福建山樱花嫩叶，现采现用，由福建农林大学工业原料林研究所提供。
1. 2 ＲNA提取方法
1. 2. 1 Trizol法 嫩叶 0. 1 g加液氮研磨，转入 1 mL预冷的 Trizol提取液中，涡旋震荡 2 min;4 ℃、12000
r·min －1 离心 10 min，吸取上清液;15 ～ 30 ℃下静置 5 min，加氯仿 200 μL，4 ℃、12000 r·min －1离心 15
min，取上清液(此步骤重复 1 次);上清液加异丙醇 500 μL，颠倒混匀，15 ～ 30 ℃静置 10 min，4 ℃、12000
r·min －1离心 10 min，弃上清液，留沉淀;加 75%乙醇 1 mL悬浮沉淀，4 ℃、7500 r·min －1离心 5 min;干燥
沉淀，用预热的 ＲNase-free水溶解沉淀，－ 70 ℃保存备用。
1. 2. 2 CTAB法 嫩叶 0. 1 g加 PVP液氮研磨，转入预热的 CTAB 缓冲液 1 mL(2% CTAB + 100 mmol·
L －1 Tris-HCl + 25 mmol·L －1 EDTA +2 mol·L －1 NaCl + 0. 5 g·L －1亚精胺 + 2% PVP + 3% 巯基乙醇)5
min混匀 1 次;4 ℃、12000 r·min －1离心 15 min，转移上清液至新离心管中，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇
(25∶24∶1)，上下颠倒混匀 5 min;4 ℃、12000 r·min －1离心 10 min，转移上清液至新离心管，加等体积氯仿
抽提混匀，冰浴 5 min;4 ℃、12000 r·min －1离心 10 min，转移上清液至新离心管，加 2 倍体积预冷的无水
乙醇，上下颠倒混匀，－ 20 ℃沉淀 2 h;4 ℃、12000 r·min －1离心 15 min，弃上清液，用 75%乙醇洗涤沉淀;
4 ℃、10000 r·min －1离心 10 min，弃上清液，干燥沉淀，用预热的 ＲNase-free 水溶解沉淀，－ 70 ℃保存备
用。
1. 2. 3 CTAB-LiCl法 嫩叶 0. 15 g加 PVP液氮研磨，转入预热的 CTAB缓冲液 1 mL，剧烈震荡混匀 30 s，
65 ℃水浴 15 min，每隔 2 ～ 3 min混匀 1 次;加氯仿 0. 4 mL，振荡 10 min使其乳化，4 ℃、10000 r·min －1离
心 10 min;取上清液于新离心管中(重复上述操作 1 次);取上清液于新离心管，加 1 /4 体积的 LiCl(10
mol·L －1)，4 ℃过夜(至少 6 h);4 ℃、10000 r·min －1离心 15 min，弃上清液，加入 250 μL ＲNase-free水溶
解沉淀;加等体积的氯仿抽提 2 次;加 2 倍体积的无水乙醇，－ 20 ℃放置 2 h;4 ℃、10000 r·min －1离心 15
min，吹干沉淀 10 min，ＲNase-free水溶解，－ 70 ℃保存备用。
1. 2. 4 百泰克试剂盒法 依照北京百泰克公司通用植物总 ＲNA提取试剂盒(ＲP3301)说明书步骤进行。
1. 2. 5 天根试剂盒法 依照北京天根公司 ＲNAprep Pure植物总 ＲNA提取试剂盒(DP432)说明书步骤进
行。
1. 3 ＲNA质量、纯度检测
取 ＲNA提取液 1 ～ 2 μL，加 4 μL ＲNase-free水稀释，以 1. 5 μL 溴酚蓝染液染色，共 7 ～ 8 μL 点样电
泳。电泳琼脂糖质量分数为 1. 2%，电压 150 V，时间 20 min。电泳完毕，在凝胶成像系统下观察 ＲNA 的
完整性。取 ＲNA提取液 1 μL，以 NanoDrop 2000c微量紫外分光系统进行浓度及纯度检测，记录所得 ＲNA
的浓度，OD260 /OD280、OD260 /OD230值。
1. 4 ＲT-PCＲ检测
参照 Clontech公司的说明书对提取的 ＲNA进行反转录及双链合成，取第一链 2 μL作为模板，反应条
件为 95 ℃、1 min;95 ℃、15 s，65 ℃、30 s，68 ℃、6 min，18 个循环;4 ℃结束反应。取 PCＲ产物 3 μL用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2. 1 总 ＲNA的纯度与质量浓度
以溶解 ＲNA相应的 DEPC水作空白对照进行调零，在 NanoDrop 2003c 上测得 ＲNA 质量浓度及纯度
(表 1)。
纯 ＲNA 的 OD260 /OD280值为 2. 0，当 OD260 /OD280 ＜ 1. 8 时，表明蛋白质或其它有机物的污染比较明显;
当 OD260 /OD280 ＞ 2. 2 时，说明 ＲNA 已经水解成单核苷酸了。一般 OD260 /OD280值在 1. 8 ～ 2. 1 之间。
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第 1 期 荣俊冬，等:福建山樱花总 ＲNA提取方法比较分析
OD260 /OD230值若小于 1. 6，表明 ＲNA 有盐类等杂质的干扰;OD260 /OD230大于 1. 6，ＲNA 纯度较好。由表 1
可知，CTAB法、CTAB-LiCl法和百泰克试剂盒法提取的 ＲNA的纯度均符合要求，但 CTAB-LiCl法 ＲNA质
量浓度较低。Trizol法和天根试剂盒法提取的 ＲNA，OD260 /OD280、OD260 /OD230值极低，蛋白和盐分残留严
重，不适用于福建山樱花 ＲNA的提取。
2. 2 总 ＲNA的质量
将 5 种方法提取的福建山樱花总 ＲNA
进行琼脂糖凝胶电泳，只有 CTAB 法、
CTAB-LiCl 法和百泰克试剂盒法提取的
ＲNA电泳有条带出现，而 Trizol 法和天根
试剂盒法提取的 ＲNA 未出现条带。CTAB
法提取的 ＲNA，其 28 s 条带的亮度几乎是
18 s条带亮度的2倍，且几乎没有降解及
表 1 不同方法提取的 ＲNA纯度、质量浓度
方法
质量浓度 /
(ng·μL －1)
OD260 /OD280 OD260 /OD230
Trizol法 171. 8 0. 99 0. 41
CTAB法 328. 8 2. 03 1. 79
CTAB-LiCl法 122. 3 2. 08 2. 14
百泰克试剂盒法 589. 2 2. 10 2. 33
天根试剂盒法 16. 9 1. 25 0. 05
DNA的污染，提取效果好(图 1A);CTAB-LiCl法提取的 ＲNA电泳条带略暗，18 s处条带不够清晰，说明含
有少量杂质，由于 LiCl主要是沉淀大分子 ＲNA，因而 5 s条带不明显(图 1B);百泰克试剂盒法提取 ＲNA，
电泳条带清晰，几乎无降解，但 DNA污染比较明显(图 1C)，如果要进行下一步实验，必须先用 DNase进行
处理。
图 1 不同方法提取的 ＲNA电泳图 图 2 ＲT-PCＲ产物 cDNA电泳结果
2. 3 3 种福建山樱花总 ＲNA提取方法优缺点比较
3 种福建山樱花总 ＲNA提取方法的优缺点见表 2。CTAB法提取的 ＲNA能够满足后续分子生物学实
验的要求，但需时较长，步骤繁琐，试剂毒性大，操作时需要加倍小心;百泰克通用植物总 ＲNA提取试剂盒
若能充分去除 DNA 的干扰，也能达到预期目的，而且操作时间短，仅需 30 min 就能完成，但费用较高;
CTAB-LiCl法操作时间最长，ＲNA浓度低且含有少量杂质，尽管可以通过加大样品量和细心操作来解决，
但不建议使用。
表 2 3 种 ＲNA提取方法的优缺点
提取方法 操作繁简 操作时间 /h 纯度 产量 费用 试剂毒性
CTAB法 繁多 ≈3. 5 较高 高 低 大
CTAB-LiCl法 繁多 ＞ 10 高 低 低 大
百泰克试剂盒法 简单 ≈0. 5 高 高 高 小
2. 4 ＲT-PCＲ分析
对 CTAB法提取的 ＲNA使用 In-Fusion SMAＲT cDNA文库构建试剂盒进行 cDNA 合成。从扩增结果
(图 2)可以看出，扩增得到的双链 cDNA片段大小的分布范围是 0. 2 ～ 3 kb，大部分片段主要集中在 0. 4 ～
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福 建 林 业 科 技 第 42 卷
1. 5 kb之间，表明 CTAB法提取的 ＲNA可以用于后续的分子生物学研究。
3 结论与讨论
Trizol法简单方便，耗时较短，许多植物用 Trizol 法成功提取了 ＲNA［9 － 10］，但此法不适合福建山樱花
ＲNA的提取，可能是因为福建山樱花叶片多糖、多酚、次生代谢物质含量较高，Trizol 类方法无法防止多糖
多酚对 ＲNA /DNA分相的干扰，会残留大量多糖、多酚或其他次级代谢产物。前人的研究结果也证实了
Trizol法不适用于次生代谢物质多的植物［11 － 13］。天根试剂盒法的裂解液主要成分是异硫氰酸胍，是用胍
盐促使核糖核酸酶变性而抑制其活性，从试验结果看，天根试剂盒法与 Trizol 法一样无法成功提取出
ＲNA。
CTAB是一种强变性剂，被广泛应用于植物核酸提取，也被认为是适用于多糖、多酚类植物 ＲNA 提取
的方法［14 － 16］，福建山樱花的同科植物苹果、桃、紫叶李等通过用改良的 CTAB 法均成功获得了高质量的
ＲNA［17 － 19］。在 CTAB法中协同使用了 PVP和 β-巯基乙醇，PVP作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结
合酚的能力，β-巯基乙醇作为强还原剂也能防止多酚的氧化，二者协同作用有效抑制了酚类物质对 ＲNA
提取的影响［20］;提取缓冲液中的亚精胺可以抑制核糖核酸酶的活性。提取过程中使用酚、氯仿、异戊醇的
抽提液结合长时间高速离心可以有效抽提去除蛋白质，再加入氯仿溶解脂肪并通过低速离心去除有机相
从而去除脂肪。CTAB法耗时相对百泰克试剂盒法较长，但经济实用。
CTAB-LiCl法抽提步骤多，时间长，对于 LiCl沉淀过后的产物仍需要用氯仿进行 2 次处理，2 次沉淀，
ＲNA很容易经多次抽提后损失殆尽，总的得率不高且降解度很大，不利于下一步试验的进行。
百泰克试剂盒法是一种专门用于 ＲNA提取的试剂盒，采用柱式纯化的方式进行，操作简便快捷，提取
的 ＲNA的浓度、完整性均较高，但有 DNA污染，若要获得高纯度的 ＲNA，还需加入 DNase 处理，与 CTAB
法相比，成本较高。
综合 ＲNA的纯度、产量及经济方面考虑，CTAB法为福建山樱花叶片 ＲNA提取的最佳方法，因此可采
用 CTAB法所提总 ＲNA进行后续的逆转录试验。
参考文献:
［1］陈璋，吕月良，吴文心 . 福建山樱花观赏特征与开花生物学特性的初步研究［J］. 福建热作科技，2011，36(3):1 － 5.
［2］吕月良，陈璋，施季森 . 福建山樱花研究现状、开发前景与育种策略［J］. 南京林业大学学报:自然科学版，2006，30(1):
115 － 119.
［3］陈璋，吕月良 . 福建山樱花及其近缘物种研究现状与开发利用［J］. 福建热作科技，2007，32(1):32 － 35.
［4］董宁光，高英，裴东 . 核桃子叶 ＲNA 提取方法的研究［J］. 北京林业大学学报，2011，33(6):98 － 101.
［5］尤超，赵大球，梁乘榜，等 . 银杏叶片 ＲNA 提取方法的研究［J］. 中国农学通报，2011，27(19):23 － 27.
［6］Gehrig，H.，K. Winter，J. Cushman，et al. An improved ＲNA isolation method for succulent plant species rich in polyphenols and
polysaccharides［J］. Plant Molecular Biology Ｒeporter，2000，18(4):369 － 376.
［7］Yingru Wu. ，D. J. Llewellyn，E. S. Dennis. A quick and easy method for isolating good-quality ＲNA from cotton (Gossypium hir-
sutum L.)tissues［J］. Plant Molecular Biology Ｒeporter，2002，20(3):213 － 218.
［8］F. Geuna，H. Hartings，A. Scienza. A new method for rapid extraction of high quality ＲNA from recalcitrant tissues of grapevine
［J］. Plant Molecular Biology Ｒeporter，1998，16(1):61 － 67.
［9］李晓颖，曹雪，房经贵，等 . 杏叶片与果实总 ＲNA提取方法研究［J］. 中国农学通报，2010，26(2):152 － 156.
［10］魏鑫，李玥莹，关尔鑫 . 甜高粱总 ＲNA提取方法的比较研究［J］. 江苏农业科学，2011，39(3):45 － 47.
［11］Evi Kiefer，Werner Heller，Dieter Ernst. A simple and efficient protocol for isolation of functional ＲNA from plant tissues rich in
secondary metabolites［J］. Plant Molecular Biology Ｒeporter，2000，18(1):33 － 39.
［12］Elizabeth A. Ｒ. Tattersall，Ali Ergul，Fadi Alkayal，et al. Comparison of methods for isolating high － quality ＲNA from leaves of
grapevine［J］. American Journal of Enology and Viticulture，2005，56(4):400 － 406.
［13］王宇，李玲，王慧，等 . 两种桃芽总 ＲNA提取方法的比较研究［J］. 山东农业大学学报:自然科学版，2011(3):388 － 391.
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第 1 期 连细春:红豆树与杉木次生林混交试验
1. 72%、5 个分杈的株数频率为 1. 37%、4 个分杈的株数频率为 4. 29%、3 个分杈的株数频率为 8. 92%、2
个分杈的株数频率为 24. 53%、1 个分杈的株数频率为 32. 76%、主干通直的株数频率为 26. 24%。其中，
林缘木全部出现树体主干的低位分杈，分杈的平均高度 0. 3 m、平均分杈数 4. 1 个·株 － 1。红豆树具有较
强的分杈能力，主要源于其生物学特性，受周边环境影响效应较小，培育红豆树主干应依靠人工修枝除萌
措施。
4 小结与讨论
1)6 年生红豆树杉木混交林中，红豆树已成为被压木，随着杉木混交比例增大，红豆树被杉木挤压的
效应更突出，原因是由于杉木是速生树种，而红豆树是慢生树种。6 年生杉木与红豆树已经产生较为明显
的生长环境空间的竞争，需要及时调整混交林的密度结构和树种组成比例，否则，红豆树便沦为杉木的伴
生树种，背离了红豆树为栽培目标的初衷。
2)不同混交比例林分对红豆树主干分枝数、高径比、枝下高与全高比等干形生长指标的影响作用微
弱，表明红豆树较强的分杈能力主要源于其生物学特性，其立木自然整枝受周边环境影响效应较小，培育
红豆树主干应依靠人工修枝除萌措施。
参考文献:
［1］王金盾 . 红豆树杉木混交林生长效果分析［J］. 福建林业科技，2001，28(1):51 － 53.
［2］林文龙 . 杉木鄂西红豆树混交林分结构与生产力研究［J］．林业科技开发，2002，16(1):21 － 23.
［3］郑双全 . 红豆树在混交林(红豆 ×杉木)中的生长规律研究［J］. 福建林业科技，2000，27(4):28 － 30.
［4］翁金粦 . 红豆树、杉木不同混交比例造林方式的效果研究［J］. 安徽农学通报，2008，14(19):157 － 159.
［5］许友承 . 鄂西红豆树伴生树种选择试验结果初报［J］. 安徽农学通报，2012，18(17):140 － 142.
［6］周善森，刘伟，袁位高，等 . 不同立地条件下红豆树容器苗与裸根苗造林对比试验［J］. 浙江林业科技，2012，32(1):
34 － 38.
［7］郑天汉 . 红豆树立木的主要性状特征研究(Ⅰ)［J］. 林业科技开发，2008，22(6):40 － 43.
［8］郑天汉，李建英，黄兴发 . 红豆树立木的主要性状特征研究(Ⅱ)［J］. 林业科技开发，2009，23(1):68 － 71.
(上接第 76 页)
［14］Xuchu Wang，Weimin Tian，Yinxin Li. Development of an efficient protocol of ＲNA isolation from recalcitrant tree tissues［J］.
Molecular biotechnology，2008，38(1):57 － 64.
［15］Tao Wang，Nianhui Zhang，Lingfang Du. Isolation of ＲNA of high quality and yield from Ginkgo biloba leaves［J］. Biotechnolo-
gy Letters，2005，27(9):629 － 633.
［16］葛晓萍，石琰瑕 . 一种适合富含多糖、多酚植物的 ＲNA 提取方法［J］. 青岛科技大学学报 :自然科学版，2007，28(1):
6 － 8.
［17］K. Gasic，A. Hernandez，S. S. Kroban. ＲNA extraction from different apple tissues rich in polyphenols and polysaccharides for
cDNA library construction［J］. Plant Molecular Biology Ｒeporter，2004，22(4):437 － 438.
［18］Zhaoguo Tong，Shenchun Qu，Jiyu Zhang，et al. A Modified Protocol for ＲNA extraction from different peach tissues suitable for
gene isolation and Ｒeal-Time PCＲ analysis［J］. Molecular biotechnology，2012，50(3):229 － 236.
［19］史宝胜，卓丽环 . 紫叶李叶片总 ＲNA 提取方法的改进与比较［J］. 分子植物育种，2006，4(5):721 － 725.
［20］张燕梅，周文钊，李俊峰 . 剑麻不同组织 ＲNA 提取方法比较分析［J］. 分子植物育种，2010，8(1):201 － 208.
·97·